Method Article

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

DOI:

10.3791/57065

⸱

February 16th, 2018

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב במוח, הם המגיבים הראשונים כדי דלקת או פגיעה במערכת העצבים המרכזית. מחקר שנערך לאחרונה גילה מיקרוגלייה דינאמיות, מסוגל בהנחה פנוטיפים הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. M1 (פרו-דלקתיים) והן M2 (pro-תיקוני) פנוטיפים לשחק תפקיד חשוב neuroinflammatory מצבים כגון פגיעה מוחית הלידה, נספח שונות פונקציות בתגובה לגירויים סביבתיים מסוימים. מודולציה של הפעלת microglial נרשמה להיוועץ neuroprotection ובכך רומז מיקרוגלייה ייתכן הפוטנציאל הטיפולי של פגיעה מוחית. עם זאת, מחקר נוסף נדרש כדי להבין טוב יותר את התפקיד של מיקרוגלייה במחלה, פרוטוקול זה מאפשר את זה. הפרוטוקול המתואר להלן משלב תהליך צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות להפחתת פסולת הסלולר, עם הפרדה מגנטית, הפקת מדגם מאוד טהור של תאים microglial העיקרי שיכול לשמש לניסויים בתוך חוץ גופית , בלי הצורך 2-3 שבועות culturing. בנוסף, השלבים אפיון תשואות פונקציונלי נתונים אודות מיקרוגלייה, מחקרים לשיפור ההבנה שלנו של קיטוב וסיוע הטרמה של תאים אלה, אשר יש השלכות חזק בתחום של רפואה רגנרטיבית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נזק רכשה במהלך תקופת הלידה דלקת, מחוסר חמצן-ischaemia, דימום יכול להיות מערך של sequelae לטווח ארוך. הפתופיזיולוגיה המורכבת של פגיעה מוחית הלידה הוא משוער לערב דלקת ו איסכמיה עם מוות עצביים עצב שהתפתח1. התגובה החיסונית מולדת ממלא תפקיד חשוב בהמפל של האירועים שהובילו פגיעה2.

מיקרוגלייה, תושב תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), הם המגיבים הראשונים פציעה3. מיקרוגלייה הם סוגי תאים פלסטיק עם היכולת להיות תלויי מגן או רעיל, על הסביבה4. הם מעורבים כימוטקסיס, phagocytosis, מצגת אנטיגן וייצור של ציטוקינים ו4,ש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליכים הבאים אושרו על ידי ועדת האתיקה חיה ב אוניברסיטת מונש. בריאה neonate טיפול C57Bl6/J P3-6 עכברים שימשו כדי להפיק את התוצאות נציג.

1. עיכול אנזימטי

הערה: חשוב לשקול עקרות כאשר בידוד culturing ראשי תאים. תוך הקפדה שהסביבה הוא סטרילי ככל האפשר, הקרע הראשוני ואת הקציר של המוח מאתר יכולה להסתיים מחוץ ברדס זרימה laminal, עם כל והשלבים מבוצעים תא למינארי.

  1. באמצעות מכשירים סטריליים, המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם, לערוף את החיה, לשטוף עם 100% אתנול. בעזרת מספריים קטנות סטרילי, לבצע חתכים קטנים לאורך צד ימין ועל שמאל של הראש. בגיל הזה, העור קליפות משם בקלות. באמצעות קצות המלקחיים מעוקל, החלק בעדינות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות השיטות המתוארות כאן, אוכלוסיות טהור של מיקרוגלייה ניתן לבודד והוא יכול להיות מוכן אפיון באמצעות במבחנה וניתוח FACS. כדי להתחיל עם, עד 18 בעלי חיים יכולים לשמש לכל cull, עם התשואה הצפויה של-450,000-600,000 microglial תאים. זה חיוני לאשר תחילה את הטוהר של תאים מבודדים, לעשות ניתוח FACS בוצע על ידי צביעת עבור שני הסמנים CD45 ו- CD11b. זיהוי של מיקרוגלייה יכול להוכיח בעייתי, כמו סמנים רבים לידי מיקרוגלייה מתבטאים גם על ידי מקרופאגים, ושימוש של שני סמנים אלה מאפשר כימות מדויק .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגלייה יש את היכולת להיות גם פרו - דלקתי, ששונו על-ידי סביבת גירויים. מחקרים קודמים הראו שמודולציה של הפעלת מיקרוגלייה יכול להתייעץ neuroprotection. היכולת שלהם לספק הגנה את הנוירונים ותיקון פציעה מחייבת מחקר נוסף כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של תאים מורכבים אלה. לכן, בידוד של טוהר גבוהה מיקרוגלייה העיקרי הוא שיטת חשוב ושימושי. זוהי שיטה מהירה יחסית להשגת מיקרוגלייה הראשי מאוד טהור מוכן ניסויים במבחנה בתוך 2 ימי.

ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של ראשי מיקרוגלייה מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, גלוקוז נמוך, פירובטGibco11885084
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X)Gibco15240062
DNaseI דרגה II מלבלב בקרSigma-Aldrich10104159001
פפאין מלטקס פפאיה, תמיסה חוצצתSigma-AldrichP3125-100mg
סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחוםGibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (1X)Gibco14175-103
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (10X)Gibco14185052
EasySep Mouse CD11b ערכת בחירה חיוביתStemCell Technologies18770גרסת
מגנט EasySepמגנט EasySepStemCell Technologies18000
EasySep BufferStemCell Technologies20144
Dulbecco's Phosphate buffered SaltSalt Gibco14040182
Trypsin (2.5%) (10X)Gibco15090-046
חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16 / CD32 (עכבר BD Fc Block ™)BD Biosciences553141
Falcon 5 מ"ל מבחנה PP עם בהירות גבוהה עם תחתית עגולה, עם מכסה הצמד,352063קורנינג
175 ס"מ ו-2; בקבוק תרבית תאי צוואר זוויתי עם מכסה אוורורקורנינג431080
ליפופוליסכרידים מבית Escherichia coli O127:B8Sigma-AldrichL5024
96 בארות מיקרו-פלטות מטופלות TC בגודל 96 בארות, שקופות, פוליסטירן, קורנינג תחתון עגולCLS3799
פרפורמלדהיד (אבקה, 95%)סיגמא-אולדריץ'158127
טריטון-Xסיגמא-אולדריץ'X100
ארנב אנטי-IBA1Wako01919741 
עיזים נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS נוגדנים><חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי
V450,חולדה,נגד עכבר,CD45,30-F11,RUOBD Biosciences560501
PerCP-CY5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red E. coli BioParticles ConjugateThermo FisherScientific P35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
תמיסת יודיד פרופודיוםMiltenyi Biotech130-093-233
סטרילי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia IsolationDensity Gradient CentrifugationMagnetic SeparationPrimary MicrogliaPercoll GradientCell CountingTrypan Blue StainingCD11b LabelingHemocytometer AnalysisPercoll Layering

Related Articles