גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

Summary

הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים.

Abstract

הקפסולה רב-סוכר של קריפטוקוקוס neoformans היא הגורם העיקרי התקפה אלימה ולמד ביותר בדרך כלל ההיבטים של שמרים החולני הזה. גודל קפסולה יכולה להשתנות בין זנים, יש את היכולת לצמוח במהירות כאשר הציג בפני תנאים מזין מלחיץ או נמוך, יש כבר בקורלציה חיובית עם זן התקפה אלימה. מסיבות אלו, הגודל של הקפסולה הוא עניין רב לחוקרים neoformans ג . הצמיחה של הקפסולה ג neoformans הנגרמת במהלך הבדיקה פנוטיפי כדי לעזור להבין את ההשפעות של טיפולים שונים על שמרים או גודל ההבדלים בין זנים. כאן נתאר באחת השיטות סטנדרטי של קפסולה אינדוקציה והשווה שני המקובלים שיטות של צביעת ומדידת קוטר קפסולה: אינדיה אינק (i), כתם שלילי, בשימוש יחד עם מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו (ii) שיתוף מכתים עם צבעי פלורסנט הן של דופן התא והן את הקפסולה ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, אנו מראים איך מדידה של קוטר קפסולה מדגימות שהוכתמו אינדיה אינק יכול להיות אוטומטי באמצעות ניתוח תמונות חישובית.

Introduction

משפיע על רבע מיליון אנשים כל שנה, וכתוצאה מכך 180,000 יותר מקרי מוות מדי שנה, קריפטוקוקוס neoformans הוא שמרים פתוגניים, תאיים, סוכן סיבתי של cryptococcosis^{1,2, 3}. שנפגעו הם חולי HIV-חיוביות במדינות עניות שאין להם גישה מוכן לטיפול תרופתי, עושים אותם רגישים בחריפות המחלה^4,5,6. נתוני ה-CDC מציינים כי ב אפריקה שמדרום לסהרה, neoformans ג הורג יותר אנשים שחפת מדי שנה, יותר מדי חודש יותר מכל התפרצות אבולה רשומה¹. תוואי החשיפה השכיחה ביותר מתרחשת משאיפת נבגים מיובש השגורה הסביבה⁷. עם כניסתו אל הריאות, ישנם מספר גורמים התקפה אלימה אשר תורמים להצלחת neoformans ג בתוך אנשים נגועים. הקפסולה רב-סוכר נחשבת הגורם של החיידק העיקרי התקפה אלימה, כמו זנים acapsular אינן מידבק⁸.

הקפסולה cryptococcal מורכבת של שלושה מרכיבים עיקרון: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), ו- mannoproteins (MPs)⁹. בעוד MPs הם קלים יחסית רכיב הקשורים דופן התא של הקפסולה, הם immunogenic, יכול לקדם מענה בעיקר פרו דלקתיים^9,10. לעומת זאת, GXM ו GalXM לעשות את החלק הארי של הקפסולה (> 90% לפי משקל) ויש תופעות לדיכוי המערכת החיסונית¹¹. בנוסף השפעותיו immunomodulatory, הגדלה מהירה של ה קפסולה ויוו יוצר מחסום מכני בליעה על ידי המארח תאים phagocytic (קרי, נויטרופילים ומקרופגים)¹². הקפסולה neoformans ג ו הסינתזה שלו הם מורכבים, אבל באופן כללי, הגדלת קוטר קפסולה הוא מתואם עם התקפה אלימה מוגברת^6,13,14. נתון זה, חשוב לחוקרים neoformans ג שניתן יהיה במהירות ובדייקנות לכמת מדידות כמוסה.

תא neoformans ג והן כמוסה רב-סוכר שלה הם מבנים דינמיים ולהראות שינויים לאורך זמן¹⁵. הקפסולה יכול שינוי צפיפות, בגודל הרכבה בתגובה לשינויים^17,1816,סביבת המחשב המארח. ברזל נמוך או רמות מזין, חשיפה סרום, ה-pH אנושי פיזיולוגי ו CO מוגבר₂ ידועים ליזום צמיחה קפסולה^16,18,19,20. יתרה מזאת, חוקרים יש הראו שינויים מבניים וכתוצאה מכך הבדלים משמעותיים immunoreactivity במהלך זיהום, ההלוואות יתרון כדי neoformans ג על המארח שלו^21,22. דבר זה ידוע כי הארכיטקטורה של הקפסולה neoformans ג נותחה במגוון דרכים. מיקרוסקופ אלקטרונים, לדוגמה, חשפה כי הקפסולה יש מטריצה הטרוגנית עם שכבת צפיפות אלקטרונים הפנימית מתחת לשכבה החיצונית, יותר חדיר²³. פיזור אור ושימוש של מלקחיים אופטיים אפשרו החוקרים להבהיר עוד יותר את מאפייני macromolecular²⁴. ניתוח התוצאות של שתי מדידות פיזור אור סטטיים ודינמיים, אנו יודעים כי הקפסולה רב-סוכר יש מורכבות מסעף מבנה²³. מלקחיים אופטיים שימשו כדי לבחון את הנוקשות של המבנה, כמו גם להעריך את תגובתיות של נוגדן²⁴. אולם, ניתוח מועסקים לעיתים קרובות ביותר של הקפסולה neoformans ג הוא מידת גודלו.

כדי לכמת את גודל קפסולה, חוקרים משתמשים מה צריך להיות מדידה פשוטה: הקוטר ליניארי של הקפסולה. מיקרוסקופ דיגיטלי משמשים כדי ללכוד תמונות של neoformans ג מספר תאים (בדרך כלל מאות) צבעונית עם דיו הודו או צבעי פלורסנט. הגודל של כל תא בגוף, כמוסה שמסביב נמדד. הנתונים נאספים, קוטר ממוצע של הקפסולה מחושבת על-ידי חיסור הקוטר לגוף התא של הקוטר התא כולו (תאי גוף + כמוסה). עד לנקודה זו, מדידות אלה נעשו באופן ידני. בעוד בדרך כלל מדויק, בשיטה זו יש חסרונות לחוקרים. ערכות נתונים גדולות יכול לקחת ימים או אפילו שבועות כדי לנתח באופן ידני. כי מדידות אלה נעשים באופן ידני, סובייקטיביות, טעות אנוש משפיעה על התוצאה.

ניתוח אוטומטיות תמונות חישובית הפך כלי הכרחי עבור חוקרים בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית של התא, המאפשר ניתוח מהיר ואמין יותר של תמונות ביולוגי ^25,26,27. טכניקות ניתוח תמונה מדויקת יש צורך לכרות כמותיים של מה הם לעיתים קרובות ערכות נתונים מורכב ועמוק. עם זאת, כמה מדידות, במיוחד את המדידה של הקפסולה ג neoformans , היה קשה להפוך לאוטומטי. זיהוי במדויק את הממשק בין התא לבין קפסולה, אשר בדרך כלל מופיע כעיגול כהה כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, יכול להיות בעייתי לפתור באמצעות סף פשוטה. יתרה מזו, neoformans ג תאים בתרבות נוטים להתאחד ואת פילוח מדויק של התאים הוא הכרחי עבור מדידות מדויקות.

מטרת הפרויקט היתה להמחשת (i) אחד מהפרוטוקולים סטנדרטי עבור אינדוקציה קפסולה ב neoformans ג, (ii) השוואה וחדות אינדיה אינק ולפתח פלורסצנטיות צביעת דגים קפסולת מידות קוטר, (iii) פשוט, שיטות למדידת קוטר הקפסולה באמצעות תמונות של הודו דיו צבעונית תאים באמצעות ניתוח תמונה של התוכנה, ו, (iv) להעריך על יתרונותיה וחסרונותיה של מדידת קוטר קפסולה באופן ידני באמצעות תוכנה אוטומציה. לנו למצוא את זה אחת מהשיטות מכתימים שני, פלורסנט תיוג של דופן התא, כמוסה, בעוד אורכת זמן רב, סיפק את התוצאות הכי עקבי בין ניסויים. עם זאת, שתי השיטות אפשרו לנו להבחין בהצלחה בין מעבדה קלינית neoformans ג זנים מפגין אחר קפסולת גדלים. יתר על כן, הצלחנו להפוך לאוטומטי את המדידה של קוטר קפסולה של הודו דיו צבעונית תמונות גיליתי שזו אלטרנטיבה מעשית מדידה ידנית של הקפסולה.

Protocol

הערה: neoformans ג . חיידק אבטחה ברמה 2 (BSL-2), בעובדים לזה לנקוט אמצעי זהירות נאותה. נהלים מפורטים על איך כדי בבטחה בעבודה עם פתוגנים BSL-2 ניתן למצוא באתר המרכז לבקרת מחלות של (CDC) באתר, אך חשוב לציין כי כל אדם לבוא במגע עם neoformans ג כראוי בקיצור בטיפול סוכני פתוגניים, רצוי שתלבש המתאים ציוד מגן אישי (PPE), בדרך כלל לטקס או nitrile כפפות. עוד יותר, רוטורים-צנטריפוגות צריך להחתם כדי למנוע חשוד דגימות ונוזלים יש לנקות באופן מיידי באמצעות פתרון של 10% מלבין²⁸.

1. אינדוקציה כמוסה

הערה: כל השלבים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם נכתב אחרת.

1. תרבות neoformans ג בשמרים peptone דקסטרוז (YPD) מרק (pH 6.5 + /-0.2), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות עד שהם נמצאים בשלב של יומן (כ ח 18-36).
2. צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C, לשטוף שלוש פעמים בתמיסת פוספט buffered (PBS).
3. השתמש של hemocytometer (או מונה הניתן תא אוטומטית) כדי למנות את התאים resuspend ב 2 x 10⁵ תאים/2 מ ל תקשורתי חיוני מזערי של Dulbecco (DMEM).
4. כדי לעודד את הקפסולה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עבור 18 h.
   הערה: השילוב של העדר של חומרים מזינים בתקשורת ואת נוכחותם של CO₂ מגרה צמיחה כמוסה neoformans ג .
5. שלאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו (לעיל) והסרה של כל 5-10 µL supernatant. במקביל, לקצור מדגם האו ם המושרה תא המתאימים עבור כל זן שברצונך למדוד. להשתמש כפקדים שלילי.
   הערה: כדורי התא יהיה קטן מאוד, עלול להיות קשה לראות. היה זהיר בעת כ רפה בעברית תגובת שיקוע.
6. כתם דיו הודו (סעיף 2.1) או צבעי פלורסנט (סעיף 2.2).

2. צביעת

1. צביעת עם רק אינדיה אינק
   1. כדי להכתים את השמרים עם דיו הודו, resuspend בגדר, תגובת שיקוע הנותרים ולהוסיף 4μL (בערך חצי) של הבולם תא, 4μL של הודו דיו על זכוכית מיקרוסקופ. בעדינות לערבב ולהימנע קצף.
   2. החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.
2. צביעת עם רק צבעי פלורסנט
   1. כתם השמרים עם צבע פלורסנט-resuspend בגדר תא ב- PBS µL 50 עם 1% אלבומין שור (BSA).
   2. דגירה התרבות עם אמצעי אחסון שווה של Calcofluor לבן (CFW) (1 µg/mL), mAb כמוסה 18B7 (ראה טבלה של חומרים) מצומדת כדי AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
   3. צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C שלאחר הדגירה, תשאף תגובת שיקוע.
   4. Resuspend תא גלולה ב- PBS 10 µL עם 1% אלבומין שור (BSA).
   5. פיפטה 8 µL של התא השעיה על זכוכית מיקרוסקופ.
   6. החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.
3. צביעת עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
   1. להשוות יותר ישירות את היעילות של דיו הודו מכתים לזה של צבעי פלורסנט, שיתוף כתם האוכלוסייה באותו תא עם שני סוגים של הכתם. לשם כך, תחילה תדגור תאים עם הקפסולה פלורסנט והן הכתם דופן התא, לפי שלבים 2.2.1 - 2.2.3
   2. בשלב הבא, פיפטה נפחים שווים (4 µL) של תא fluorescently ויטראז'ים ההשעיה, דיות על זכוכית. מערבבים בעדינות.
   3. החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לאטום את הקצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.

3. התמונה רכישה/מיקרוסקופ

1. הדמיה תאים מוכתמים אינדיה אינק.
   1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל (100 X הגדלה).
   2. תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי.
      הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לכל הפחות, כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית). לניסויים אלה, נרכשו תמונות בעומק של 16 סיביות עם פעמים חשיפה ממוטבת כדי למקסם את הניגוד בתמונה תוך מזעור הטשטוש הנגרמת על ידי תנועות קטנות של התאים.
2. הדמיה תאים צבעונית עם צבעי פלורסנט
   1. כדי דמות בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, פתח המיקרוסקופ תוכנות ליצירת תמונות ובחר המתאימים עירור, פליטה אורכי הגל עבור fluorophores בשימוש (CFW ו AF488 מתרגשים באמצעות 405nm את האורות 488 ננומטר, בהתאמה). לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
   2. תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי.
      הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לפחות כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית).
   3. רוכשים סדרת תמונות z-מחסנית התאים כדי להבטיח כי הקוטר קפסולה המרבי עבור כל תא בתוך שדה נתון מתקבל.
      1. תוכנת שליטה של מיקרוסקופ, לחץ על שורת "z-מחסנית" כדי לפתוח את לוח הבקרה "z-מחסנית", ולאחר מכן בחר באפשרות "ראשון/אחרון" בפינה השמאלית העליונה של החלונית.
      2. השתמש הפקד בסדר-המוקד על המיקרוסקופ להתמקד ברמה שמתחת הרחב של תא יחיד שמרים, הקפסולות עבור כל בתוך שדה הראייה הנוכחי, לחץ על "הגדר הראשונה".
      3. להשתמש בפקד מיקוד פיין להתמקד מעל לנקודת הרחב ביותר של גוף התא באותו התא, של הקפסולה עבור כל התאים בתוך שדה הראייה הנוכחי ולחץ על "קבע אתמול".
      4. לאחר מכן, לחץ על "להתחיל ניסוי" בכרטיסיה "רכישת" לרכוש המחסנית-z עבור המיקום הנוכחי. חזור על התהליך-תפקידים מרובים עד z-אוסף תמונות של מינימום של 50 תאים להיות רכש.
         הערה: לניסויים אלה, חריר קונאפוקלית נקבע ל- 1.0, AU ו- z-סדרות חופפים של 10-20 פרוסות כיסוי 0.7 מיקרומטר נרכשו על המיקומים שנבחרו. AU = יחידת אוורירי.
   4. בשלב הבא, להמיר כל סדרה z-מחסנית לתחזיות העוצמה המקסימלית (MIP) באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה.
      הערה: מיליוני הוראות בשניה פרוייקט העוצמה הגבוהה ביותר-כל המטוס של תמונה מוערמים²⁹. יצירת מיליוני הוראות בשניה מאפשרת לייצר ייצוג דו-ממדי של תמונות התואמות התאים המרבי, קוטר כמוסה בתוך הערימה תלת-ממד שנלכדו.
3. הדמיה תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
   1. לרכוש תמונות באמצעות widefield (40 X הגדלה) או מיקרוסקופ קונפוקלי (63 X או 100 X הגדלה). עבור תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט, לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ widefield מצויידים הבמה מבוקרת מחשב, שמן טבילה אובייקטיבי.
      הערה: המיקרוסקופ בשימוש צריך להיות נשלט באמצעות תוכנת הדמיה של CFW. קרינה פלואורסצנטית נרגש דרך מסנן עירור 340-380 nm, ויש הנפלטים אור שיזוהו דרך מסנן מכשול nm 435-485 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 400 ננומטר. זריחה AF488 יכול להיות שמחים דרך מסנן עירור 465-495 ננומטר, האור הנפלט יכול להתגלות דרך מסנן מכשול nm 515-555 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 505-nm.
   2. תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי עבור כל שיטת ההגדלה.

4. ידני מדידה של קפסולה

1. עבור תאים צבעונית עם דיו הודו או כתמים פלורסנט, להשתמש תוכנת המדידה תא כדי באופן ידני למדוד כמוסה ותא קוטר (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, עבור אל 'קובץ' > 'פתח תמונה' > "מדידה" ושימוש הסמן כדי לצייר קו ישר דרך נקודת הרחב ביותר של התא כולו (קוטר סה כ).
2. לאחר מכן, לחץ שוב על "מידה", לצייר קו ישר דרך הגוף תא (גוף התא קוטר).
   הערה: מדידות הם שנשמר באופן אוטומטי אל התאים.
3. חזור על תהליך זה עבור כל התאים (מינימום של 50/קבוצה).
4. כדי לשמור תמונות, ברגע שהם נמדדים, לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" ותן שם את התמונות כראוי.
5. בחר את הקבצים לאחרונה נמדד, ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני.
6. לחשב את הקוטר קפסולה הממוצע באמצעות המשוואה: ([קוטר הכולל] - [גוף התא קוטר]).

5. ממוכנות מדידה של קפסולה

הערה: למדידה אוטומטית מוצלחת, להשתמש בתמונות 16 סיביות עם רמה גבוהה של ניגוד, אשר מתמקדים כראוי יחד עם תוכנה ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלה של חומרים). כאשר הדמיה neoformans ג למדידה קפסולה, חשוב להתמקד על הטבעת כהה על הגבול בין התא לבין כמוסה. פעולה זו מאפשרת לתוכנה כראוי ניסחו את התא ואת כמוסה.

1. היפוך וליצור עותק של כל הודו דיו צבעונית תא תמונות בעזרת תוכנה לעריכת תמונות המתאימות (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, לחץ על 'קובץ' > 'פתח' כדי לפתוח הודו דיו צבעונית תמונות ולאחר מכן "לשלוט" + "אני" כדי להפוך את התמונה. לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" כדי לשמור את התמונה ההפוכה.
2. כדי לייבא המקורי והן הפוך תמונות לתוך התוכנה לחץ על "קובץ" > "רצף לייבא" > "טען תמונה" > "הגדרת רצף (ידנית)" > "מידות (ערוץ)" > "יבא" > "החל".
   הערה: neoformans ג תא וגופי קפסולות ניתן לזהות, רעולי פנים באמצעות אלגוריתמים מסוימים - המכונה 'מתכונים' - המצורף לתוכנה.
3. להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה לשם זיהוי של מסיכה בגוף התא ולאחר מכן לחץ על "החל". בתמונה ההפוכה, הטבעת כהה את הגבול של התא neoformans ג הופך בהיר יותר הקפסולה שמסביב.
4. להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה כדי לפלח את הגופות תא neoformans ג מ קפסולות שלהם ולאחר מכן לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "גוף התא" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה".
   הערה: המתכון מורכב של מספר תמונות צעדים עיבוד: רקע להסרת, זיהוי אובייקט, האובייקט ההפרדה וסינון משנה.
5. הבא, להשתמש במתכון "התפשטות תאים" על התמונה המקורית ויוכל להסתיר את הקפסולה ולאחר לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "קפסולה" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה".
6. באמצעות את המתכון, 'כמוסת מחיצה', ליצור מסכה חדשה על גבי התמונה המקורית מחיצות קפסולות סמוכים אחד מהשני. כדי לעשות זאת, לחץ על "הקפסולה מחיצה" מתוך התפריט הנפתח מתכון. בתיבה מחיצה כמוסה, לבחור המסכה ספירת עכשיו ששמן שונה "(5.5)" קפסולה עבור אזור כמוסה. בחר המסכה ספירת עכשיו ששמם "גוף התא" אנוסים תאים (5.4). לבחור "אורגינל" עבור ערוץ קלט, ו- "יצירת מסכת קפסולה Partitioned. לחץ על "החל
   הערה: המתכון יוצר התא ואת קוטר קפסולה, המוגדר כממוצע של הצירים הארוכים והקצרים מעבר למרכז של התא, כמוסה, וכן אזור מדידות של זיהוי מסכות. למצוא את הפלט הממוקמים תחת הכרטיסיה גיליון אלקטרוני בתוכנה זו. חזור על תהליך זה עבור כל התמונות (מינימום של 50 תאים/קבוצה). הפרמטרים של המתכון יכול להיות מכוון כדי למטב את גילוי של תמונות בודדות או אופטימיזציה עבור איתור אצווה של תמונות מרובות. מדידות נוספות ניתן לחשב לפי מתכון ואפיון מקיף של התא לבין המורפולוגיה של הקפסולה.
7. ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני של בחירה עבור ניתוח נוסף.

Results

כדי להמחיש אינדוקציה קפסולה תא מכתים, הדמיה, טכניקות מדידה, היינו שלושה זנים של neoformans ג: המעבדה משותף, מאופיין היטב להתאמץ, H99S³⁰ושני זני קלינית מבודדת בעבר קוטר קפסולה לא ידוע, B18 ולא B52³¹.

זרימת העבודה של אינדוקציה קפסולה, צביעת ייבוא תמונות באמצעות דיו הודו מוצג איור 1A. תמונות שנלקחו כל שלושה זנים מוצגים איור 1...

Discussion

במשך עשרות שנים, כבר הקפסולה והמוקד העיקרי של המחקר הן mycologists והן קלינאים מעוניין neoformans ג cryptococcosis בשל תפקידה כגורם מרכזי התקפה אלימה על המחלה. באמצעות מיקרוסקופ כדי למדוד את ההבדלים בגודל קפסולה בין זנים, תחת גידול שונים תנאים יכול לספק מידע חשוב על המחלה ועל התגובות לגירויים שונים (כלומר, בתנאי סביבה שונים, טיפולים תרופות פוטנציאליות, וכו ') כאן, אנחנו המחולקות שיטה לזירוז הגידול של הקפסולה ב neoformans ג, שונה בהשוואה שני קפסולת פרוטוקולים מוכתמים. לבסוף, הראינו כיצד...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells			זן המעבדה הקלינית, H99S, היה מתנה נדיבה מד"ר ג'ון פרפקט (אוניברסיטת דיוק).  הזנים הקליניים, B18 ו-B52, היו מתנות נדיבות מד"ר גרג ביסון (אוניברסיטת פנסילניה).
מרק דקסטרוז פפטון שמרים (YPD)	Fisher Scientific	DF0428-17-5
פוספט בופר מלח (PBS)			זה מיוצר במעבדה באמצעות מתכון סטנדרטי (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4O, 2 מ"מ Kh2PO4O)
DMEM/גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין, ללא נתרן פירובט	GE Life Sciences	SH30022.01
צלחות 6 בארות	Falcon	CL5335-5EA
חממת טלטול	Thermo Scientific		MaxQ6000
	פישר צנטריפוגה מדעית		איזוטמפ
	תרמו מדעי		אגדה XTR
חזק>מכתים
מיקרוצנטריפוגה	תרמו מדעי		אגדה מיקרו 21R
הודו דיו	פישר סיינטיפיק	14-910-56
Calcofluor לבן	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 נוגדן נגד GXM עכבר מצומד ל- Alexafluor 488			מתנה נדיבה מד"ר ארטורו קסדוול (אוניברסיטת ג'ונס הופקינס)
PBS עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA)			PBS הוא אותו מתכון המפורט לעיל (שורה 4) עם תוספת של 1% BSA וסטריליזציה של מסנן.
סרום בקר אלבומין	סיגמא-אולדריץ'	A9418
שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט	פישר סיינטיפיק	12-550-143
כיסויי זכוכית	קורנינג	2855-18	#1.5 עובי
לק שקוף או חומר
<חזק>רכישת תמונה
שמן טבילה	Cargille	16484
מיקרוסקופ אור עם מטרת שמן טבילה	Zeiss		Zeiss Axio A1 עם תוכנית - NEOFLUAR 100x טבילת שמן NA 1.30 אובייקט
מצלמת מיקרוסקופ אור	Zeiss Zeiss		Axiocam ErCD מצלמה
מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת טבילה בשמן	Zeiss		LSM 700 סריקת לייזר קונפוקלי מצויד במטרת Plan-Apochromat 63X NA 1.4 טבילת שמן DIC M27. נ.ב.פ;
תוכנת מיקרוסקופ קונפוקלי	Zen 2009
מצלמת מיקרוסקופ קונפוקלי	Nikon		Nikon Ti-Eclipse עם תאורה אפיפלואורסצנטית Intensilight (Nikon), מצלמת מיקרוסקופ CoolSNAP MYO (פוטומטריה), Plan Apo 60x NA 1.40 מטרת טבילת שמן (Nikon) ומחליף הגדלה פי 1.5.
תוכנת הדמיה בשדה רחב	Nikon Elements (Nikon)
<חזקה>Capsule Measurement
תוכנת עריכת תמונות	Photoshop (Adobe)
תוכנת מיקרוסקופ למדידה ידנית	Axiovision (Carl Zeiss)
תוכנת ניתוח תמונה למדידה אוטומטית	Aivia (DRVision טכנולוגיות)
תוכנת גיליונות אלקטרוניים	Excel (Microsoft)