מאמר שיטה

יבש הדם ולנקודות סרום ככלי שימושי עבור אחסון מדגם להעריך סמנים ביולוגיים לסרטן

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57113

⸱

11 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 3Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 4Department of Oncology, Bugando Medical Center, Mwanza, Tanzania

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה שימושי לאחסון דם היקפיים, סרום/פלזמה עבור ניתוחים במורד הזרם כמו assay אליסה והערכת פולימורפיזם (הסנ פ) של נוקלאוטיד יחיד.

תקציר

איכות דגימת הדם חיונית על מנת להבטיח מדויק במורד הזרם ניתוחים כגון PCR בזמן אמת או אליסה. אחסון נכון של חומרים ביולוגיים היא נקודת המוצא על מנת להשיג תוצאות אמין הדירים. כל דוגמאות יש להתייחס באותו אופן מאוסף דם לאחסון. בהתאם הבדיקות שיש לבצע, דם ואת הדוגמאות סרום לאחסן ב-20 ° C או -80 ° C עד השימוש. דגימות דם/בסרום צריכים להיות גם aliquoted כדי להימנע ההקפאה-מפשיר מרובים. נושא חשוב נוסף הוא התנאים מדגם במהלך המשלוח מן המעבדה אחד למשנהו. אם קרח יבש אינו זמין או המשלוח לוקח יותר זמן מאשר מספר ימים, גישות אלטרנטיביות נחוצים. אפשרות אחת היא להשתמש נייר סינון עבור איסוף דם. כאן, אנו מציעים שיטה לדם, אוסף דגימת נסיוב מנצל מיובשים כתמי דם (DBS) ומייבשים סרום כתמים (DSS). פיתחנו את ההליך כדי לחלץ את הדנ א מ- DBS על הערכה במורד הזרם של כמה פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) על-ידי בזמן אמת PCR. אנחנו גם אופטימיזציה של assay אליסה החל מחלבונים eluted מ- DSS. ניתן להשתמש בשיטה זו עם אליסה מבחני או נהלים להערכת חלבונים אחרים.

מבוא

המטרה העיקרית של המחקר לתוך סמנים ביולוגיים לסרטן הוא הזיהוי של פרמטרים ביולוגי חדש שניתן להשתמש בהם לצורך אבחון, על נבואה פרוגנוזה החולה ועל לקביעת אם החולה יגיב טיפול מסוים. אזור זה מחקר בסיסי בזכות הגילוי של טיפולים חדשניים בסרטן, ממלא תפקיד מרכזי בטיפול המותאמים.

ההליכים שבוצעו במהלך כל שלב של סמן זיהוי ואימות חייב להיות אמין לשחזור. אבן היסוד להצלחת המחקר translational הוא אחסון נכון של דגימות ביולוגיות כגון דם בסרום. זהו הצעד הראשון לקראת קבלת חומר ביולוגי באיכות גבוהה יכול לשמש לביצוע ניסויים בביולוגיה מולקולרית או מבחני חלבון.

לעתים קרובות נדרשים מחקרים multicenter לגייס מספיק מטופלים כדי לקבל נתונים. לא כל המוסדות מסוגלים לאחסן דגימות ב-80 מעלות צלזיוס או לשלוח דוגמאות למרכזי בינלאומיים אחרים בתוך קרח יבש. השימוש של נייר סינון עבור איסוף דם הוא שיטה פשוטה לאחסון דם, סרום, לא דורשת על הקפאת מיידית של דגימות1,2. טיפה של דם או סרום ניתן הבחין על הנייר, הוריש בן לילה יבש ולאחר מכן מאוחסן עד 14 ימים בטמפרטורת החדר1,2. זה נותן חוקרים הזמן לשלוח הדגימות למעבדות אחרות. השימוש של דם יבש יבחין (DBS), כתמים יבשים סרום (DSS) יכול ובכך לפשט את שיתוף הפעולה בין מוסדות במדינות מפותחות ומתפתחות.

בהתחשב קלות השימוש, DBS הדגימה הוא בשימוש נרחב מספר סוגים של מבחני עבור ניתוחים במורד הזרם סרולוגית או גנטי. לדוגמה, בעבר, DBS שימשו לעתים קרובות ל- HIV הקרנת במדינות מתפתחות1,2,3,4,5. יתרון נוסף של שיטה אחסון זו הוא כי ניתן לאסוף דגימות דם מן האצבע דקירות, ובכך מאפשר את השימוש בו עבור הרך הנולד ההקרנה בדיקות- 6,-7,-8. טיפול קל מדגם ואמצעי התחבורה נמצאים עוד יתרונות DBS, במיוחד עבור הדגימות שנאספו באתרים מרוחקים איפה שיש אין ציוד מעבדה. בפרסום הקודם, היינו DBS ו- DSS בדיקת ויטמין D, ויטמין D מחייב חלבון (DBP) בסדרה של חולים קווקזי ואפריקה9. עמיתינו אפריקה לא היו מסוגלים לקבל קרח יבש. כדי להשוות את סמנים ביולוגיים כדי להבין את ההבדלים בשביל ויטמין D בין שתי האוכלוסיות אתני, שיפרנו עוד יותר את ההליך באמצעות דגימות מתאימים מאוחסנים בתנאים רגילים ולא על נייר סינון. לאחר מיטוב ההליך DBS/DSS, היינו יכולים לנתח DBP וויטמין D בנסיוב החולה ב שני גדודים. אנחנו גם הערכה של מספר של נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs) לאחר מיצוי הדנ א דם בשביל אחוזי ומן DBS אפריקאים9. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר באיכות גבוהה דגימות דם לאחסן בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על סוגים שונים של ניתוחים במורד הזרם ועד אליסה מבחני ביולוגיה מולקולרית. מומלץ לשימוש לניהול חומרים ביולוגיים במחקרים multicenter או עבור מרכזי שאין מתקנים תנאי אחסון סטנדרטית. פרוטוקול הבאים מייצג את שיאו של הליכים אלה ממוטבת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דם היקפיים, סרום היו נאספים ומאוחסנים מן התורמים בריאים וחולים שנתן בכתב הסכמה מדעת להשתתף במחקר. פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית על פי סטנדרטים אתיים הניח הצהרת הלסינקי של 1964.

1. דם אחסון ב- DBS

  1. איסוף דגימת דם
    1. לאסוף 3 מ"ל של דגימת דם היקפיים צינור 3 מ עם 5.4 מ ג של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
      הערה: חנות דם היקפיים כמו DBS בהקדם האפשרי ובתוך 8 שעות.
    2. כתוב את מספר קוד המטופל בפינה השמאלית התחתונה של הכרטיס שומר.
    3. Resuspend בקפידה את הדם עם פיפטה 5 מ ל.
  2. דם אכון-DBS
    1. פיפטה, להעביר נקודה אחת של דם (50 µL) על גבי הכרטיס שומר (טבלה של חומרים) עם טיפ µL 50 – 200.
    2. חזור על שלב 1.2.1. כדי סך של 3-5 כתמי דם. למחוק את הטיפ הישן ולקחת אחד חדש עבור כל דם aliquot.
    3. השאירו את DBS לילה יבש בטמפרטורת החדר במצב אופקי מעל משטח פתוח ללא ספיגה, הימנעות שמש ישיר. השאר את הכיסוי של הכרטיס שומר פתוח כדי להקל על דם ייבוש.
      הערה: כל חלקיקים אוויר או אבק במהלך שלב הייבוש זה אינו משפיע על יישומים במורד הזרם.
    4. לאחסן את הכרטיס בטמפרטורת החדר בשקית ניילון עם סופג לחות עד השימוש.

2. DNA החילוץ החל מ- DBS לפי DNA החילוץ ערכת גליון הנתונים (סעיף נקודות דם יבש)

  1. הכנת הדוגמא
    1. השתמש 3 כתמי דם מיובשים מהכרטיס. לחתוך כל אחד המקומות דם יבש מהכרטיס ולהפריד ביניהם מהכרטיס עם פינצטה. חותכים את כתמי דם מיובשים מופרדים לחתיכות קטנות (בקוטר של-1 מ מ).
    2. מניחים את חתיכות קטנות לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
  2. לדוגמה מערכת העיכול
    1. הוסף µL 180 פירוק מאגר 1 המסופק בערכה (טבלה של חומרים) אל הצינור. הוסף 20 µL של Proteinase ק. לא לערבב פירוק מאגר 1 עם Proteinase k לפני pipetting לתוך הצינור 1.5 mL בדם הבחין כרטיס. מערבבים על-ידי vortexing.
    2. הכנס את הצינור thermoincubator, דגירה ב 56 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. אם thermoincubator מצוידת לא מטרף, מערבולת המדגם כל 10-15 דקות לפחות 10 s, מטפל לא לתת את הטמפרטורה של המדגם הקטן. בקצרה centrifuge הצינורות כדי להסיר המכסה טיפות.
  3. לשטוף את שלב
    1. להוסיף 200 µL מאגר פירוק 2 (טבלה של חומרים) ו מערבולת 10 s.
    2. למקם את הצינורות thermomixer או חממה מסלולית מחוממת, דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אם thermoincubator לא מצויד מטרף, מערבולת הדגימות פעם במשך לפחות 10 s, מטפל לא לתת את הטמפרטורה של הדגימות להקטין.
    3. חזור על שלב 2.3.1. להעביר את µL 400 של lysate מהצינור 1.5 מ"ל • תנאי עמודה (טבלה של חומרים). Centrifuge את העמודה ב 6,000 g x עבור 1 דקות.
    4. למקם את העמודה • תנאי לתוך צינור אוסף 2 מ"ל וזורקים את הישן.
    5. להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 1 (טבלה של חומרים), צנטריפוגה 6,000 g x עבור 1 דקות.
    6. למקם את העמודה לתוך צינור אוסף 2 מ"ל וזורקים את הישן.
    7. להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 2 (טבלה של חומרים), צנטריפוגה 6,000 g x עבור 1 דקות.
    8. למקם את העמודה לתוך צינור אוסף 2 מ"ל וזורקים את הישן.
    9. צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 3 דקות לייבש את הקרום.
  4. • תנאי שלב
    1. למקם את העמודה לתוך שפופרת צנטרפוגה החדש של 1.5 mL וזורקים את הצינור אוסף.
    2. במקום 50 µL של מים מזוקקים לתוך המרכז של הקרום. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. Centrifuge הצינור ב x 20,000 g עבור 1 מינימלית לאסוף את eluate ומניחים אותו שוב על המרכז של הקרום.
    4. צנטריפוגה הצינור ב 20,000 x g עבור מינימלית 1 למחוק את הקרום.
    5. מודדים את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    6. מאגר DNA ב-20 ° C עד השימוש.
      הערה: ה-DNA מופק DBS יכול לשמש כדי לבצע ניתוח מספר כגון הסנ פ הערכה PCR בזמן אמת או סנגר DNA רצף.

3. סרום לאחסון DSS

  1. איסוף דגימת דם
    1. לאסוף 7 מ של דם היקפיים בשפופרת 7 mL ללא EDTA. להשאיר את דגימת הדם והקרשה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. כתוב את מספר קוד המטופל בפינה השמאלית התחתונה של הכרטיס שומר.
    3. Centrifuge את דגימת הדם ב x 980 g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: חנות סרום כמו DSS בהקדם האפשרי ובתוך 8 שעות.
    4. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ברכבת התחתית, להעביר אותו צינור 15 מ"ל. Resuspend בקפידה את הדם עם פיפטה 5 מ ל.
  2. סרום אכון ב- DSS
    1. פיפטה, להעביר נקודה אחת של הסרום (50 µL) על הכרטיס שומר. חזור על שלב זה כדי לקבל סך של 3-5 כתמי דם.
      הערה: יש להיזהר מאוד פיפטה בדיוק 50 µL של נסיוב לתוך כל נקודה. סרום צריך ללכת מעבר מן הקו המקווקו של הכרטיס.
    2. השאירו את DSS לילה יבש בטמפרטורת החדר. השאר את הכיסוי של הכרטיס שומר פתוח כדי להקל על דם ייבוש.
    3. לאחסן את הכרטיס בטמפרטורת החדר בשקית ניילון עם סופג לחות עד השימוש. אם האחסון הוא יותר מ-14 ימים, לאחסן את הכרטיס ב-20 ° C.

4. אליסה Assay החל מ- DSS

  1. Elute חלבון מ- DSS.
    1. במידת הצורך, להפשיר בו הם שואפים עבור כל דגימה. חותכים DSS לחתיכות קטנות (בערך בקוטר 1 מ"מ). לשים את החלקים לתוך צינור 1.5 מ עם µL 400 ל- PBS.
    2. לנער את הדגימות בן לילה ב 4 º C.
      הערה: לנער אותם בעוצמה נמוכה. PBS צריך אינם מרטיבים את הכיסוי של הצינור במהלך רועדת.
  2. השתמש את החלבון eluate כמדגם סרום לניתוח גורם חלבון המופרש/גדילה לפי הוראות ערכת דיאגנוסטיקה, לאחר דילולים המתאים.
    הערה: הליך זה עובד היטב עבור זיהוי DBP9. עבור מבחני אליסה אחרים, ייתכן שיהיה צורך צעד אופטימיזציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנחנו ניצלו ההליכים DBS ו- DSS לאחסון דם, סרום בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על האיכות של חומר ביולוגי. איור 1 מראה דוגמה של שומר כרטיס של חלבון ללא דם, לאחר איסוף דם. על מנת לאשר כי האחסון על נייר סינון ואת הליך elute דם אינם מפריעים עם איכות מדגם, ביצענו השוואה עם שיטות אחסון סטנדרטית. אנחנו מופק דנ א 3 דגימות בהתאמה של דם מלא שנאסף צינור 2 מ"ל או המאוחסנים כ- DBS, כפי שדווח במקטע פרוטוקול. SNPs בחמש נותחו על ידי בזמן אמת PCR. הנתונים שהושגו עבור דגימות מתאימי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה חוקר את הפוטנציאל לאחסון דם, סרום על נייר סינון כשאין המעבדות את צוות או תשתיות לצורך הטיפול הנכון של דגימות דם. בפרט, דם מלא או סרום שנאספו צינורות רגיל או על ידי האצבע-שמוק ניתן לאחסן באמצעות שיטה זו, אין צורך להקפיא דוגמיות ב-20 ° C או -80 ° C מיד לאחר איסוף דם. DBS/DSS יכולים להישאר בטמפרטורת החדר עד 14 ימים ללא כל שינוי/נסיוב הדם תקינות. נושא קריטי עבור האחסון היא הנוכחות של לחות אשר משפיע על תכונות החומר הביולוגי יותר מאשר הטמפרטורה. ניתן למנוע בעיה זו על-ידי שימוש בשקיות פלסטיק עם סופג לחות. לחות הופך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות Gráinne טירני לסיוע העריכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כרטיסי חיסכון בחלבון Whatman 903 כרטיס חיסכון בחלבון, 100/pk‎SigmaZ761575שימושי לאחסון דגימות בטמפרטורת החדר לניתוחים במורד הזרם
Falcon Serological Pipettes, 5 מ"לתאי גזע#38003
50-200 ומיקרו; טיפים LStar-LabS1120-8810
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לEppendorf4036-3204
QIAamp DNA microkitQiagen56304זוהי ערכת מיצוי DNA שנועדה לבודד כמויות קטנות של DNA   
Buffer ATL (כלול ב-QIAamp DNA microkit)Qiagenזה מדווח כ-Lysis Buffer 1 בטקסט
Buffer AL (כלול ב-QIAamp DNA microkit)Qiagenזה מדווח כ-Lysis Buffer 2 בטקסט
QIAamp mini elute columnQiagenזה מדווח כעמודה בטקסט
AW1  (כלול במיקרו-ערכת QIAamp DNA)Qiagenזה מדווח כ-Wash Buffer 1 בטקסט
AW2  (כלול במיקרו-ערכת QIAamp DNA)Qiagenזה מדווח כ-Wash Buffer 2 בטקסט
Human Vitamin D BP Quantikine ELISA KitR& מערכות DDVDBP0

מקורות

  1. Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
  2. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
  3. Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
  4. Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
  5. Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
  6. Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).
  7. Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
  8. Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
  9. Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
  10. Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
  11. Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
  12. Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
  13. St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710(2013).
  14. Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAELISA

מאמרים קשורים