Method Article

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

DOI:

10.3791/57092

⸱

December 12th, 2017

 , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors ומחקרים מבניים מכוון הבהרה של הבסיס המולקולרי של ליגנד יחודיות ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של כמויות מיליגרם של ליגנד טהור, מקופל מחייב תחומים. ניסיונות heterologously אקספרס ליגנד periplasmic דומיינים איגוד של חיידקי chemoreceptors ב Escherichia coli (e. coli) לעיתים קרובות התוצאה שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה. . הנה, שיטה מוצג להתאוששות חלבון הכללה גופות, שלה refolding, טיהור, המחשבים איגוד ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni (ג jejuni) chemoreceptor Tlp3 כדוגמא. הגישה כרוך הביטוי של החלבון עניין עם cleavable שלו6-תג, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של גופים הכללה, חלבון refolding על ידי דלדול שתנן, טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה ואחריו כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג. ספקטרוסקופיית קיווטות משמש כדי לאשר במצב מקופל של החלבון הטהור. זה הוכח, פרוטוקול זה שימושי בדרך כלל לייצור כמויות מיליגרם של dCACHE ליגנד periplasmic מחייב תחומים של אחרים chemoreceptors חיידקי בטופס מסיסים ו crystallisable.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימוטקסיס, תנועתיות הוכחו תפקיד חשוב בפתוגנזה קמפילובקטר jejuni באמצעות קידום colonisation חיידקי ופלישה של מארח1,2,3. כימוטקסיס מאפשרת לחיידקים לנוע לעבר סביבה אופטימלית עבור הצמיחה, המונחית על ידי אותות כימיים. תהליך זה דורש הכרה תאיים וסביבתיים סימנים כימיים על ידי קבוצה של חלבונים כינה chemoreceptors, או חלבונים דמויי מתמר (הניתוח). רוב chemoreceptors הם חלבונים ממברנה-מוטבע עם ליגנד extracytoplasmic מחייב תחום (LBD), תחום transmembrane, תחום האיתות cytoplasmic, הצופות על אינטראקציה עם החלבונים האיתות cytosolic המעבירים את האות מנועים השוטוניים4,5,6,7.

11 chemoreceptors שונים זוהו ב4,הגנום ג jejuni 8. עד כה, רק חלק chemoreceptors האלה יש אפיינה וידוע יחודיות ליגנד של Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712Tlp1113 . זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors הנותרים של מין זה, chemoreceptors רבים של חיידקים אחרים, ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של chemoreceptor רקומביננטי, מקופל וטהור מאוד LBDs14, 15 , 16. עם זאת, ניסיונות להביע heterologously את LBDs periplasmic של chemoreceptors חיידקי ב- Escherichia coli , לעיתים קרובות לגרום שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה17,18,19 . למרות זאת, תופעה זו יכולה להקל על קל בידוד ושחזור של החלבון ביד. כאן, שיטה מוצג שחזור חלבון מגופים הכללה, refolding, טיהור, כדוגמא את LBD periplasmic של chemoreceptor ג jejuni Tlp3. דוגמה זו נבחרה משום Tlp3-LBD שייך משפחתי dCACHE20 של תחומים חישה המצויים בשפע שני היסטידין kinases ו chemoreceptors אאוקריוטים20,21, 22 , 23.

בגישה זו, הביטוי הבונה, בהתבסס על וקטור pET151/D-טופו, תוכנן לשלב N-מסוף שלו6-תג ואחריו טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז המחשוף באתר, לקבלת תג עוקבות הסרת19. הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון ב e. coli, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של הכללה, וגופי חלבון refolding על ידי דלדול אוריאה. בעקבות refolding, המדגם מטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה עם כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג אופציונלי. המדינה מקופלת של החלבון מזוכך הוא אישר באמצעות קיווטות ספקטרוסקופיה. זה גירסה שונה של השיטה פותחה בעבר כדי לשחזר ולטהר את LBD של chemoreceptor שונים, הליקובקטר פילורי TlpC19. הליך זה, המסוכם איור 1, מניב 10-20 מ"ג של Tlp3 טהור, לא מתויגות-LBD לכל 1 ליטר של התרבות חיידקי, עם חלבון טוהר > 90% כפי שנאמדו על ידי עמודים מרחביות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי של שלו6-Tlp3-LBD ב e. coli

  1. לחסן 150 מ ל מרק לוריא-Bertani (LB) סטרילי המכיל אמפיצילין-1 מ"ל µg 50 עם BL21-Codon-פלוס (DE3) - תאים RIPL הפך עם וקטור pET151/D-טופוגרפיה להבעה של שלו6- Tlp3-LBD (חומצת אמינו שאריות 42-291), ו דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר (קוטר אורביט, 25 מ מ) עם סל"ד 200 בן לילה.
  2. להכין 2 ל' 6 Erlenmeyer מבחנות המכילות 800 מ ל ציר סטרילי LB ו- 50 µg מ ל-1 אמפיצילין. לחסן את הבקבוק כל 20 מ של התרבות לילה המתקבל שלב 1.1. דגירה אותם ב 37 ° C עם לרעוד רציפה ב 200 סל ד עד הצפיפות האופטית-600 nm מגיע ל 0.6.
  3. קח 1 מ"ל aliquot מאחת המבחנות (שליטה uninduced לדוגמה), גלולה באמצעות צנטריפוגה benchtop (13,000 x g, 4 ° C, 10 דקות) וזורקים את תגובת שיקוע. חנות בגדר חיידקי ב-20 ° C לניתוח מרחביות-דף עוקבות.
  4. זירוז ביטוי חלבונים על-ידי הוספת 1 מ מ איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) כל הבקבוק עם התרבות. המשך המקננת המבחנות בטמפרטורה 37 ° C ב שייקר ב 200 סל ד במשך 4 שעות נוספות.
  5. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב g x 5,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
    הערה: בשלב זה, ההליך ניתן להשהות על-ידי הצבת בגדר תא בפריזר-80 ° C עבור אחסון.

2. בידוד, דנטורציה של הכללה גופות

  1. להעביר את כל החבילות תא שהושג בשלב 1.5 כדי גביע 250 מ ל, להוסיף 100 מ של מאגר A (10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, 150 מ מ NaCl). לאפשר את התאים להפשיר לחלוטין (אם קפוא), resuspend בגדר. שמור את הדגימה על קרח אלא אם צוין אחרת.
  2. עוברים את התאים resuspended דרך homogeniser בלחץ גבוה שלוש פעמים lyse התאים ולהבטיח הטיה מלאה של הדנ א הגנומי.
  3. Centrifuge את lysate ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. לאסוף דוגמה 1 מ"ל של תגובת שיקוע (שבר מסיסים) ואחסן אותו ב-20 ° C לניתוח מרחביות-דף עוקבות. למחוק את שאר תגובת שיקוע ומניחים בגדר על קרח.
    הערה: גלולה זו היא בצבע לבן (להבדיל בקלות בין תאים רצופה אשר הגוון של בראון בצבע) מכיל גופים הכללה.
  4. Resuspend בגדר הכללה גופות ביסודיות ב- 20 מ של המאגר הקר B (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, פלואוריד phenylmethanesulfonyl 0.2 מ מ (PMSF), 1% טריטון X-100). זה מקל על solubilisation של הממברנה, קרום חלבונים. מערבולת למשך 1-2 דקות לסייע resuspension.
  5. Centrifuge הדגימה ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
  6. Resuspend בגדר ביסודיות ב- 20 מ של המאגר הקר B על ידי vortexing צינור דק 1-2. ודא כי בגדר שבור לחתיכות קטנות. Pipet המדגם למעלה ולמטה כדי לסייע resuspension גלולה.
    הערה: חשוב resuspend בגדר ביסודיות כדי להשיג הכללה גופות חינם מפני זיהומים.
  7. חזור על שלב 2.5. אם תגובת שיקוע מעוננים או צבעוני, חזור על שלבים 2.6 ו 2.5 (לפי סדר זה) עד תגובת שיקוע הוא ברור חסר צבע וטעם.
  8. Resuspend בגדר ב- 20 מ של המאגר הקר C (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 0.2 מ מ PMSF) על ידי vortexing ברכבת התחתית למשך 1-2 דקות.
  9. חזור על שלב 2.5.
  10. להוסיף 25 מ ל המאגר הקר denaturing D (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, שמונה מ' אוריאה, 10 מ מ dithiothreitol (DTT), 0.2 מ מ PMSF) להתמוסס בגדר הכללה גופות. Resuspend ביסודיות על ידי vortexing 1-2 דקות, או עד בגדר שבור לחתיכות קטנות.
  11. לערבב את המתלים שסיבוב צירית עם קצב הסיבוב של סל ד 30 30-120 דקות ב 4 º C.
  12. להבהיר את הפתרון שפגע בסימני חלבונים על ידי צנטריפוגה ב g 30,000 x, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מניחים את תגובת שיקוע על הקרח וזורקים בגדר.
  13. מודדים את ריכוז חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד. 24 . קח את aliquot לניתוח מרחביות-ג'ל ולמקם אותו ב-20 ° C.
    הערה: בשלב זה, ההליך ניתן להשהות על ידי snap-הקפאה של הדגימה aliquoted של חנקן נוזלי ולשמור אותו ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון.

3. חלבון Refolding

  1. להכין 250 מ של מאגר E (3 מ' אוריאה, 100 מ מ טריס-HCl pH 8.0, monohydrochloride L-ארגנין 0.4 M, L מופחת מ מ 20-גלוטתיון, 2 מ מ מחמצנים L-גלוטתיון) בתוך 500 מ"ל. ומגניב המאגר עד 4 ° C.
  2. להוסיף 60 מ"ג חלבון שפגע בסימני תערובת המכילה שלו6-Tlp3-LBD שהושג בשלב 2.13 ל-250 מ"ל של מאגר אלקטרוני, תוך כדי ערבוב את המאגר במהירות של 500 סל ד. דגירה המיקס refolding ב 4 ° C עם ערבוב רציף ב 500 סל ד במשך 24-48 שעות. ריכוז החלבון הסופי בשלב זה היא 0.2 מ ג מ ל-1.
  3. להכין 7 לליטר מאגר A בדלי L 8-10, תירגע עד 4 ° C לקראת השלב הבא (שלב 3.4) אשר יתקיים ב- 24-48 שעות (ראה תרשים הזרימה באיור1).
  4. לטבול המניח פיסת ~ 50 ס מ דיאליזה אבובים מקוטר המנופח 28 מ מ, עם משקל מולקולרי ניתוק ב 12-14 kDa לתוך 200 מ ל 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic ניתרן חומצת מלח (EDTA-נה2) וחום זה מעל להבה גז עד רתיחה. יש לשטוף קרום דיאליזה עם 200 מ של ddH2O.
  5. תהדק את קצה אחד של קרום דיאליזה עם סגר אבובים דיאליזה והעבר 250 מ ל refolding תערובת שהושג בשלב 3.2 לתוך הצינור דיאליזה. סגור את הקצה הפתוח עם מלקחיים. לבדוק את התקינות של קרום כדי להבטיח שישנן אין דליפות.
  6. מקם את הצינור דיאליזה דיאליזה דלי עם L 7 טרום מקורר מאגר א מוכן בשלב 3.3. במקום למהומה מגנטי בר, המבטיח כי זה לא תיגע הצנרת דיאליזה תוך כדי ערבוב.
  7. Dialyse הדגימה ב 4 ° C עם המשך ערבוב במהירות של 500 סל ד ולשנות את המאגר לפחות ארבע פעמים על פני תקופה של 12 שעות. לאחר השינוי מאגר האחרון, להשאיר את הדגימה כדי dialyse בין לילה.
    הערה: במהלך דיאליזה, עודף של אוריאה (~ 3 ז) בהדרגה יוסר מה הפתרון שפגע בסימני חלבון, אשר מאפשר החלבון לקפל. משקעים כבדים חלבון יכול להיות שנצפו בקצה של דיאליזה.
  8. הסר את הצינור דיאליזה מהדלי, להעביר את תוכנו לתוך גביע 500 מ"ל. שמור את הפתרון חלבון על קרח, אלא אם צוין אחרת.
  9. לסנן את הפתרון חלבון דרך קרום גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.43 לתוך בקבוק זכוכית 500 מ"ל כדי להסיר כל חלבון precipitated.

4. טיהור של שלו6-מתויג חלבון באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מקובעת יון מתכת

  1. לחייב, equilibrate עמודה chelating prepacked מ.
    1. לחבר את העמודה משאבה סחרור, ולהבטיח שאין אין אוויר לכוד בתוך הצנרת המחברת.
    2. לשטוף את העמודה על ידי עובר דרך 25-50 מ ל- ddH2O.
    3. גובה העמודה על-ידי טעינת 3 מ"ל של 0.1 M NiCl2 , ואז עובר מ 25 ל- ddH2O.
    4. Equilibrate את העמודה עם 25 מ של מאגר F (טעינת מאגר, 20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 500 מ מ NaCl, imidazole 20 מ מ).
  2. התאם את הדגימה חלבון refolded שהושגו בשלב 3.9 להרכב של מאגר F על-ידי הוספת 2.5 מ של 1 מ' טריס-HCl pH 8.0, 25 מ של 5 M NaCl ו- 2.5 מ של 2 מ' imidazole מלאי פתרונות.
  3. לטעון את הדגימה אל העמודה שיעור של 5 מ ל/דקה או פחות, להשליך הזרימה דרך (חלבונים לא מאוגד).
  4. לשטוף את העמודה עם 50-100 מ של מאגר F כדי להסיר חלבונים הלא ספציפית מאוגד ולמחוק את הזרימה דרך.
  5. Elute שלו6-Tlp3-LBD 25 מ ל מאגר G (מאגר • תנאי, 20 מ מ טריס-HCl, 500 מ מ NaCl, imidazole 500 מ מ), ביליארד שברים זרימה דרך המכיל החלבון (כפי שנקבע על-ידי שימוש הכימית ברדפורד).
  6. מודדים את ריכוז חלבון במדגם במאגר באמצעות וזמינותו ברדפורד. קח קטן aliquot עבור ניתוח מרחביות-דף ומקום ב-20 ° C.

5. שלו6-תג הסרה באמצעות אס פרוטאז (אופציונלי)

  1. היכונו, מגניב עד 4 ° C, 4 L מאגר H (מאגר המחשוף אס, 10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 1% (v/v) גליצרול, 2 מ מ DTT).
  2. חותכים כ 5-7 ס מ של דיאליזה אבובים (בקוטר 2-3 ס מ), לטבול אותו ב- 200 מ של ddH2O.
  3. להוסיף את6-מתויג פרוטאז אס שלו6-תג חלבון המבושלות צעד 4.5 יחס מולרי סופית אס 1: 8 חלבון.
  4. תהדק את קצה אחד של הצנרת עם סגר אבובים דיאליזה ולמלא את זה עם התערובת פרוטאז חלבון/אס. לסגור את הקצה השני ולהבטיח שישנן אין דליפות.
  5. המקום בדיאליזה צינור לתוך טרום מקורר 4 L מאגר H (מתוך שלב 5.1), דגירה זה ב 4 ° C עם רציף זע עבור 2 ח' שינוי המאגר ולהמשיך דיאליזה למשך הלילה כדי לאפשר את התגובה המחשוף בתיווך אס להשלים.
  6. בינתיים, להכין, מגניב (4 ° C) 4 L מאגר אני (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 1% (v/v) גליצרול) לקראת היום הבא.
  7. לאחר לילה בדיאליזה, להחליף את המאגר למאגר שהכנתי בשלב 5.6 ו dialyse עבור ה 1-2 נוספות ב 4 º C.
  8. הסר את הצינור בדלי דיאליזה, להיפרם קצה אחד של הצינור ולהעביר הפתרון חלבון ל 50 מ ל בז שפופרת. לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק 0.43 µm גודל הנקבוביות ולשמור אותו בקרח, אלא אם צוין אחרת.
  9. למדוד את עוצמת הקול של המדגם ולהתאים את הריכוז טריס, NaCl, imidazole להרכב של מאגר F (למשל עבור 25 מ של חלבון פתרון מאגר J להוסיף 0.25 mL של מ' טריס-HCl 1 pH 8.0, 1.75 מ ל 5 M NaCl, ו 0.25 mL של 2 מ' imidazole).
  10. להכין עמודה HiTrap Chelating HP 5 מ"ל כפי שמתואר בשלב 4.1.
  11. לטעון את הדגימה אל העמודה (קצב הזרימה: 5 mL/min) לאסוף את הזרימה דרך, אשר מכיל לא מתויגות Tlp3-LBD (שאריות 42-291). חלבון uncleaved, את cleaved שלו6-תג ו שלו6- אס נשמרות על-ידי העמודה.
  12. לשטוף את העמודה עם מאגר מ ל F (טעינת מאגר) כדי לאפשר כל חלבון לא מתויגות זורמת דרך ולאסוף את eluate.
  13. בריכת eluate שהושג בשלבים 5.11 ו- 5.12 ולמדוד את הריכוז של חלבון. קח קטן aliquot ואחסן אותו ב-20 ° C לניתוח עמוד מרחביות.

6. גודל-הדרה כרומטוגרפיה (ג'ל סינון) של Tlp3-LBD

  1. להכנת 1 ליטר של מאגר A (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl) ולסנן אותו באמצעות מיקרומטר 0.43 קרום.
  2. Equilibrate עמודת גודל-הדרה 26/60 עם מאגר A בקצב הזרימה של 4 mL/min.
  3. לרכז את הדגימה חלבון שהושג בשלב 5.13 לאמצעי אחסון של 3-4 מ ל באמצעות 15 מ"ל רכז צנטריפוגלי עם ניתוק kDa 10 (4 ° C, 4,000 x g).
  4. להבהיר את הפתרון חלבונים על ידי צנטריפוגה ב g x 13,000, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להסיר כל חלבון precipitated.
  5. לטעון את הדגימה אל העמודה סינון מראש equilibrated ג'ל 26/60. לבצע בדיקות במאגר A בקצב הזרימה של 4 מ ל לדקה הצג מעקב UV. Tlp3-LBD elutes בווליום השמירה של 210-220 מ. בריכת שברים שיא.
  6. מודדים את ריכוז חלבון. קח קטן aliquot לניתוח עמוד מרחביות.

7. מרחביות-דף ניתוח של הדגימות שנאספו בשלבים שונים של חלבון טיהור

  1. הכנת 1 ליטר מרחביות עמודים הפועלת מאגר (מאגר J), המכיל 25 מ מ טריס, 250 מ מ גליצין pH 8.3 ו- 0.1% (w/v) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות).
  2. הכנת 10 מ"ל של 5 x מרחביות-דף טעינת מאגר (מאגר K), המכיל 0.25 M טריס-HCl ה-pH 6.8, 10% (w/v) מרחביות, 50% (v/v) גליצרול, 1 מ"מ DTT, bromophenol 0.05% כחול.
  3. לאפשר את aliquots שנאספו במהלך השלבים השונים של הטיהור (צעדים 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) להפשיר.
  4. עבור כל דגימה, לערבב את אמצעי האחסון המתאים µg 15 הכוללת חלבונים עם 2 µL של 5 x מרחביות-טעינת מאגר, ולכוונן את העוצמה כדי µL 10 ב- ddH2O.
  5. מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, לסובב אותם ב 10,000 g x עבור 30 s והעברת הדגימות לתוך צינור נקי.
  6. הכן של ג'ל מרחביות-דף, באמצעות הפרדת ג'ל לזיהוי 15% (עבור 5 מ"ל: 2.5 מ ל 30% (w/v) bis-אקרילאמיד, 1.2 מ ל 1.5 M טריס-HCl pH 8.8, 1.2 מ"ל ddH2O, µL 50 10% (w/v) מרחביות, 50 µL 20% (w/v) קירור (APS), µL 3 tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 5% לזיהוי לערום ג'ל (עבור 2 מ"ל: 340 µL 30% (w/v) bis-אקרילאמיד, 250 µL 1 מ' טריס pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, µL 20 10% (w/v) מרחביות, µL 20 20% (w/v) APS, 2 µL TEMED).
  7. להרכיב את המנגנון אלקטרופורזה ולמלא אותו 1 x מרחביות דף הפעלת מאגר לפי ההמלצה של היצרן.
  8. לטעון סימן הפרוטאין. משקל מולקולרי והדוגמאות מוכן בשלב 7.5. לבצע את אלקטרופורזה-זרם קבוע של 25 מא.
  9. להעביר את הג'ל לתוך מיכל, לשטוף אותו עם ddH2O. להוסיף 150 מ"ל של הכחול Coomassie מכתים פתרון המכיל אלכוהול איזופרופיל 25% (v/v), חומצה אצטית 10% (v/v) ו- 0.03% (w/v) R-250 כחול מבריק. הכנס את המיכל על פלטפורמה סיבוב אופקי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף את הג'ל עם ddH2O ומניחים בתוך תמיסת destaining המכילה 5% (v/v) מתנול, חומצה אצטית 7% (v/v). Destain תוך כדי ערבוב באמצעות פלטפורמה סיבוב אופקי עבור 1 h.
  11. תמונה הג'ל, לנתח.

8. מעגלי Dichroism (CD) ספקטרוסקופיה ניתוח של מבנה שניוני של פרוטאין טהור refolded

  1. העברת 0.5 - 1 מ ג של refolded חלבון שהושג בשלב 6.6 לתוך צינור דיאליזה ומניחים אותו בתוך דלי דיאליזה המכיל 5 L מאגר L (50 מ מ סודיום פוספט pH 7.4), precooled עד 4 ° C. Dialyse הדגימה ב 4 ° C עם ערבוב רציף ולבצע שינויים מאגר לפחות 3-4 מעל 2-4 שעות לפני שעזב את הדגימה כדי dialyse בין לילה.
  2. לרכז את פתרון dialysed חלבון מ ג 0.06 מ ל-1 באמצעות ניתוק 10 kDa רכז צנטריפוגלי.
  3. להבהיר את הפתרון על ידי צנטריפוגה ב g x 13,000, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. שיא הקשת CD רחוק-UV המדגם 25 ° c מעל טווח אורך הגל של 200-260 ננומטר באמצעות spectropolarimeter עם קצב סריקה של nm 20 דקות-1. השתמש המאגר דיאליזה כפקד ריק. חזור על הקלטה שהפקידים וצור את הספקטרום בממוצע.
  5. לחשב את התוכן מבנה שניוני מאת deconvoluting התקליטור ספקטרה באמצעות תוכנית CDSSTR של DichroWeb סבר25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי רקומביננטי שלו6-Tlp3-LBD ב e. coli , גרמו בעדות חלבון בגוף הכללה. התשואה ביטוי של 1 ליטר של התרבות חיידקי שחושבו בצעד 2.13 היתה כ- 100 מ ג של שלו6-Tlp3-LBD שהופקד בגופים הכללה. ההליך בידוד חלבון, המתוארים כאן, מאויר איור 1, מורכב solubilisation של גופים הכללה, חלבון refolding, טיהור, באמצעות כרומטוגרפיית זיקה, הסרת תג ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה , ותשואות 10-20 מ"ג של Tlp3 טהור, לא מתויגות-LBD לכל 1 ליטר של התרבות חיידקי.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך פשוט ביטוי, refolding מגופים הכללה של LBD periplasmic של chemoreceptor חיידקי Tlp3 מוצג. הכנה של החלבון הטהור כרוך ביטוי יתר של הגן חיות מחמד פלסמיד-מקודד ב e. coli, טיהור, solubilisation של גופים הכללה, refolding של החלבון denatured, טיהור שלה על ידי בזיקה רצופים ו גודל-הדרה כרומטוגרפיה צעדים. הקלו אוריאה דנטורציה של דילול/דיאליזה-מתווכת ' refolding הם הצעדים הקריטיים בפרוטוקול, אופטימיזציה אשר נדרש לעיתים קרובות כדי להבטיח את renaturation נאות של החלבון שהופקדו הכללה גופות26.

<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ליו יו ג על עבודותיו המוקדמות ההפקה Tlp3-LBD. עורכת דין אחינעם אורבך א מצ'וקה הוא מחויב המחלקה הבינלאומית Admistrativo דה Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS עבור מלגת הדוקטורט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tris baseAMRESCO497
נתרן כלורי (NaCl)MERK MILLIPORE1064041000
AmpicillinG-BIOSCIENCESA051-B
פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)MERCK52332
טריטון x-100AMRESCO694
איזופרופיל ובטא;-D-thiogalactoside (IPTG)אסטרל סיינטיפיק בע"מ
אוריאהאמרסקוVWRC0568
דיתיותרייטולאסטרל סיינטיפיק בע"מC-1029
ל-ארגינין מונוהידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'A5131
ל-גלוטתיון מחוזרסיגמא-אולדריץG4251
ל-גלוטתיון מחומצןסיגמא-אולדריץ'G4376
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
נתרן פוספט מונו-בסיסי (NaH2PO4)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid דיסודיום מלח מיובש (EDTA)אמרסקוVWRC20302.260
אימידזולSIGMA-ALDRICHI2399
גליצרולASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
ניקל כלוריד (NiCl2)SIGMA-ALDRICH339350
גליציןאמרסקוVWRC0167
נתרן דודציל סולפט (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
סולם חלבונים לא מוכתמים, רחב טווח (10-250 kDa)NEW ENGLAND BIOLABSP7703
Amicon Ultracel רכז צנטריפוגלי (Millipore)MERCKUFC901096
50 מ"ל צינור פלקוןFALCONBDAA352070
צינורות דיאליזהLIVINGSTONE INTERNATIONAL PTYדיאליזה
דיאליזה מעור נחשTHERMO SCIENTIFIC™68100
ארוז מראש HiTrap Chelating עמודת HPGE HEALTHCARE LIFE SCIENCES17-0408-01
EmulsiFlex-C5 הומוגניזר בלחץ גבוהAVESTINEmulsiFlex™ - C5
משאבה פריסטלטית P-1GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 עמודת אי הכללת גודל GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES
JASCO J-815 ספקטרופולארימטרJASCOJ-815
AST0487 ' BIOGB0232 צינורות 28989336

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822(2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206(2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862(2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11(2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochemistry. 34 (17), 5773-5794 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemoreceptor Ligand Binding DomainProtein RefoldingInclusion Body SolubilizationUrea Mediated SolubilizationAffinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyCircular Dichroism SpectroscopyHis6 Tag CleavageTEV Protease TreatmentDialysis Buffer Exchange

Related Articles