פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב במוח, הם המגיבים הראשונים כדי דלקת או פגיעה במערכת העצבים המרכזית. מחקר שנערך לאחרונה גילה מיקרוגלייה דינאמיות, מסוגל בהנחה פנוטיפים הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. M1 (פרו-דלקתיים) והן M2 (pro-תיקוני) פנוטיפים לשחק תפקיד חשוב neuroinflammatory מצבים כגון פגיעה מוחית הלידה, נספח שונות פונקציות בתגובה לגירויים סביבתיים מסוימים. מודולציה של הפעלת microglial נרשמה להיוועץ neuroprotection ובכך רומז מיקרוגלייה ייתכן הפוטנציאל הטיפולי של פגיעה מוחית. עם זאת, מחקר נוסף נדרש כדי להבין טוב יותר את התפקיד של מיקרוגלייה במחלה, פרוטוקול זה מאפשר את זה. הפרוטוקול המתואר להלן משלב תהליך צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות להפחתת פסולת הסלולר, עם הפרדה מגנטית, הפקת מדגם מאוד טהור של תאים microglial העיקרי שיכול לשמש לניסויים בתוך חוץ גופית , בלי הצורך 2-3 שבועות culturing. בנוסף, השלבים אפיון תשואות פונקציונלי נתונים אודות מיקרוגלייה, מחקרים לשיפור ההבנה שלנו של קיטוב וסיוע הטרמה של תאים אלה, אשר יש השלכות חזק בתחום של רפואה רגנרטיבית.
מבוא
נזק רכשה במהלך תקופת הלידה דלקת, מחוסר חמצן-ischaemia, דימום יכול להיות מערך של sequelae לטווח ארוך. הפתופיזיולוגיה המורכבת של פגיעה מוחית הלידה הוא משוער לערב דלקת ו איסכמיה עם מוות עצביים עצב שהתפתח1. התגובה החיסונית מולדת ממלא תפקיד חשוב בהמפל של האירועים שהובילו פגיעה2.
מיקרוגלייה, תושב תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), הם המגיבים הראשונים פציעה3. מיקרוגלייה הם סוגי תאים פלסטיק עם היכולת להיות תלויי מגן או רעיל, על הסביבה4. הם מעורבים כימוטקסיס, phagocytosis, מצגת אנטיגן וייצור של ציטוקינים ו4,ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליכים הבאים אושרו על ידי ועדת האתיקה חיה ב אוניברסיטת מונש. בריאה neonate טיפול C57Bl6/J P3-6 עכברים שימשו כדי להפיק את התוצאות נציג.
1. עיכול אנזימטי
הערה: חשוב לשקול עקרות כאשר בידוד culturing ראשי תאים. תוך הקפדה שהסביבה הוא סטרילי ככל האפשר, הקרע הראשוני ואת הקציר של המוח מאתר יכולה להסתיים מחוץ ברדס זרימה laminal, עם כל והשלבים מבוצעים תא למינארי.
- באמצעות מכשירים סטריליים, המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם, לערוף את החיה, לשטוף עם 100% אתנול. בעזרת מספריים קטנות סטרילי, לבצע חתכים קטנים לאורך צד ימין ועל שמאל של הראש. בגיל הזה, העור קליפות משם בקלות. באמצעות קצות המלקחיים מעוקל, החלק בעדינות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות השיטות המתוארות כאן, אוכלוסיות טהור של מיקרוגלייה ניתן לבודד והוא יכול להיות מוכן אפיון באמצעות במבחנה וניתוח FACS. כדי להתחיל עם, עד 18 בעלי חיים יכולים לשמש לכל cull, עם התשואה הצפויה של-450,000-600,000 microglial תאים. זה חיוני לאשר תחילה את הטוהר של תאים מבודדים, לעשות ניתוח FACS בוצע על ידי צביעת עבור שני הסמנים CD45 ו- CD11b. זיהוי של מיקרוגלייה יכול להוכיח בעייתי, כמו סמנים רבים לידי מיקרוגלייה מתבטאים גם על ידי מקרופאגים, ושימוש של שני סמנים אלה מאפשר כימות מדויק .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מיקרוגלייה יש את היכולת להיות גם פרו - דלקתי, ששונו על-ידי סביבת גירויים. מחקרים קודמים הראו שמודולציה של הפעלת מיקרוגלייה יכול להתייעץ neuroprotection. היכולת שלהם לספק הגנה את הנוירונים ותיקון פציעה מחייבת מחקר נוסף כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של תאים מורכבים אלה. לכן, בידוד של טוהר גבוהה מיקרוגלייה העיקרי הוא שיטת חשוב ושימושי. זוהי שיטה מהירה יחסית להשגת מיקרוגלייה הראשי מאוד טהור מוכן ניסויים במבחנה בתוך 2 ימי.
ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של ראשי מיקרוגלייה מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM, גלוקוז נמוך, פירובט | Gibco | 11885084 | |
| אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI דרגה II מלבלב בקר | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| פפאין מלטקס פפאיה, תמיסה חוצצת | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b ערכת בחירה חיובית | StemCell Technologies | 18770 | גרסת |
| מגנט EasySepמגנט EasySep | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered Salt | Salt Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16 / CD32 (עכבר BD Fc Block ™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5 מ"ל מבחנה PP עם בהירות גבוהה עם תחתית עגולה, עם מכסה הצמד, | 352063 | קורנינג | |
| 175 ס"מ ו-2; בקבוק תרבית תאי צוואר זוויתי עם מכסה אוורור | קורנינג | 431080 | |
| ליפופוליסכרידים מבית Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 בארות מיקרו-פלטות מטופלות TC בגודל 96 בארות, שקופות, פוליסטירן, קורנינג תחתון עגול | CLS3799 | ||
| פרפורמלדהיד (אבקה, 95%) | סיגמא-אולדריץ' | 158127 | |
| טריטון-X | סיגמא-אולדריץ' | X100 | |
| ארנב אנטי-IBA1 | Wako | 01919741 | |
| עיזים נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS נוגדנים | ><חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | |
| V450,חולדה,נגד עכבר,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-CY5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher | Scientific P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| תמיסת יודיד פרופודיום | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
מקורות
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
