Method Article

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

DOI:

10.3791/57139

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנדריטים הן ההשתקפויות מסועף של נוירון, מורפולוגיה דנדריטים משקף סינפטית הארגון במהלך הפיתוח של מערכת העצבים. דרוזופילה זחל עצביים דנדריטים arborization (da) הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה של דנדריטים העצבית ותפקוד גנים בהתפתחות מערכת העצבים. ישנם ארבעה סוגי נוירונים da. השיעור הרביעי הוא שהמורכב ביותר עם דפוס מסעף המכסה כמעט את כל שטח הקיר גוף הזחל. אנחנו קודם לכן שאפיינו את השפעת להשתיק את דרוזופילה ortholog של SOX5 על השיעור הרביעי arborization דנדריטים עצביים המורכבות (NDAC) באמצעות ארבעת הפרמטרים: האורך של דנדריטים, את פני השטח של כיסוי דנדריט, המספר הכולל של ענפים, ואת המבנה מסעף. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה של ניתוח כמותי NDAC, המורכב לנתיחה זחל, מיקרוסקופיה קונפוקלית ושגרות התמונה ניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. תובנות חדשות ההתפתחות העצבית da ומנגנונים הבסיסית שלה לשפר את ההבנה של תפקוד ולספק רמזים אודות הסיבות הבסיסיות של נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנדריטים, אשר ההשתקפויות מסועף של נוירון, לכסות את השדה שמקיף חישה וסינפטית תשומות של הנוירון אחרים1,של הנוירונים2. דנדריטים הם מרכיב חשוב של היווצרות סינפסה ולשחק תפקיד קריטי שילוב תשומות סינפטית, וכן הפצת הגירוי אלקטרוכימי של נוירון. Arborization דנדריטים (da) הוא תהליך שבו נוירונים בצורת הדנדריטים חדשות וסניפים ליצירת הסינפסות חדש. פיתוח, המורפולוגיה של דא, כגון צפיפות סניף ודפוסי הקיבוץ, הם תוצאה של תהליכים ביולוגיים רב שלבי, נמצאים בקורלציה גבוהה תפקוד. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה לניתוח כמותי של המורכבות arborization dendritric עצביים דרוזופילה.

המורכבות של....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ניסיוני

  1. להכין את ריאגנטים הבאים: פוספט של Dulbecco buffered תמיסת מלח (PBS); טריטון X-100; 0.2 PBST % (PBS + 0.2% טריטון X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), מדולל 4% לפני השימוש; סיליקון elastomer בסיס והסוכן ריפוי; antifade הרכבה בינונית (למשל, להאריך זהב); לק....
  2. הכנת הציוד הבא: ניתוח מיקרוסקופ, שניים חדות מלקחיים וזוג מספריים עבור microdissection, מספר סיכות על microdissection, צלחת פטרי להכנת תבשיל לנתיחה, שקופיות מיקרוסקופ, coverslips, מיקרוסקופ קונפוקלי, ו- a מחשב עם מותקנת תוכנת ImageJ פיג'י.

2. הזחלים אוסף

  1. חבר UAS-Sox102F-RNAi זבובים עם UAS-GFP, ממ ק-GAL4 או W1118 פראי ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנדריטים של נוירונים da הודבקו תוויות על-ידי GFP co-overexpressing (UAS-GFP; ממ ק-GAL4) סומא עצבית da ו דנדריטים ובשבילים עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. המורפולוגיה של דנדריטים נוירון da צולמה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 2).

דנדריטים של נוירונים da שנקשרו באמצעות תוכנת ImageJ פיג'י. הקובץ שימש כדי להעריך את אורך דנדריט (איור 3). להחרשת Sox102F בנוירונים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנדריטים זה innervate האפידרמיס הם אזורי קלט של נוירונים, מורפולוגיות שלהם לקבוע כיצד המידע התקבל, מעובד על ידי נוירונים בודדים. פיתוח דנדריט מורפולוגיה משקף ג'ין אפנון של הארגון דנדריט. הנוירון da זחל דרוזופילה של מערכת העצבים ההיקפית הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח דנדריט בגלל: 1) הדמיון פונקציונלי עם יונקים11,12; 2) ארבע הבחנות השיעור מבוסס על מבנה דנדריט11,12; ו- 3) גורמים גנטיים המווסתים מורפוגנזה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ויליאם א אימר לסיוע טכני הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי לקרן תרופה לאלצהיימר [R.E.T], המכון הלאומי לבריאות [R01AG014713, R01MH60009 אל R.E.T; R03AR063271, R15EB019704 ל א. ל.], ואת הקרן הלאומית למדע [NSF1455613 ל א. ל.].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפויDow Corning Corportation3097366-0516; 3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
לק לציפורניים CVS72180
מיקרוסקופ סטריאוNikonSMZ800
מיקרוסקופ קונפוקליNikonEclipse Ti-E
צלחת פטריפלקון353001
מלקחייםDumont11255-20
מספריים Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
סיכות חרקים Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
שקופיות מיקרוסקופ והחלקות כיסויפישר סיינטיפיק15-188-52

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic ArborizationNeuronal MorphologyDrosophila LarvaeConfocal MicroscopyImageJ AnalysisDendrite Length MeasurementSurface Area CalculationBranching Structure AnalysisSOX5 Gene SilencingZ series Imaging

Related Articles