המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע
מאמר שיטה
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע
שלד התא, המורכב אקטין שמתרגם microtubules, חוטים ביניים (אם), ממלא תפקיד מרכזי בשליטה על צורת התא קוטביות, תנועתיות. הארגון של רשתות אקטין, microtubule נחקרה בהרחבה, אבל זה של IFs לא עדיין במלואו מאופיין. אם יש קוטר ממוצע של 10 ננומטר וטופס רשת חובק הציטופלסמה של התא. הם קשורים פיזית עם אקטין, microtubules דרך המנועים המולקולריים, cytoskeletal linkers. חזק זו בלב מנגנוני הרגולציה להבטיח ברגולציה מתואמת של שלוש הרשתות cytoskeletal הדרושים עבור רוב הפונקציות התא. לכן חשוב להמחיש IFs לבד וגם עם כל אחד cytoskeletal הרשתות האחרות. עם זאת, אם רשתות הן וצפופה רוב סוגי תאים, במיוחד בתאי גליה, מה שהופך את הרזולוציה שלה מאוד קשה להשיג עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה (לרוחב ברזולוציה של ~ 250 ננומטר). ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ (dSTORM) היא טכניקה המאפשרת רווח רוחבי ברזולוציה של סדר גודל אחד. כאן, אנו מראים כי dSTORM הלטראלי הרזולוציה מספיקה לפתור הארגון צפופה של הרשתות אם ושל, בפרט, אם חבילות סביב microtubules. איגוד חזק כזה סביר להניח להשתתף בוויסות מתואמת של שתי רשתות אלה מאי, להסביר איך vimentin IFs תבנית לייצב את הארגון microtubule וכן יכולת להשפיע microtubule תלויים vesicular סחר. באופן כללי יותר, אנו מראים איך התצפית של שני רכיבים cytoskeletal בטכניקה בצבעים dual dSTORM מביאה תובנה חדשה שלהם אינטראקציה הדדית.
Cytoplasmic ביניים (IFs) זיריהם nm 10-קוטר הומו - או heteropolymers של קבוצת תאים סוג משנה ספציפית של אם חלבונים. IFs להשתתף מגוון רחב של פונקציות הסלולר כגון תגובות תנועתיות, התפשטות, מתח התא. תפקידם מפתח מודגשת על ידי העובדה כי מחלות אנושיות יותר מ-90 נגרמות ישירות על ידי מוטציות בחלבונים אם; למשל, שינויים בהרכב אם מלווה בצמיחה הגידול והפצת1,2,3. שם גדל ראיות שלוש מערכות שלד התא לעבוד בשיתוף פעולה כדי הפונקציות הסלולר כגון תא קיטוב, מחלקת ההגירה2,3. מאז יש זוג חזק בין אדריכלות מרחבי פונקציות, זה הכרחי לקבל תובנות בא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. Coverslips הכנה (יום 1, 30 דקות)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מיקרוסקופ מצויד עם 50 mW 405 ננומטר ו- 100 מגוואט 488, 561, 642 nm solid-state לייזרים, EMCCD 512 x 512 מצלמה, אלפא מתכננים Apo 100 X / 1.46 אובייקטיבית, הלהקה לעבור 570-650 / ארוך מסננים פליטה 655 שימשו את התוצאות נציג שיובאו להלן.
איור 1A נותן דוגמא של מולקולה צפיפות, אות לרעש יחס זה אמור לשמש במהלך ייבוא תמונות raw. תמונות באיכות טובה מתקבלים עם מינימום של ~ 1 מיקרומטר בין מולקולות שכנות. בתנאים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
אנו מציגים כאן פרוטוקול אשר ממזערת חפצים של תמונות dSTORM של microtubules, IFs גלייה. חפצים יכולים להיווצר בכל צעד של הכנת הדוגמא, הדמיה: יציבות, חסימת, immunolabeling, להיסחף במהלך הרכישה, בלתי אופטימאליים מהבהב תנאים23. אנחנו ברשימה להלן השלבים הקריטיים ביותר.
ניקוי על coverslips היא צעד חשוב להגביל את הכריכה לא ספציפית של fluorophores על פני השטח, ולכן כדי להגביל את רעשי הרקע בתמונה dSTORM.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
אנו מודים מיכאל Lelek, Orestis Faklaris, ניקולס Bourg לדיון פורה, אנדריי Aristov, אלנה Rensen לעזרה עם טכניקה סופר רזולוציה, דני Seetharaman עבור קריאה זהירה של כתב היד. אנו להכיר בהכרת תודה UtechS BioImaging פוטוני (Imagopole) Citech של מכון פסטר (פריז, צרפת), כמו גם את רשת תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-10-INSB-04; השקעות לעתיד), ולא את Région ile-de-(תוכנית Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) לשימוש של המיקרוסקופ Elyra. עבודה זו נתמכה על ידי הסרטן le ליגה חדר מרווח וחדיש, הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-16-CE13-0019).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדיה חיונית מינימלית (MEM) | Gibco | 41090-028 | תרבית תאים |
| חומצת אמינו לא חיונית | Gibco | 1140-050 | תרבית תאים 1/100e |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | תרבית תאים 1/100e |
| Fœ טל סרום בקר | Gibco | 10270-106 | תרבית תאים 1/10e |
| 0,05% טריפסין-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | תרבית תאים |
| PBS 10x | Fischer Scientific | 11540486 | תרבית תאים |
| 18 מ"מ n° 1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | כיסויים |
| תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) | סיגמא | F8775 | קיבוע תאים |
| גלוטראלדהיד | סיגמא | G5882 | קיבוע תאים |
| טריטון X100 | סיגמא | T9284 | חומר פעילי שטח לא יוני. משמש לקיבוע תאים |
| נתרן בורוהידריד (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | קיבוע תאים |
| BSA | Sigma | A7906 | פסיבציה של דגימה 3% בנוגדנים PBS |
| חד שבטיים נגד וימנטין (V9) המיוצר בעכבר | Sigma | V6630 | נוגדנים |
| ראשוניים עכברוש אנטי אלפא טובולין Biorad MCA77Gנוגדן משני נגד עכברוש עיזים IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Fisher Scientific | 10635923 | נוגדנים משניים נוגדנים משניים |
| נגד עכבר חמור IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 647 | Fisher Scientific | 10226162 | נוגדנים משניים |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 ומיקרו; m, כחול/ירוק/כתום/אדום כהה | פישר מדעי | T7279 | חרוזי פלורסנט |
| תא מגנטי Chamlide | מכשיר תא חי | CM-B18-1 | מחזיק מדגם מגנטי, נפח מקסימלי 1,2 מ"ל |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | עבור המאגר המהבהב |
| גלוקוז אוקסידאז מ-Aspergillus niger | Sigma | G0543 | עבור המאגר המהבהב |
| גלוקוז | סיגמא | למאגר המהבהב | |
| קטלאז מכבד בקר | סיגמא | C9322 | למאגר המהבהב |
| טריס (טריזמה) | סיגמא | T1503 | למאגר המהבהב |
| מתלה כיסוי Wash-N-Dry | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | סרט פרפין |
| מנקה קולי | פישר מדעי | 15-335-6 | |
| מנקה פלזמה | האריק פלזמה | PDC-32G-2 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה