הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57081

⸱

29 במרץ 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

במאמר זה

סיכום

הבנת שינויים ואפשרות האפשר אמייל דורש לימוד פעילות ameloblast. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה ועקבית לנתח מיקרו-איברים אמייל המכיל הפרשת ועל התבגרות-שלב ameloblasts העשויות לשמש עוד יותר כמותיים ואיכותיים בצרות.

תקציר

אמייל פגמים הנובעים תנאים סביבתיים ודרכי חייו הם הדאגה לבריאות הציבור בשל השכיחות הגבוהה שלהם. פגמים אלה הם תוצאה של פעילות שונה של תאים אחראי סינתזה אמייל בשם ameloblasts, אשר מציגים באיבר אמייל. במהלך amelogenesis, ameloblasts לעקוב אחר רצף ספציפי ומדויק של אירועים של התפשטות, בידול ומוות. חולדה וגדלות בהתמדה החותכות הוא מודל ניסיוני מתאים ללמוד במות פעילות ובידול ameloblast בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה ועקבית לנתח מיקרו-אמייל איברים של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים. Epithelia שיניים מיקרו-גזור מכילים ameloblasts הפרשה, התבגרות-בשלב זה עשוי לשמש עבור ניסויים איכותי, כגון מבחני אימונוהיסטוכימיה בחיי עיר הכלאה, כמו גם עבור כמותני כגון RT-qPCR RNA-seq, סופג המערבי.

מבוא

ליקויים התפתחותיים אמייל רבות העלולות לנבוע חשיפה חשיפה לרעלים סביבתיים ו/או סגנון חיים לא הולמת1,2,3,4. אפיון של שיבוש אירועי והמולקולות של amelogenesis באמצעות ההליך המתואר כיום יקדם את השימוש של פגמים אמייל וכתוצאה מכך כסמני מוקדם של חשיפה חשיפה לרעלים מספר, עשוי לעזור כדי לשקם את ההיסטוריה של בריאות כל מטופל במהלך תקופת הלידה כאשר האמייל הוא synthetized1,2. אמייל סינתזה ניתן לחלק לארבעה שלבים עיקריים בהתאם ameloblast פעילות5. הצעד הראשון regroups קודמן התפשטות תאים, pre-ameloblast. במהלך השלב השני, ameloblasts הבדיל מפרישים אמייל מטריקס חלבונים (פעימה), בעיקר amelogenin, enamelin, ameloblastin, הקובעות את עובי האמאיל הסופי. לפיכך, כל הפרעה של סינתזה EMP מוביל פגמים כמותית של האמייל. אחרי העדות של עובי אמייל מלא, מתחילה שלב ההבשלה. בשלב זה, מאפשר גידול crystallite אפטיט רוחב ועובי האמאיל להגיע היחס מינרליזציה הגבוהים שנמצאו רקמה ביולוגית, עם עד 96% לפי משקל. Disrupting האירועים המתרחשים במהלך ההבשלה הבמה להוביל איכותי אמייל פגמים. לבסוף, ameloblasts ייכנסו למצב של פוסט-התבגרות, הנקרא גם פיגמנטציה בחולדות, ואני עוברים אפופטוזיס במהלך התפרצות השן שהופך פגמים אמייל (אם בכלל) בלתי הפיך ובלתי הפיכה, ובכך פגמים מספקים פוטנציאל הקלטה רטרוספקטיבה של דגש על ameloblast. בחולדות, amelogenesis עוקב אחר רצף דומה של אירועים עם הייחוד שלהם החותכות הגדלים ללא הרף, מה שהופך אותם מודל מתאים ללמוד את התהליך הכללי של amelogenesis. לפיכך, כל הפרעה של amelogenesis גורמת שינויים אמייל איכותי ו/או כמות, בהתאם חלון הזמן של האירוע disrupting. במובן זה, חשיפה דיוקסין, עופרת, שיבוש אנדוקריניות כימיקלים משבשי כגון ביספנול A (BPA), genistein, vinclozolin, הוכחו ליצירת אמייל hypomineralizations1,2,3 ,-6,-7,-8. אסימטרי כתמים אטום לבנים אותרו על החותכות של חולדות נחשפים מנה BPA במינון נמוך במהלך התקופה העוברית, החודש הראשון לאחר הלידה1. פגמים אלה אמייל, חולדות, ואלה של השן החותכת טוחנת האנושי hypomineralization (MIH), חולקות מאפיינים דומים קליני, מבניים הביוכימי. MIH היא פתולוגיה תיאר לאחרונה אמייל השיניים, על אילו האטיולוגיה עדיין נשאר לא ברור9,10 למרות גורמים סיבתי רבים שהיה המשוערות9,10,11 ,12.

פתולוגיה hypomineralization אמייל חשוב נוסף בשל גורמים סביבתיים היא פלואורוזיס שיניים (DF), אשר הוא התוצאה של עודף פלואוריד הקליטה (> 0.1 מ"ג/ק"ג/יום)13,14. המקור העיקרי של פלואוריד הוא מי שתייה או שיושלם או באופן טבעי מועשר פלואוריד. פלואוריד הוא רשם גם לעתים קרובות כדי למנוע עששת, אבל מינון מניעתי רק 50% נמוך יותר מאשר אחת הרעילות (≤0.05 מ"ג/ק"ג/יום). MIH ו- DF, שתי פתולוגיות בתדירות גבוהה כתוצאה מחשיפה לגורמים סביבתיים, עשויים להציג תכונות משותפות צריך להיות מאופיין בשל potentiation ההשפעות hypomineralizing של פלואוריד בשילוב עם חשיפה לרעלים אחרים כגון והריון2 . או אמוקסיצילין15...

ניתוח מיקרו של עכברוש אמייל איבר המכיל ameloblasts בשלבים שונים בידול יעזור להבין את מנגנון הפעולה של מולקולות מסוגל לשבש את פעילות ameloblast, לגרום למומים אמייל להיות מאובחנים לאחר התפרצות השן. במילים אחרות, אפיון שינויים של האמייל ג'ין אמייל וביטוי מטריקס הרכב עקב חשיפה לרעלים סביבתיים מאפשר את בנייתו מחדש של ההיסטוריה של חשיפה חשיפה לרעלים, ומקלה על איכות הסביבה, בטיחות פיקוח עבור הציבור בריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים השתמשו במחקר הנוכחי היו נשמרים על פי הנחיות טיפול ושימוש חיות מעבדה צרפתית משרד החקלאות (A-75-06-12).

1. בעלי חיים חשיפה חשיפה לרעלים

  1. לפני ביצוע פרוטוקול זה, לקבל אישור מוסדי נחוץ ולהיות בטוח לקיים את כל הנחיות טיפול בבעלי חיים.
  2. להחיל את העיצוב של פרוטוקול מחקר המאפשר החוקה של קבוצות ניסוי שונות על מנת לבדוק את השפעת molecule(s) חקר על ameloblast הפרשת והבמה ameloblast ההבשלה. . ארבע קבוצות של חולדות Wistar זכר היו היוו בהתאם את חשיפתם פלואוריד (NaF) בשילוב או לא עם BPA (איור 1 א')2. כל בעלי החיים היו שנצפו, גזור ביום 65 (איור 1B).

2. ניתוח של המי-הלסת של חולדות למבוגרים

  1. המתת חסד חולדות על ידי חנק2 CO, לחלופין ואחריו עריפת ראש בראש נפרד משאר חלקי הגוף. לחשוף חולדות CO2 עבור 5 דקות בתוך תיבת ייעודי16.
  2. הסר את כל העור התחתון השפתיים באמצעות אזמל #11 כדי לקבל גישה נוחה אל החותכות התחתון.
  3. עם האזמל אותו, אעשה חתך בין החותכות התחתון שני עם לחץ קלה, הלסת התחתונה יפוצל לשני חצאים.
  4. לחתוך המפרק הלסתי זמני עם איזמל כדי לנתק את הלסת, להחזיק את המי-לסת תחתונה עם פינצטה משובחים.
  5. לחתוך את הרקמות הרכות שמסביב עם איזמל ולהסיר כל השרירים הגידים, הרצועות באמצעות המגרד של עד העצם נקי לחלוטין.

3. בידוד של השן החותכת17,18

  1. בזהירות לגלח את העצם על-ידי הצבת הלהב המקביל לציר האורך העיקריים של השן החותכת. התחל הרכס הגרמי בקרבת קצות השן החותכת (proximal end) עד לסוף השן החותכת ליד הלולאה צוואר הרחם. התנועה החתך ממשיך מ- proximal לכיוון דיסטלי.
  2. לבצע חתך הראשון יש הלולאה צוואר הרחם עם האזמל כדי להסיר את gonion של המי-הלסת התחתונה, היתר מורידה השן החותכת בקלות מבלי להזיק הלולאה צוואר הרחם או השלב הפרשה של ameloblasts (הקו האדום איור 2).
  3. עושים חתך השנייה מתחת ל טוחנת והוסף את האזמל בין העצם לבין השטח המדיאלי של השן החותכת. כאשר כל עצם הבסיס מורם, לסובב מסובבת כלפי חוץ השן החותכת ולהוריד אותו בקפידה כדי להימנע אמייל רקמות איברים לפגום באמצעות פינצטה משובחים.

4. ניתוח מיקרו של איבר אמייל תחת עדשת המשקפת

  1. ירידה µL 200 פוספט מלוחים מאגר (PBS 1 X) על השן החותכת באמצעות פיפטה. קח השן החותכת עם פינצטה בסדר עם השטח שפתיים פונה כלפי מעלה. להפוך את אזמל לסמן בין השקופה את החלקים כתום של הרקמה. הסימן הזה מקביל במקום לבן הבסיסי שבו הוא נצפות לאחר מכן (איור 2).
  2. לגרד, החופר או כלי מקביל, השטח תא מסימן האזמל כדי סוף הפסגה המתאימה הפרשת ameloblasts הבמה (חסר צבע), וממנו הסימן אזמל עד הקצה של השן החותכת עבור ameloblasts הבמה (כתום) ההבשלה.
  3. להסיר את הרקמה 2-מ מ המקביל לשלב המעבר, כפי שתואר קודם לכן19. אל תפתח השן החותכת במהלך אמייל חיתוך איברים כדי למנוע זיהום על ידי מזנכימה.
  4. חותכים את הלולאה צוואר הרחם ממוקם באופן מיידי בחלק הפסגה של השן החותכת (איור 2) כפי שתואר לעיל20.
  5. לאסוף אותו ב- 10% הפתרון פורמלין או פירוק לחקירות נוספות (ראה טבלה של חומרים).

5. אוסף של רקמות איברים אמייל מופרדים לחקירה נוספת

  1. . הורד שתי מאיות µL מאגר PBS 1 X על השן החותכת.
  2. עם להב סכין #11, בזהירות ניתוק בתאי אפיתל שיניים בהדרגה במאגר, בנפרד עבור כל שלב בעזרת אזמל שנשמעה בעבר.
  3. תא ה-RNA, חלבון עקירות, הכניסו את הרקמה פתרון פירוק המאפשר הפקת גם חלבונים וגם RNAs (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: להכין RNAs באיכות גבוהה על-ידי להפוך הרקמה-החופרת בצינור ולאחר מכן שיוף התאים עד קבלת תערובת אחידה. התערובת הוא מוכן עקירות RNA וחלבון לפי הנוהל של היצרן, אשר היה שתואר לעיל2,8,17. בדרך כלל, על סך µg 5-10 RNAs 150 חלבונים הכולל µg התקבלו עבור כל הכנה.
  4. עבור ניתוחים היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה (IHC), בחיי עיר הכלאה (איש), לשים את שכבת תאים בפורמלין 10% 2 h, אז החנות ב 4 ° C ב- PBS 1 X. הרקמה ואז ניתן להטביע את השעווה/פרפין או רקמות OCT למקטעי קפוא.
  5. EMP עקירות, סעו השן החותכת עם פינצטה משובחים. לאחר חשיפה לאוויר (התייבשות קלה) קצר, כתם לבן יהיה גלוי סביב החלק האמצעי של המשטח שפתיים של השן החותכת, אשר מייצג את אתחול של מינרליזציה האמייל. הנקודה הלבנה הזאת תואמת את המעבר- / בתחילת שלב ההבשלה של ameloblasts, אז בשביל זה כמחוון החילוץ של פעימה21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רבים אמייל פגמים, כגון פלואורוזיס שיניים12,13, עשוי לנבוע תנאים סביבתיים עקב ספיגת יתר פלואוריד או אמייל hypomineralization הדומה MIH עקב חשיפה כמה והריון1, 7,22. פגמים אלה, אמייל התפתחותית לשכפל השפעול על חולדות (איור 1)1,2,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Ameloblast שינו פעילות ו/או התפשטות ameloblast שיבשו, בידול, להוביל תהליכי התבגרות לפגמים אמייל בלתי הפיך, בתורו, אפיון אמייל פגמים עשוי לעזור לפתח הבנה של שינו פעילות ameloblast במהלך amelogenesis. כך, המחקרים על זגוגית מבודדת איברים הם דטרמיננטה התירי פתולוגיים האירועים שהובילו אמייל פגמים לא משנה מה מוצאם, סביבתי או גנטית.

טכניקה זו במקור תואר על-ידי הילר. et al. 17 ו רובינסון. et al. 18, והוא משמש כדי להדגים השפעות ספציפיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו מומן על ידי את אוניברסיטת פריז-Diderot, את הצרפתית המכון הלאומי לבריאות מחקר רפואי (INSERM), ואת המכון הצרפתי עבור מחקר Odontological (IFRO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ביספנול Aסיגמא אולדריץ', סנט לואיס MO239658
פורמלין 10%סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, צרפתTR118
RLT bufferQiagen, Les Ulis, צרפת74126RNeasy Protect Mini Kit
נוגדן לקולטן אנדרוגןSanta Cruz Biotechnology, סנטה קרוז, קליפורניה)sc-816נוגדן רב-שבטי ארנב
PBS 10xEUOMEDEXET330. נתרן
פלואוריד (NaF)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOS-1504
פרפלסט מיקרו-מערכות Leicaרגילות, Nanterre cedex,  צרפת39601006נקראת was/parafin ברקמת הטקסט
OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, צרפת411243
מספריים עדינים במיוחד של בון - ישרים/8.5 ס"מPHYMEP , פריז, צרפת14084-08
ידית ללהבי אזמל - 12.5 ס"מPHYMEP, פריז, צרפת10035-12
להב אזמל מעוקלPHYMEP , פריז, צרפת10035-20
סכין חיתוך - קצה עדין/ישרPHYMEP , פריז, צרפת10055-12
סכין מעגלPHYMEP, פריז, צרפת10059-15
להבי אזמל n° 11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, צרפת233-0024
עדשה דו-עיניתLeica biosystems, Nanterre cedex,  צרפתMZFLIII

מקורות

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343(2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1(2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503(2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרו-דיסקציה של איבר הזגגבידוד שירי רטהפרדת שלבי אמלובלסטיםאמלובלסטים בשלב ההפרשהאמלובלסטים בשלב ההבשלהבדיקות אימונוהיסטוכימיהפרוטוקול מיצוי RNAאנליזת Western Blottingחשיפה ל-BPA פלואורידצביעת Trichrome Masson
ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.