כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים צריך להגיב כראוי חנותם לסביבות משתנות, אשר מושפעים על ידי גורמים שונים של תאים המקיפים אותם. החריץ איתות הוא אחד כזה מכונות מולקולריות חיוני עבור תקשורת לתא, אשר ממלא את תפקידי המפתח בהתפתחות נורמלית של העוברים. מסלול זה כרוכה לתא העברה של מידע מתנדנדות עם מקצבים ultradian, אך למרות ההתקדמות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, זה מאתגר התירי את ההשפעה של אינטראקציות multicellular על ג'ין מתנדנדות דינמיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר optogenetic בקרה ופיקוח בשידור חי דפוסי ביטוי גנים באופן זמני מדויק. שיטה זו חשף בהצלחה תשומות תקופתיים תאיים, המערכת של חריץ איתות entrain תנודות מהותי על ידי תדר כוונון שלב הסטה ברזולוציה תא בודד. גישה זו ישימה על הניתוח של המאפיינים דינמי של איתות המסלולים השונים, מתן פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות multicellular.
מבוא
תקשורת לתא לשחק תפקידים חיוניים המתבנת עובריים בתהליכים התפתחותיים. ב העוברים בעלי. החוליות, המבנים metameric הנקרא somites נוצרות לאורך הציר הקדמי-אחוריים הגוף עם דיוק טמפורלית מדויק תחת השליטה של שעון זמן, קרא את השעון של פילוח1. במהלך תהליך זה, קבוצה של תאים presomitic והמזודרם (PSM) מעת לעת מומרים somites באופן סינכרוני. תהליך זה דורש ביטוי גנים מתנדנדות מסונכרן ויוצרים תאים PSM נעים בשלב של somites אותו. התקופה של ביטוי גנים מתנדנדות היא בסביבות 2-3 h בעכברים, בערך 30 דקות של דג זברה. הפומבית, PSM התאים מאבדים את2,synchrony3, אך כאשר הם צבורים מחדש, הם יכולים לארגן את עצמי, לשחזר א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. דור של שורות תאים יציב על ידי מערכת Tol2
-
Transfect פלסמיד וקטורים (איור 1 א') של מודולים optogenetic מבוססי Tol2 יחד עם וקטור ביטוי transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) לתוך התאים C2C12. בכל השלבים, התרבות תאים בינונית DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס (טבלה 1), בנוכחות 5% CO2, אחרת מסומן.
- לספור תאים trypsinized עם תא-מונה, צלחת 5 x 10 תאים4 C2C12 לכל טוב בצלחת 12-. ובכן, יום אחד לפני תרביות תאים.
- שיתוף transfect μg 0.375 של וקטורים מבוסס-Tol2 optogenetic (pAI177 או pAI218), μg 0.125 של הווקטור מבחר סמים (pAI170) ו- 0.5 μg ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שינינו את בכוכב מערכת11,12, המאפשרת ביטוי גנים צילום-induced בתאי יונקים, במחקר של מתנדים גנטי עם 2 - 3 h תקופתיות. מערכת זו מורכבת משני חלקים: את hGAVPO activator תעתיק צילום-inducible ואת קלטת UAS-יזם כדי לכונן שעתוק של גנים שרירותי של עניין. כדי להאיץ את קינטיקה פועמת צילום-induced גנים, רצף תיקים עשויים בקלטת UAS-יזם הוחלף על ידי מאתר Hes1 3' UTR, אשר מקצר את זמן מחצית החיים mRNA ל 20 דקות ב fibroblasts מאתר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
. הראנו שיטה לשליטה dynamics ביטוי גנים עם תקופתיות של 2-3 h... סרגל הזמן הזה הוא הרבה יותר קצר מאשר אלה במערכות אחרות המקובלת, כולל מערכת ט'-על מערכת בכוכב המקורי. פרמטרים מרכזיים כדי להגיע בזמן ultradian-המאזניים הם מחצית החיים של צילום-induced מוצרים מולקולרית, mRNAs חלבונים. פרמטרים אלה קינטי עשוי תלויים תא סוגים ומינים. עבור כוונון של קינטיקה, החלפת Hes1 3' UTR רצפים עם אחרים הוא ישר קדימה דרך, כי זה אינו משנה את רצפי והפונקציות של חלבונים היעד. מחפשים אחר אחרים 3' UTRs להשיג נחשק פועמת תבניות בפרט תאים עניין, לחיות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמך על ידי JST, פרסטו (מלאכותית), ליבת המחקר אבולוציונית למדע וטכנולוגיה (JPMJCR12W2 (ר. ק)) מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן 26119708 (אינטליגנציה מלאכותית) ו- 16 H 06480 (ר. ק)), מדעי מחקר (א) (יפן החברה לקידום המדע (JSPS) 24240049 (ר. ק)), מדענים צעירים (א) (JSPS H 15 05326 (אינטליגנציה מלאכותית)), ואת מענק של הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים "זריחה חי הדמיה"של MEXT, יפן, פלטפורמה עבור גישות דינאמיות למערכת חיים מ MEXT, יפן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| FACS | בקטון, דיקינסון וחברת | FACSAriaII SORP | |
| מצלמה | אנדור | iKon M-934 | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | IX-81 ZDC | |
| PMT מכשיר | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| תאורת LED כחולה | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Nacalai | 26253-84 | |
| סרום בקר עוברי | סיגמא | 172012 | |
| KRYSTAL24 (צלחת שחורה 24 בארות) | היי-טק | 303012 | |
| D-לוציפרין אשלגן מלח | Nacalai | 20028-24 | |
| מד אור | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| נוגדן HA-Peroxidase שיבוט | רוש | 3F10 | |
| נוגדן נגד אקטין-פרוקסידאז | Wako | שיבוט 2F3 |
מקורות
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells requi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
