בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול היכרות עם ערכת ניסויים לשעבר-ovo חדשים וגישות מודלים פיזיים ללמוד את המכניקה של מורפוגנזה במהלך המוקדמות פיתול המוח העוברי צ'יק.

תקציר

התפתחות באופן מסורתי נלמדת מנקודת המבט של גנטיקה למערכות ביולוגיות, אך החשיבות הבסיסית של מכניקה ב מורפוגנזה מזוהה הופכת יותר ויותר. בפרט, הבחורה עובריים הלב והמוח התחתית, אשר עוברים שינויים מורפולוגיים דרסטי כפי שהם מפתחים, הן בקרב המועמדים הממשלה ללמוד את התפקיד של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה. כיפוף הגחון מתקדמת, פיתול rightward של המוח צ'יק עובריים צינורי יקרה בשלב המוקדם של איברים ברמת משמאל המשווע התפתחות האפרוח. קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, היה מעורב במתן את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. כאן אנו מציגים שילוב של ניסויים לשעבר-ovo חדשים ובאופן פיזי מידול כדי לזהות את המכניקה של פיתול המוח. המבורגר-המילטון שלב 11, העוברים הם קצרו ותרבותית ex ovo (בתקשורת). ה-VM יוסר לאחר מכן באמצעות צינור קפילרי משך. על ידי השליטה הרמה של הנוזל ובאיומים העובר לממשק נוזל-אייר, מתח הפנים נוזלים של התקשורת יכול לשמש כדי להחליף את תפקיד מכני של VM. תיאום הניסויים בוצעו גם לשנות את המיקום של הלב למצוא תוצאות השינוי כיראליות של פיתול המוח. תוצאות של פרוטוקול זה להמחיש את תפקידי היסוד של המכניקה נהיגה מורפוגנזה.

מבוא

ביולוגיה התפתחותית מודרנית המחקר מתמקד בעיקר פיתוח ההבנה מנקודת המבט של גנטיקה מולקולרית^{1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. ידוע כי התופעה הפיזית לשחק תפקיד מרכזי מורפוגנזה, או הדור של ביולוגית טופס^14,15,16,17; עם זאת, מנגנונים מכניים ספציפי של פיתוח נשארים מחקר כלשהו. Flexure הגחוני פיתול rightward של הצינור המוח הפרימיטיבי לאחר המבורגר-המילטון שלב 11 (HH 11)¹⁸ הם שני תהליכים עיקריים שתורמים צורה עוברית לשנות^19,20. בפרט, המנגנון הפיזי שבבסיס פיתוח הכיווניות של המוח העוברי נשאר שהיישום מובן.

פיתול מתחלקים ב צ'יק העובר הוא בין האירועים morphogenetic המוקדם של אסימטריה (Lr) משמאל בפיתוח. כאשר התהליך של אסימטריה L-R הוא מוטרד, מומים מולדים כגון סיטוס אינברסוס, isomerismאו heterotaxia תתרחש²¹.
כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לשעבר-ovo ניסויים^22,23 עם מידול הפיזי כדי לאפיין כוחות מכני במהלך התפתחות המוח העוברי מוקדמת. מטרת השיטה המובאת היא לזהות את הכוחות מכני אחראי פיתול המוח ואת הגורמים המשפיעים על מידת פיתול במהלך התפתחות מוקדמת¹². על סמך התצפית ניסיוני קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, שיערנו כי ה-VM מספק את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. לכן, בשיטה זו, אנו להסיר את החלק של ה-VM שמכסה את האזור במוח כדי לגלות את ההשפעות על פיתול המוח. יתר על כן, השיטה של החלת נוזלים מתח נעשה שימוש כדי לאשר את תפקיד מכני של VM ולספק הערכה של הכוח הדרוש עבור פיתול המוח, אשר לא נעשה בעבר. מדידת הכוחות במהלך מורפוגנזה עובריים הוא משימה מאתגרת. ראוי לציין, במחקר חלוצי, Campàs ועמיתים²⁴ פיתח שיטה לכמת את הלחצים הסלולר באמצעות microdroplets מוזרק. עם זאת, שיטה זו הייתה מוגבלת למדידת כוחות ברמה התאית, ולכן לא ניתן ליישום כדי לחקור את הכוחות על רקמות או אורגניזם-ברמת. פרוטוקול הציג נייר זה פותחה כדי חלקית למלא את החלל הזה.

פרוטוקול

1. הכנת תרביות רקמה מדיה

1. השתמש בקבוק חצי ליטר בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) עם גלוקוז 4.5 g/L, סודיום ביקרבונט-גלוטמין כבסיס לתקשורת תרבות.
2. ב תא סטרילי למינארי, להוסיף 10 מ של אנטיביוטיקה חצי ליטר של DMEM.
3. באמצעות פיפטה סטרילי, להעביר צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל 50 מ של הפתרון אנטיביוטיקה DMEM.
4. להוסיף 50 מ של נסיוב החתיכה הפתרון אנטיביוטיקה DMEM שנותרו בבקבוק 0.5 L בשכונה סטרילי.
5. לאחסן הפתרון הסופי (המכונה מכאן והלאה צ'יק תרבות המדיה [CCM]) ב- 50 מ ל aliquots צינור חרוטי ב-20 ° C.

2. דגירה

1. שימוש עדין מגבונים עם 70% אתנול לנקות מופרית ספציפי פתוגן-חופשית לגהורן לבן ביצי תרנגולת. לארגן ביצים כיוון האורך על מחזיקי.
2. הפעל אינקובטור ביצים להגדיר יעד לטמפרטורה של 37.5 ° C ולשמור על הלחות ב 48-55%. הלחות נשלטת על-ידי הוספת כמות מספקת של מים החממה.
3. דגירה הביצים HH11-13, כ 40-44 h.
4. תן שהביצים להתקרר בטמפרטורת החדר במשך כ- 15-30 דקות לפני הריסוס/ניקוי עם 70% אתנול.

3. משוך נימים זכוכית

1. הר של צינורות קפילר באורך ס מ זכוכית 10 עם הקוטר החיצוני של 1.0 מ מ, של הקוטר הפנימי של 0.5 מ מ- פולר micropipette.
2. הגדר את החום ומשוך פרמטרים 750, 400, בהתאמה. לחץ על לחצן משיכה כדי לגרור את צינור קפילרי מחטים דק.

4. נייר סינון הספק שיטה

1. חותכים עיגולים של 3 ס מ קוטר מסנן נייר.
2. חותכים מלבן בערך 1 ס מ על ידי 2 ס מ מן המעגל באמצעות צעצועים. הקפד להסיר כל בולטות או פינות חדות.

5. העובר קציר והכנות

1. לפצח את הביצים מלמטה, להפריד את הקליפה בעדינות, היטב להפקיד תוכן לתוך צלחת פטרי 150 מ"מ x 15 מ"מ. כדי להבטיח שהצד העובר קורה, לשמור את הביצים באותו הכיוון שהם היו מתפשט תוך פיצוח אותם.
2. הסר את אלבומין דק בעזרת פיפטה חד פעמיות של פסטר.
3. להפריד את אלבומין עבה החלמון באמצעות מלקחיים שהסתיימה בוטה. ודא כי אלבומין עבה הוסר על ידי גירוד בקלילות העליון של החלמון עם המלקחיים שהסתיימה בוטה.
4. להשתמש מלקחיים שקצהו הקנס מרכז ולמקם טבעת נייר סינון על העובר, התאמת לציר הארוך של הטבעת עם הציר הארוך של העובר.
5. חותכים את החלמון המקיפים את הטבעת נייר סינון עם מספריים.
6. למשוך את הטבעת ואת העובר את החלמון אלכסוני לכיוון האתר שבו החלמון תחילה נחתך.
7. יש לשטוף את העוברים בתוך שתי מנות 100-מ מ רציפים עם טמפרטורת החדר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS).
8. במקום הראשון טבעת נייר סינון לתוך צלחת פטרי 35 מ מ. אז במקום הצד הגבי העובר על גבי נייר הסינון כבר בצלחת פטרי 35 מ מ.
9. במקום טבעת נירוסטה על גבי נייר סינון הכריך. ודא שלא יגרמו נזק העובר.
10. להוסיף 3 מ"ל של CCM מוכן קודם לכן כל צלחת פטרי.
11. להסיר את ה-VM של כל העובר על ידי בקלילות מרמה את המחט נימי משך לרוחב החלק העליון של העובר, פילינג VM משם, החל מהקצה הקדמי (מעל הקדמי), שימשיך מיתר הגב (איור 1 א').
12. מקום 8 35 מ מ צלחות פטרי לתוך צלחת אחת של 150 מ מ זה היה רצוף מים רווי המשימה העדינה מגבונים (כדי לשמור על לחות).
13. המקום הפטרי 150-מ מ לתוך שקית ניילון sealable ואז למלא את התיק עם תערובת גז המורכב 95% O₂ ו- 5% CO₂.
14. לסגור את השקית ולמקם אותו חממה 37.5 ° C.
15. דגירה העוברים עבור h 27 נוספים עד HH15-HH16 (איור 1B).

6. גרימת מתח פנים

1. להסיר את העוברים מן החממה ולהשתמש מערכת אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (אוקטובר) תמונה אותם. שימוש OCT כדי לקבוע את זווית הכיווניות הצינור העצבי (NT) (איור 2).
2. להעביר את העוברים מיקרוסקופ אור והמחש בהגדלה X 10. להשתמש על פיפטה 200 microliter בהדרגה להסיר את 0.2 מ"ל של מדיה הפטרי.
3. קח תמונות brightfield בכל פרק זמן לבחון את ההשפעות של ממשק מדיה-אייר על העובר.
4. להסיר מדיה עד המתח על פני העובר גורם פיתול (איור 1C).
5. תמונה העובר באמצעות מערכת OCT פעם נוספת כדי לקבוע זווית הפיתוליות הסופי להשוואה לשלוט עוברי.  הערה: התמונות ברייט-שדה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. מערכת טומוגרפיה אופטית קוהרנטית עם מיקרוסקופ המצורפת שימש לרכוש אוספי תמונות חתך של העוברים בשידור חי. תמונות היו שהושגו בתחום 3 x 10 מ"מ x 3 מ"מ³ סריקה ולאחר מכן מעובד בתוכנת הדמיה. לבסוף, מודל פיזיקלי התמונות צולמו באמצעות מצלמה דיגיטלית רפלקס יחיד-עדשה.

7. פיזית מידול של כוחות מתח/VM

1. לפתח הגיאומטריה 3D פשוטה הדומה העובר בין 17-HH14 בתוכנה מסחרית דוגמנות (איור 3 א).
2. עיצוב כייר שלילי של הגיאומטריה 3D תירחסמ 3D גרפיקה תוכנה.
3. שימוש במדפסת תלת-ממד נטען עם מ מ 1.75 בוטאדיאן טבעי styrene פילמנט תלת-ממד הדפס מעוצב העובש, בתבנית stereolithographic (.stl).
4. להטיל את התבנית, לערבב את הרכיבים גומי סיליקון של אלסטומר A ו- B בחלקים שווים, יוצקים את התערובת לתבנית באופן מיידי; הגדר את עובש הליהוק לרפא בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות (איור 3B).
5. סמן את מודל פיזיקלי של העובר לאורך NT בצד הגבי להמחיש פיתול.
6. השתמש coverslip כדי לשכפל את כוח להחיל על דגם התלת-ממד פיזי אשר מחקה את זה של VM או מתח (דמות תלת-ממד).
7. הכנס של סדרת נוקשה חוטים באורך שווה לצד של המודל הפיזי. לאחר coverslip מפעילה כוח חיצוני על המודל המוח, החוטים להיות מוטה בזווית תלוי במיקום. לקבוע את זווית הסיבוב על ידי arctan של אורך המוקרנת על אורך כל חוט (איור 3E) המקורי.

8. שינוי הכיוון של הלולאה הלב

1. בצע את השלבים ב 3.1 ו- 3.2 לקבל צינור קפילרי משך.
2. בצע את השלבים ב- 5.1 דרך 5.10 להכין את העובר.
3. השתמש זוג מלקחיים כדי להפוך נייר הסינון כך העובר הופכת הגחוני /-צד-up.
4. השתמש את צינור קפילרי משך לחתוך חתך ממברנה splanchnopleure (SPL).
5. השתמש את צינור קפילרי להפעיל כוח מכני כדי לדחוף את הלב מן הצד הימני בצד שמאל.
6. בצע את השלבים ב- 5.12 דרך 5.15 כדי לבחון את השינוי שחל פיתול.

תוצאות

במחקר זה, ה-VM של העובר-HH11 הוסר מהקצה הקדמי כדי flexure בית החזה. העוברים היו עם תמונה באמצעות מערכת OCT. בשלב זה, פיתול המוח צינור לא התחיל (איור 1 א'). לאחר להיות מודגרות עד HH15-16, העוברים עם שלהם VM הוסר הציג פיתול המוח מופחתת שפופרת, כ-35 מעלות (איור 1B) לעומת שליטה עוברי, אשר מוצג פיתול של בסביבות 90 מעלות. כאשר רמת התקשורת הונמך לזירוז מתח בצד הגבי של העוברים עם המכונה הוירטואלית שלהם הוסר, המוח המעוות ברמות דומות לאלה ...

דיון

בעוד פיסיקליות לשחק תפקיד אינטגרלי מורפוגנזה^{26,27,28,29,30}, למנגנונים מכאניים הספציפיים, יחד עם קואורדינציה של מכונות, המנגנונים המולקולריים, להישאר נחקרו במידה רבה. זה ידוע כי flexure הגחוני של פיתול rightward של המוח הפרימיטיבי הם שני תהליכים המרכזית שתורמים תחילת מורפוגנזה עובריים^18,31,

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מופרית ספציפית ללא פתוגן ביצי עוף לבן לגהורן	צ'ארלס ריבר
אופטי קוהרנטי טומוגרפיה מיקרוסקופ	Thorlabs	GAN220C1
אלסטומר סיליקון	Smooth-On, Inc.	EcoFlex 00-50
מיקרוסקופ מנתח	Leica	MZ8
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)	לונזה	12-604F
אנטיביוטיקה	סיגמא	P4083
סרום אפרוח	סיגמא	C5405
חולץ מיקרופיפטה	מכשיר סאטר דגם P-30
נייר סינון	Whatman	5202-110
פוספט חוצץ מלח (PBS)	קורנינג	21-040-CV
Comsol MultiPhysics	Comsol
תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית	Rhino 5
מיקרוסקופ מחובר ל-OCT	Nikon	FN1
מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת	EOS	מורד T3i