הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57071

⸱

11 באפריל 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Department of Rheumatology & Clinical Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מספקים פרטים עבור שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון רקומביננטי פיוז'ן IL4-10. אנו גם מראים כיצד לבחון את היעילות של חלבון זה כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאבים דלקתיים.

תקציר

כאב כרוני קשה לטיפול, גישות חדשות כדי לפתור כאב מתמשך נחוצים בדחיפות. ציטוקינים אנטי דלקתיות הם מועמדים מבטיחים לטיפול במצבים מתישה כאב בשל יכולת שלהם להסדיר אינטראקציות נוירו-החיסון חריגה. עם זאת, מבחינה פיזיולוגית הם עובדים ברשת של ציטוקינים שונים, ולכן האפקט הטיפולי שלהם לא יכול להיות אופטימלית בשימוש כטיפול עצמאי סמים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו חלבון פיוז'ן של ציטוקינים אנטי דלקתיות IL4 ו IL10. כאן, אנו מתארים את שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון כימרי רקומביננטי IL4-10, נוכל לבחון את היעילות של החלבון פיוז'ן IL4-10 כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאב דלקתי מתמשך.

מבוא

כאב כרוני נותרה אחד ביותר מתישה, שטופלו תחת בעיות רפואיות של המאה ה-21, המשפיעים על > 20% של אוכלוסיית הבוגרים1,2. עם זאת, טיפולים כדי לספק הקלה מכאב כרוני לעיתים קרובות אינם יעילים או צריך להיות הופסק בשל תופעות לוואי חמורות3. חשוב, כיום סמים זמינים רק לספק הקלה סימפטומטי, אבל לא באופן משמעותי לשנות או לרפא כאב כרוני. למרות כאב כרוני נראה הפרעה נוירולוגית, הראיות עולה מעורבות של מערכת החיסון כאב כרוני פיתוח4,5. יתר על כן, מתגלים גישות החיסון לטיפול בכאב. לדוגמה, לעכב ציטוקינים אנטי דלקתיות כאבים במספר דגמים של כאב כרוני-6,-7,-8. אולם, ציטוקינים אנטי דלקתיות יש תוחלת חיים קצרה, הפחתת תופעות כאב עיכוב האפשריות שלהם. יתר על כן, ציטוקינים אנטי דלקתי עובדים ביותר בצורה אופטימלית בתיאום אחד עם השני. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנחנו לאחרונה התמזגו ציטוקינים אנטי דלקתיות אינטרלוקין-4 (IL4) של אינטרלוקין-10 (IL10) לתוך מולקולה אחת. חלבון כימרי IL4-10 מראה יעילות מעולה עיכוב כאב דלקתיות, נוירופטי כרוני לעומת ציטוקינים בודדים9. כאן נתאר כיצד מופק חלבון כימרי כזה, מטוהרים, ונשלט איך האיכות שלה.

חלבון כימרי IL4-10 מיוצר בתאי אדם על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK293-F עם וקטור ביטוי pUPE נושאת את רצף cDNA קידוד החלבון פיוז'ן IL4-10. HEK293-F תאים נבחרים כדי לאפשר שינוי post-translational של החלבון, משהו אינה מתרחשת במערכות חיידקי הביטוי. כדי למטב את glycan מיצוי בחומצה sialic, cDNA קידוד בטא-galactoside-2, 3-sialyl-טרנספראז משולב וקטור כמו transgene השני. החלבון פיוז'ן מטוהר באמצעות זיקה טיהור חלבון של התרבות supernatant כי זה חזק יותר טיהור על ידי שיטות למשל גודל-הדרה או יונים כרומטוגרפיה10,11אחרים. לטהר את חלבון כימרי IL4-10, השתמשנו נוגדנים חד-שבטיים תוצרת הבית נגד IL4. הערכה של טוהר, bioactivity של חלבון כימרי IL4-10 מטוהרים מבוצעת כחלק של בקרת איכות. הטוהר של אצוות המיוצר מוערך על-ידי נתרן Dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) ו גבוהה בלחץ גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (HP-שניות). Bioactivity של החלבון פיוז'ן IL4-10 מוערך על-ידי מדידת את יכולתו לעכב ליפופוליסכריד (LPS)-induced הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNFα) ייצור בתרבויות דם מלא, והשוואה בין שהיא השילוב של הפרט ציטוקינים.

לבסוף, על מנת לבדוק את היכולת של IL4-10 היתוך חלבונים כדי לעכב כאב כרוני, נתאר איך ניתן לבחון את חלבון כימרי כמו כאבים במודלים של העכבר בשימוש נרחב של כאב דלקתי מתמשך12,13,14 . כאן נתאר את השיטות של מודל כאבים דלקתיים. עם זאת, חשוב לציין כי מודלים אחרים הכאב יכול להיות משומש (למשל, כאב נוירופתי מודלים), בהתאם למחקר שאלות שצריך לענות. כדי להעריך קוץ מודלים אלה, חשוב להשתמש במגוון אמצעים התנהגותיים הכוללים עורר ואמצעים שאינם עורר הכאב. כאן, אנחנו תיאר שיטות הערכה לקראת שינויים באופן מכני, תרמית עורר תגובות התנהגותיות. מכני רגישות לגירויים לא מזיק מוערך באמצעות מבחן פון פריי, תוך רגישות תרמית מוערך באמצעות מבחן הארגריבס. חשוב, hyperalgesia/allodynia-עורר נמדד באמצעות מבחן נושאת משקל דינמי. אמצעים אלה מקובל כמידות כאב, תשואות מידע חשוב על סף כאב וכאב פוטנציאליים מנוסים על ידי בעלי חיים15,16,17. השני מודד להערכת שאינם עורר הכאב (למשל, גירוי עצמאית), כגון הבחינה העדפה המקום ממוזגים, יכול להיות בעל ערך18. כדי להעריך את הפוטנציאל של הסם כדי לעכב את הכאב, ביצענו במחלה הניהול של החלבון פיוז'ן, עם מסלול מינהל פחות חלבון במינון הדרוש כדי להגיע לאזורים הקשורות כאב ולהימנע מערכתית (לוואי) אפקטים19, 20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות בינלאומיות ואישור מראש של הוועדה המקומית אתית ניסיוני. דם הושג משירות התורם מיני (מיני התורם שירות, MDD)-אוניברסיטת רפואי למרכז אוטרכט (UMCU) בהולנד. MDD קיבלה אישור חיובי של ועדת האתיקה הרפואית של UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) עבור פרוטוקול מספר 07-125/ג

1. חלבון הפקה ואפיון

  1. תרבית תאים
    הערה: ראה את הטבלה של חומרים בינונית תרבות בשימוש.
    1. להפשיר את התאים HEK293-F ב 37 ° C עד שיש גוש קטן של קרח. העבר את התאים המופשרים מיד 10 מ"ל של מדיום קר כקרח (4 ° C), centrifuge התליה תא בטמפרטורת החדר (RT) במשך 4 דקות (דקות) ב 500 x g.
    2. הסר את המדיום, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל בינוני טריים-RT, ואחריו צנטריפוגה ב 500 x g למשך 4 דקות.
    3. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 5 מ של בינוני-RT. הוסף התליה תא ישירות לתוך בקבוקון 125 מ ל המכיל 25 מיליליטר מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס). התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 8% CO2ו- 95% לחות על תפקודי לב / מסתובב במהירות של 125 סל ד.
    4. תת-תרבות התאים פעמיים בשבוע. השתמש תא אוטומטיות מונה (ראה טבלה של חומרים) כדי להעריך את מספר הטלפון ואת הכדאיות תא. הזרע התאים קיימא-ריכוז של 3 x 105 תאים למ"ל לתוך מבחנות Erlenmeyer. שמור הנפח הכולל של המדיום התרבות ב- 1/5 מהנפח הכולל של תרבות Erlenmeyer המבחנות בכל עת לשמור על אוורור אופטימלית.
  2. תרביות תאים
    הערה: תת-תרבות התאים שלוש עד ארבע פעמים לפני תרביות תאים, transfect אותם כאשר הכדאיות תא > 90%. תא הכדאיות מוערך על ידי ממוכנת (שדה חשמלי רב ערוצית) cellcounting מערכת המבוססת על התקינות של קרום פלזמה. ראה את הטבלה של חומרים הכימית תרביות תאים.
    1. Centrifuge את התאים ב RT עבור 4 דקות ב 500 x g; resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של תרבות מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס), לדלל התליה תא ~1.0 x 106 תאים/מ בהנפח הכולל של ל' 1 Aliquot התליה תא ב 10 aliquots של 100 מ ב- 500 מ"ל Erlenmeyer המבחנות.
    2. למהול 1 מ ג של פלסמיד DNA במדיום חיוני מינימלי מופחתת-סרום 33 mL (גברתי, ראה טבלה של חומרים) על ידי ערבוב עדין. בשפופרת נפרדים, לדלל 1,330 µL של תרביות תאים ריאגנט ב MEM על ידי ערבוב עדין. דגירה שני פתרונות ב- RT 5 דק הוספה, לערבב את ה-DNA מעורבבת עם הגברת כדי הכימית תרביות תאים, גברתי, דגירה לערבב למשך 30 דקות ב- RT.
    3. להוסיף את התמהיל ריאגנט DNA-תרביות תאים לתאים (תרבותי בסעיף 1); להוסיף 6.6 מיליליטר לערבב כל 500 מ"ל המכיל 100 מ של תאים תרבות בינוני את הבקבוק Erlenmeyer. לשמור את התאים בתנאים כאמור תרבות. לקצור את תגובת שיקוע תרבות המכיל חלבון כימרי IL4-10 על ידי שלושה ימים לאחר תרביות תאים.
    4. לקבוע את הריכוז של חלבון כימרי IL4-10 בתרבות supernatant על ידי ביצוע של אליסה IL10 לפי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: בתנאים אופטימליים תרבות, ריכוז החלבון פיוז'ן צפויים להיות בין 2.5, 5 µg/mL.
  3. חלבון טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה
    הערה: כרומטוגרפיית זיקה מתבצע בטמפרטורת החדר. עם זאת, כל שברים (תרבות תגובת שיקוע, עומס, הזרימה ו • תנאי-שברים) נשמרים בקירור במהלך ההליך.
    1. זוג תוצרת הבית in נוגדנים חד שבטיים כנגד IL4 עד 1g של ברומיד - 10 מ ג הופעל sepharose 4B, על-פי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים). שופכים 2.5 מ של sepharose בשילוב חרוזים לאט לתוך העמודה כרומטוגרפיה זכוכית (30 ס מ אורך וקוטר פנימי 1.5 ס מ, ראה טבלה של חומרים).
    2. לחסום מחייב אתרים של החרוזים על-ידי העברת 50 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) המכיל 1% הנותרים שור אלבומין דרך העמודה. לשטוף את העמודה עם 25 מ של PBS (ה-pH = 7.4) ואחריו מ"ל של 0.1 M גליצין מאגר (pH = 2.5), 25 מ של PBS (pH = 7.4).
    3. עוברים 100 מ של תרבית תאים HEK293 מרוכז 10-fold supernatant באמצעות המדור בספיקה של 1 מ"ל לדקה לשטוף את העמודה עם 50 מ של PBS.
    4. Elute של חלבון כימרי IL4-10 מאוגד עם מ"ל של 0.1 M גליצין מאגר (ה-pH = 2.5) בספיקה של 1 mL/min ולאסוף שברי 2.5 מ ל. להוסיף 350 µL מאגר טריס 1 מ' (ה-pH = 9) את כל השבר כדי להביא את ה-pH 7. Dialyze שברים ינוטרלו בן לילה נגד 2 ל' ל- PBS (ה-pH = 7.4).
      1. השתמש דיאליזה אבובים עם 16 מ"מ קוטר יבש, ניתוק משקל מולקולרי של 3.5 K. סטרילי לסנן שברים dialyzed באמצעות מסננים חד פעמיות בקוטר 0.45 נקבובית מיקרומטר. לאחסן פתרון סטרילי של חלבון פיוז'ן IL4-10 ב- aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
    5. להעריך את טוהר eluted חלבון כימרי IL4-10 על ידי שהוכתמו Coomassie ג'ל מרחביות-דף 12% ו- HP-סק (עמודה 3 מיקרומטר שניה-2000). לניתוח HP-SEC, טען µL 40 של חלבון-הריכוז ~ 1 מ"ג/מ"ל על העמודה. השתמש 100 מ מ סודיום פוספט מאגר עם 150 מ מ נתרן כלורי (ה-pH = 6.8) בתור שלב ניידים. לקבוע את קצב הזרימה 1 mL/min.
    6. לקבוע את הריכוז של כל אצווה מטוהרים חלבון כימרי IL4-10 מאת אליסה IL10 ואת וזמינותו חלבון חומצה Bicinchoninic (BCA חלבון Assay קיט, ראה טבלה של חומרים) על פי הפרוטוקולים של היצרן.
    7. השתמש רקומביננטי IL10 האנושי ליצור עיקול רגיל ב- ELISA וזמינותו. כדי לתקן את ההבדל בגודל בין IL10 רקומביננטי (18 kDA) חלבון כימרי IL4-10 (34 kDa), להכפיל את הריכוז שהושג בפקטור של 1.8.
  4. Bioactivity של חלבון כימרי IL4-10
    הערה: וזמינותו דם מלא מתבצעת עבור כל אצווה של חלבון כימרי IL4-10 הפיק, הפעילות של קבוצות שונות מושווה כחלק של בקרת איכות. וזמינותו דם מתבצע על דם טרי שנאספו ביום וזמינותו צינורות הפארין. דם הושג של מתנדבים בריאים בשירות שלנו ללא צורך במיקור חוץ התורם. דוגמאות צריך להיות מטופל כמו סיכון ביולוגי פוטנציאלי.
    1. להכין 3-fold דילולים קדם טורי של החלבון פיוז'ן IL4-10 מטוהרים RPMI בינוני (ראה טבלה של חומרים) על פני ריכוז טווח 5-1,215 ng/mL.
    2. להכין מראש דילולים של LPS (100 ng/mL) והדם האנושי כי הוא מדולל 4 פעמים RPMI בינוני.
    3. Pipette של דילולים מראש של חלבון כימרי IL4-10, תקליטונים, דם אנושי לתוך צלחת 48-. טוב. כל טוב, כדי להוסיף חלבון כימרי IL4-10 µL 50 (ריכוז סופי 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI בינוני, µL 25 LPS (הריכוז הסופי 10 ng/mL) ו דם אנושי 100 µL (סוף מדולל).
      הערה: הנפח הכולל לכל טוב הוא 250 µL.
    4. דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס, 8% CO2ו- 95% לחות עבור 18 h.
    5. להעריך את ריכוז TNFα ב תרבות supernatants באמצעות של אליסה TNFα, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
    6. לחשב עיכוב של התגובה דלקתיות על-ידי IL4-10 חלבון כימרי לפי הנוסחה: עיכוב % = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
      הערה: כאן A = TNFα רמות בתרבויות מגורה LPS מטופלים עם חלבון כימרי IL4-10, B = רמות TNFα תרבות unstimulated, ו- C = TNFα רמות בתרבות מגורה LPS.

2. העכבר מודל עבור כאב דלקתי מתמשך

הערה: חשוב להשתמש גם זכר וגם נקבה עכברים (C57Bl/6) כי זה יאפשר זיהוי תופעות תלוית מין. באופן כללי, העכברים השתמשו הם בין 8-16 שבועות. כדי לקבוע את מספר בעלי החיים הנדרשים, צריך לבצע חישוב כוח. הכלים המבוססים על האינטרנט כדי לבצע חישובים כאלה מצויים בקלות באינטרנט (למשל, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).

  1. אינדוקציה של כאבים דלקתיים כרוניים
    הערה: לגרום כאב דלקתי מתמשך בעכברים מבוגרים עם זריקות intraplantar של קרגינאן או של פרויד מלאה אדג'וונט (CFA). הבדיקות שונה לא יפריעו אחד לשני.
    1. הכנת קרגינאן (2% w/v) על ידי המסת λ-קרגינאן (ראה טבלה של חומרים) ב- 0.9% NaCl ע י העברת הפתרון באמצעות מחט 23-מד כדי להבטיח כי קרגינאן מחוסלת כראוי. להכין פתרון טרי ישירות לפני ההזרקה מבוצעת.
    2. לחלופין, אם פרנק, לערבב את הפתרון פרנק כראוי לפני הזרקת זה intraplantarly, כי פרנק אמולסיה מים בתוך שמן המכיל 1 מ ג של Mycobacterium חום שחפת (H37Ra) נהרג, מיובש, שמן פראפין 0.85 mL 0.15 מ ל mannide monooleate (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: מומלץ עבור הזרקת תרכובת זו כי גומי בוכנות עשוי להגיב עם השמן אדג'וונט מזרקים המילטון זכוכית עם מתכת בוכנות.
    3. הזרקת intraplantar
      1. לשמור על המתחם (שלבים 2.1.1 או 2.1.2) במזרק-RT למשך לפחות 15 דקות לפני הזרקת כדי לאפשר התאמה 20 להזריק RT. µL של המתחם (או dissolvent כפקד) subcutaneously לתוך הכפה האחוריות של העכבר שאינם מרדימים באמצעות מד-30 מחט.
      2. בבסיס האגודל הבימוי לעקב את המחט ולהזריק את המתחם כאשר המחט מוחדרת כ 0.5 ס מ. לאחר ההזרקה, לאט תמשוך את המחט בזמן סיבוב מעט את המזרק כדי למנוע דליפה של פתרון מחוץ ההזרקה.

3. כאב מדידות

הערה: ודא כי החוקרים ביצוע ניסויים התנהגותיים עיוורים לטיפול העכבר. חשוב להתאקלם, לחיות סביבת הבדיקות לפני ביצוע לכל מידה. רצוי, השבוע לפני תחילת הניסויים, חיות ממוקמים 1 - 2 פעמים למשך 15-30 דקות בכל אחד המכשירים שונים המשמש עבור ביצוע הבדיקות. בעת טיפול זכרים ונקבות זהה לניסוי, להעריך זכרים ללא תלות נקבות. כלובים נקי ומשטחים בהרחבה בין הקבוצות השונות כדי למנוע תופעות לא רצויות האפשריות על התנהגות של המינים השונים. למדוד בסיסית נסיגה השהיות או מכני ספי שתיים עד שלוש פעמים כדי לקבוע סף בסיסית ולזהות באופן מדויק באם הן יציב לפני הזרקת intraplantar של כל המתחם.

  1. מבחן פריי פון: מכני רגישות לגירויים לא מזיק
    1. למקם את החיות בנפרד הכלובים אקריליק על דוכן רשת שינוי חוט ולאפשר העכברים להתאקלם למשך לפחות 15 דקות לפני מדידות.
    2. להעריך את רגישות מכני על ידי מדידת סף נסיגה כפת בתגובה לסדרת מכוילת פון פריי שערות ועד 0.02 4 ג'י לשקול כל תנועה של הכפה מן השיער יישומית כתגובה נסיגה חיובי. להחיל את חוטים בניצב השטח פאו עם מספיק כוח כדי לגרום כפיפה קלה על העור והחזק נקצה ס' ~ 3 בטח השיער לא מעוות במהלך היישום הכפה.
    3. לחשב את הסף כפת-גמילה 50% באמצעות שיטת שיהיה15,21.
      הערה: הסיב הראשונה ליישם היא 0.4 g (עשוי לשמש אחרים חוטים המוצא בהתאם הסף אלו עכברים להציג בנקודת ההתחלה). חוסר תגובה פילמנט מציין כי הסיב עבה הבא משמש הגירוי הבאות, בעוד לתגובה חיובית מציין את השימוש פילמנט דק יותר הבא. מספר מצגות השיער נקבע לפי ההפרש התגובה הראשונה; לאחר מכן, מבוצעות 5 יישומים נוספים. לחשב שסף 50% לפי השיטות שתוארו בעבר15,21.
  2. רגישות תרמית: מבחן הרגריבס
    1. להכניס את בעלי החיים בתוך הכלובים על צלחת זכוכית ומחוממת מראש (30 ° C) ולאפשר העכברים להתאקלם למשך לפחות 15 דקות לפני מדידות, המתנה עד החיות לשבת בשקט.
    2. לקבוע חום נסיגה השהיה פעמים על ידי חימום הכפה של בעלי החיים ע י קרן אור ממוקדת גלוי באמצעות מנגנון הרגריבס (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: עוצמת הקרן מוגדר כ 12%, כי עם הגדרה זו בעוצמה השפעול נחוש, אלומת האור מעורר תגובת הנסיגה של תקופה ממוצעת של 8 s בנקודת ההתחלה על עכברים C57Bl/6. הגדרת עוצמת צריך להיקבע לכל מכשיר בודדים, המתח העכבר. שעות איסוף מקסימלי של 20 s או יותר משמשים כדי למנוע פציעה של בעלי החיים.
    3. למדוד טיימס השהיית הגמילה ~ 4 פעמים לכל חיה. ממוצע כל התגובות נמדד. למדוד את כל כף היד באופן עצמאי, לפחות 1 דקות המרווחים בין מדידות עוקבות באותה כף.
  3. גירעונות אלה: מבחן הנושאת משקל דינמי
    1. מודדים את משקל הגוף של כל בעל חיים לפני המבחן, מאז ניתוח נושאת משקל דורש את משקל הגוף של כל בעל חיים בודדים כמו כפרמטר קלט.
    2. מקם את החיות בנפרד קומה-מעקב מערכת נושאת משקל דינמי המורכבים על כיסוי תמיכה מצלמה אשר יתעד את תנועות העכבר. תן את החיה ואקלום של 0.5-1 דקות לפני הקלטה למשך 5 דקות.
      הערה: במבחן הזה, חיה נעה בחופשיות אחת בלבד ניתן להעריך בכל פעם.
    3. להתאים את ההגדרות כדי לבצע נשיאת משקל ולנתח את הנתונים.
      הערה: בניסויים אלה, אנו משתמשים בפרמטרים הבאים: (i) נמוך משקל סף של ז': 0.6 זה המשקל המינימלי הדרוש להפעיל את אחד התאים של החיישן. (ii) משקל סף ז' 1: מספר זה מציין את המשקל הדרוש להפעלת מלא תא אחד. (iii) הסף משטח של תאים 2: מספר זה מציין את מספר תאים סמוכים זה לזה, כי צריך להיות מופעל כדי להילקח בחשבון. (iv) מספר תמונות המינימלי הוא 5: זה לוקח 0.1 s כדי ללכוד את כל תמונה. המספר מציין את מספר מינימלי של מסגרות שבו העכבר לא זז. ככזה, ערך של 5 פירושו העכבר תנוחה צריך להיות יציב עבור > 0.5 s כדי להשיג מידה זה נלקחת בחשבון לצורך ניתוח.
    4. לבצע הניתוח של כל קליפ הוידאו נוסף ולהבטיח כי כל איבר מוכר כראוי על ידי התוכנה מסגרת הזמן שצוין על-ידי התוכנה.
      הערה: מינימום של 1 דקות מהזמן מוקלטות צריך לאמת. משקל דינמי הנושאת התוכנה מחשבת ומספק את הפרמטרים הבאים: (i) המשקל על ידי כל כפת בודדים גרמים, כאחוז של משקל הגוף כולו. (ii) משקל על ידי הכפה קבלה משולב או את הכפות האחורי משולב גרמים, כאחוז של משקל הגוף כולו. (iii) היחס בין שמאלה/ימינה הכפות משקל הנושאת או קדמי/אחורי נשיאת משקל. (iv) את פני השטח של כל כף הרגל או כפות קדמי/אחורי משולב הופעלה משטח רגיש ללחץ. (v) סטייה אכזרי ולא רגיל עבור כל פרמטר. (vi) משך בתנוחות שונות (גידול, כפות 3 או 4 כפות רגליים) במהלך הניסוי כולו. (vii) זמן (s) בכל כף הרגל נושאת משקל במהלך הניסוי כולו.

4. במחלה הזרקה של IL4-10 חלבון כימרי על שיכוך כאבים

הערה: ודא כי האיוורור לחדר פתוח כדי להבטיח זרימת אוויר נאותה. כדי לבדוק את היעילות של חלבון כימרי IL4-10 (µg 1/עכבר; 5 µL הזרקת סה כ נפח) זה צריך להיבדק נגד הרכב זריקות, זריקות של שילוב ציטוקינים בודדים (IL4 + IL10, 0.5 µg + 0.5 µg/עכבר, 5 µL הזרקת סה כ נפח).

  1. עזים ומתנגד את העכבר עם 3-4% איזופלוריין עם שיעור זרימת החמצן של 2 ל'/min בבית הבליעה אינדוקציה. בדוק כי העכבר כראוי ומורדמת באמצעות צביטות הכפה כדי להבטיח כי החיה אינה מגיבה.
  2. המקום העכבר על השולחן עם הראש שלו להציב האף חרוט המנגנון ולתחזק את העכבר הרגעה עם 1.5-2% איזופלוריין עם שיעור זרימת החמצן של 2 ל'/min בזמן ביצוע הזריקה במחלה.
  3. מילוי חוזר תרכובות להזרקה לתוך כוס נקי 25 µL המילטון המזרק מחובר מחט 27-מד.
  4. להחזיק את העכבר בחוזקה על ידי עמוד השדרה האחורי לצלעות ולהרים מעט את העכבר. מקם את המחט אנכית בין חוליות מותני L5 ו L6 ולהוסיפו בזהירות דרך העור ממש באמצע של חוליות המותניים. מקם את המחט לתוך מרחב בין-חולייתי.
    הערה: למצוא את שטח בין-חולייתי עשויים לדרוש כמה 'חיפוש' על-ידי להזיז את המחט לאורך ציר הגחון rostral, בקלילות הקשה על המחט עד לאובדן של ההתנגדות של רקמת העצם מורגשת.
    1. אשר המיקוד הנכון על-ידי אימות כי התרחשה תנועה הזנב. מזריקים µL 5 של המתחם לאט, לחכות כמה שניות, ואז לאט לאט. משכי את המחט. אם רק נצפית תנועה כפת יחיד, המחט סביר אינם ממוקמים כראוי.
  5. לאחר ההזרקה, בדוק את העכבר מקרוב הראשון 30 דקות לאחר ההתאוששות מן ההרדמה כדי לוודא העדר כל ליקוי/שיתוק מוטורי.
    הערה: התנהגויות הכאב יכול להיות נמדד (כפי שמתואר בסעיף 3) 15 דקות לאחר השחזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמונה ייצוגית ג'ל מרחביות עמודים המכילים שברים שונים שהתקבל במהלך טיהור כרומטוגרפיה זיקה מוצג איור 1א'. עומס (L), זרימה דרך שברים (FT), נוכח תגובת שיקוע HEK293 כל החלבונים הם נצפו. אין חלבונים הוא ציין את השבר לשטוף (W). ב השבר • תנאי (E), שתי להקות של 35, 37 kDa שנצפו המייצגים שני glycoforms שונים של חלבון כימרי IL4-10 (חיצים). איור 1B, עוצמת נציג assay בדם כל וזמינותו של שני שונים IL4-10 היתוך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מתאר שיטות ייצור, אפיון של חלבון חלבון כימרי IL4-10, ושיטות לבדיקת יעילותה של עיכוב hyperalgesia דלקתיות במודלים של העכבר של כאב דלקתי מתמשך. הייצור ואת טיהור של החלבון פיוז'ן IL4-10 מתבצע בקנה מידה קטן. HEK293 תאים נבחרים כמערכת ביטוי לייצור חלבון כי הם מאפשרים שינויים post-translational זה אינה יכולה להיות מושגת במערכות ביטוי prokaryotic. שינויים post-translational רלוונטי עבור פונקציה של חלבונים, העדר של שינויים אלה יכולים להשפיע על יעילות טיפולית של החלבון פיוז'ן IL4-10. החלבון מטוהרים מתרבות supernatant על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

חלק מעבודה זו ממומן על ידי מדעי החיים אוניברסיטת אוטרכט הענק

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי FreeStyle 293-FInvitrogenR790-07תאי כליה עובריים אנושיים 
GIBCO FreeStyle 293 Expression MediumLife טכנולוגיות12338018תרבית מדיום
293fectin ReagentInvitrogen12347019מגיב טרנספקציה
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAXטכנולוגיות חיים51985026מדיום סרום מופחת לשימוש במהלך טרנספקציות שומנים קטיוניות 
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x)Life technologies52400-025
CNBr-Activated Sepharose 4BGE Healthcare17-0430-01מדיה מופעלת מראש לצימוד נוגדנים או חלבונים גדולים אחרים
חומצה הידרוכלורית מאדים 37% Merck1003171000
נתרן כלוריSigmaS7653-1 ק"ג
נתרן ביקרבונט סיגמא31437
טריזמה הידרוכלורידסיגמאT3253-500Gטריס הידרוכלוריד 
חומצה אצטית 100%                                                         מרק1.00063.1000 
גליצין-הידרוכלוריד                                                                               סיגמאG2879                         
PBS                                                                                                     בית מרקחת, UMCUפוספט חוצץ
מלח 10X TGSBIO-RAD161-0772Tris/Glycine/SDS Buffer לאלקטרופורזה SDS
Mini-PROTEAN TGX GelsBIO-RAD456-104612% SDS ג'לים טרומיים
Trans-Blot Turbo Transfer PackBIO-RAD170-4157חבילות העברת כתמים מערביים
Yarra 3u SEC-2000 עמודהPhenomenex
כתם חלבון InstantBlueExpedeonISB1Lמוכן לשימוש כתם חלבון Coomassie לג'ל פוליאקרילאמיד
Human IL-10 DuoSet ELISAR& DDY217B
TNF אנושי ואלפא; ELISA סטדיאקלון851570020
BCA ערכת בדיקת חלבון פירסThermoFisher Scientific23227
CarrageenanSigma-Aldrich22049מוקופוליסכריד צמחי
CFAסיגמא-אולדריץ'F5881אדג'ובנט
מזרק המילטוןSigma-Aldrich20779מזרק זכוכית
מתחם בעלי חייםIITC Life Science433מארז לבעלי חיים
מעמד רשת פון פרייIITC מדעי החיים410מעמד רשת
שערות פון פריי Stoelting58011בדיקות חושיות
מבחן פלנטר (שיטת הרגריבס)מבחן פלנטר IITC Life Science390Gעם זכוכית מחוממת
מבחן מיסב משקל דינמיBiosebBIO-DWB-AUTO-Mמבחן גירעון יציבה
מזכוכית עמודי Econo-Column, 1.5 ופעמים; 30 ס"מBIO-RAD7371532עמודת כרומטוגרפיה מזכוכית   
צינורות דיאליזה של SnakeSkin מסנן מזרק Thermo Scientific88242
Minisart NML Sartorius16555-K, 0.45 μ מונה
תאים ומנתח M CASYRoche
מבחן מגע יחידת סינון חד פעמית

מקורות

  1. Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
  2. Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102(2008).
  3. Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
  4. Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
  5. Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
  6. Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
  7. Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
  8. Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
  9. Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
  10. Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
  11. Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
  12. Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
  13. Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
  14. Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  17. Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
  18. He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
  19. Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
  20. Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682(2013).
  21. Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
  22. Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חלבון היתוך רקומביננטיחלבון היתוך IL4-10ניקוי חלבוניםכרומטוגרפיית זיקהאנליזת SDS-PAGEבדיקת ELISAמבחן פון פריי (Von Frey)מכשיר הארגריבס (Hargreaves)נשיאת משקל דינמיתמודלים לכאב כרוני
פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.