מאמר שיטה

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57191

⸱

6 בפברואר 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הקמנו פרוטוקול כירורגיים חדשניים עבור שני הפוטונים הדמיה של עכברים חיים כבד עם הפלישה מינימלי. בטכניקה זו, זיהינו את מבנה נתונים היסטוריים של הכבד במהלך endotoxemia ליפופוליסכריד-induced. אנו צופים כי שיטה זו עשויה להיות מנוצל כדי לקבוע את היעילות של טיפול שונים ריאגנטים ליקוציט הכבד ההעברה.

תקציר

אלח דם הוא סוג של זיהום חמור העלולה לגרום לכשל איברים ורקמות נזק. למרות שיעור תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית המשויך אלח דם גבוהה מאוד, לא ישירה טיפול או מנגנון הקשורות איברים נבדקה בפירוט בזמן אמת. הכבד הוא האיבר מפתח שמנהל רעלים וזיהומים בגוף האדם. במסמך זה, כיוונו לבצע הדמיה intravital של העכבר הכבד לאחר אינדוקציה של endotoxemia כדי לעקוב אחר על תנועתיות של תאים חיסוניים, כגון נויטרופילים ומקרופגים דרכים הכבד (LCMs). בהתאם לכך, תיכננו שיטה כירורגית לחשיפה של הכבד עם כירורגיה זעיר פולשנית. עכברים הוזרקו intraperitoneally ליפופוליסכריד (LPS), אנדוטוקסין נפוצות. באמצעות הגישה כירורגי הרומן שלנו עבור חשיפה intravital הדמיה של גיוס העכבר כבד, שמצאנו כי נויטרופילים בחלבון פלואורסצנטי LPS שטופלו LysM-ירוק (GFP) העכבר הכבד היה גדל לעומת זאת, באגירה פוספט הכבד שטופלו תמיסת מלח. לאחר הטיפול LPS, המספר של נויטרופילים גדל באופן משמעותי עם הזמן. בנוסף, שימוש בעכברים CX3Cr1-GFP, אנחנו בהצלחה דמיינו הכבד מקרופאגים תושב בשם איכות המזון. לכן, כדי לחקור את היעילות של ריאגנטים חדש כדי לשלוט ניידות המערכת החיסונית ויוו, קביעת תנועתיות של המורפולוגיה של נויטרופילים ו- LCMs בכבד עשוי לאפשר לנו לזהות את האפקט הטיפולי של האיבר כשל ורקמות הנזק שנגרם על ידי הפעלת לויקוציטים באלח דם.

מבוא

הכבד הוא האיבר חילוף החומרים העיקריים אצל יונקים; היא פועלת כמו מגדל פיקוח עבור אנרגיה, הורמונים, ניקוי רעלים1. בשל חשיבותה, חוקרים ניהלו ניסויים במבחנה , ויוו רבים התירי את השינויים בכבד בעת דלקת. מיקרוסקופ intravital שימש כדי ללכוד תמונות בשידור חי כבד2 . אכן, הכבד שונים בשיטות הדמיה כבר הציגה2,3,4,5,6. עם זאת, על מנת לפתח בגישה כירורגית פשוטה יותר ולהשיג ייצוב של איבר המטרה של תאים חיסוניים, תיכננו את פרוטוקול פשוט יכול להנחות חוקרים כדי לצמצם את המאמץ שלהם עבור הדמיה intravital.

במחקר זה, הצגנו קאמרית הדמיה הרומן ויציבה בעלת טכניקה כירורגית שניתן להשתמש בו כדי למזער זיהומים דימומים וסיבוכים אפשריים. וידאנו בכבד נשארה במשך יותר מ 2 h... בשיטה זו, זיהינו בהצלחה מורפולוגיות של איכות המזון7 ו נויטרופילים בתנאי ספיגה. מאז בשיטה זו ממזערת פיזי וביולוגי גורמים מבלבלים כגון דלקת בלתי צפוי ורועדת במהלך הליך כירורגי, אנו צופים כי ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון תופעות חריפה של תאים חיסוניים בכבד בתגובה ריאגנטים כמו LPS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים נערכו בהתאם לקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה של Yonsei אוניברסיטת המכללה לרפואה, קוריאה. חלבון פלואורסצנטי ירוק-LysM (GFP; gfp / +) עכברים8 ו- CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 עכברים בגיל 8-12 שבועות של גיל שימשו עבור הדמיה intravital. כל כלי ניתוח היו בלוק חיטוי באלכוהול 70%.

1. אישית מעוצבת העכבר הכבד הדמיה קאמרית עם תמיכה כלים

  1. העכבר הכבד הדמיה עיצוב החדר
    1. להפוך תא של גודל הבא עבור כבד עכבר הדמיה (איור 1): בחדר הפנימי (120 מ"מ אורך × 160 מ מ רוחב × 30 מ מ גובה), החדר החיצוני (100 מ מ אורך × 100 מ מ רוחב × 24 מ מ גובה), בריחים (Ф 3 מ מ × 30 מ מ גובה), אגוזים (Ф 4 מ מ) , ואגוזים בצורת כנף (Ф 4 מ מ).
    2. למדוד את ריפוי הסוכן ולאפשר elastomer הבסיס ב- 1:9 יחס סך של 120 גרם של סיליקון.
    3. מכניסים את התערובת סיליקון נוזלי 250 מ ל Erlenmeyer הבקבוק ומערבבים היטב. לאחר מכן להכניס את הבקבוק desiccator, להסיר בועות אוויר עבור 1 h תחת ואקום באמצעות המשאבה.
    4. יוצקים את התמהיל סיליקון נוזלי לתא אישית מעוצבת העכבר בגובה 10 מ מ גובה ולתת לו תרופה כמה ימים (איור 1 א').
  2. הכנת כיסוי שקופיות, הכבד תיקון מיטה
    1. על מסגרת מתכת, לצרף את הזכוכית המכסה באמצעות דבק סיליקון. . תן לזה להתייבש ליום 1 (איור 1B).
    2. על מנת להחזיק ביעילות עם מים מזוקקים העדשה טבילה במים, מבנה קבועים־למחצה חסימת-מים חיוני. 1 מ מ עיגול דבק סיליקון ולבצע להקשיח את זה בן לילה.
    3. לערבב את הסוכן ואת elastomer הבסיס לריפוי, ואז ותשפכי לתוך צלחת 6-ובכן בגובה של 8-10 מ מ. בצע תהליך התקשות כמתואר ב- 1.1.2-1.1.4.

2. הכנת LPS

  1. להכין 1 × באגירה פוספט מלח סטרילית (PBS) כדי לדלל את האבקה LPS של סלמונלה enterica serotype enteritidis. (1 × PBS: 137 מ מ NaCl, אשלגן כלורי 2.7 מ מ, 10 מ מ נה2HPO4,2PO 1.8 מ מ ח'4).
  2. מראש בחום PBS באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C, פותחים את הבקבוק אבקת LPS (25 מ ג) בקפידה.
  3. באמצעות מכשיר pipet, שופכים את PBS סטרילי (5 מ"ל) לתוך הבקבוק אבקת LPS, מערבבים בעדינות או להשעות את הפתרון כדי להכין את הפתרון מניות.
    הערה: לאחר אבקת LPS הוא מעובה, vortexing קשים עלולים לגרום בועות. להימנע בועות כדי למזער את אובדן בעת ביצוע aliquots 1.5-mL צינורות.
  4. לאחסן את הפתרון LPS מניות ב−20 ° C, למהול אותו לתוך פתרון LPS 1 מ"ג/מ"ל להזרקה.
  5. להזריק את הפתרון LPS 1 מ"ג/מ"ל (20 מ"ג/ק"ג) לתוך הצפק של עכבר שאינו ומורדמת באמצעות מזרק 1-mL. לבעל שליטה, להזריק באותו אמצעי אחסון של PBS.
  6. המתן 2 h מספקת תגובה דלקתית.

3. הכנה של טקסס-אדום לתוספי כתם הדם

  1. להכין שני צינורות חרוט 15-mL 10 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. לדלל לתוספי טקסס-אדום אבקת (25 מ ג) ב- 3 מ"ל של PBS ומערבבים היטב. להעביר את התערובת שפופרת ריק 15-mL חרוט.
  3. להעביר את PBS הנותרים (7 מ ל) 15-mL צינור חרוטי המכיל את התערובת לתוספי (3 מ ל).
  4. להתחבר מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 הקצה של מזרק 10-mL. המסנן מזרק צריך להחליף את המחט.
  5. לסנן את התערובת לתוספי (10 מ"ל). הקש את המזרק באופן שווה על מנת למנוע שפיכת.
  6. לוותר על µL 500 של 2.5 מ"ג/מ"ל פתרון לתוספי בצינור 1.5-mL חסום-אור ואחסן אותו ב −20 מעלות צלזיוס. ברגע הקרת, לאחסן אותו ב 4 º C.

4. תהליך כירורגי

  1. לחטא שולחן הניתוחים כל הכלים באמצעות אלכוהול 70% לפני הניתוח. לאחר מכן, להגדיר את הכלים לניתוח בכבד, להתאים את הצלחת חימום עד 37 ° C (איור 2 א, ב').
  2. עבור הרדמה, להזריק intraperitoneally העכברים עם 30 מ"ג/ק"ג של tiletamine/zolazepam ו- 10 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים. פתרונות אלו יכולים להיות מעורב, מדולל ב- PBS להזרקה בו זמנית. לאשר ההרדמה בהקשת בעדינות את האצבע של העכבר.  המשך לצעד הבא כאשר יש רפלקס אין.
  3. למרוח כמות קטנה של העין משחה למניעת היובש של הרשתית של העכבר.
  4. הסרת שיער הגוף סביב אזור הבטן בעזרת קרם להסרת שיער (איור 2C).
  5. מזריקים µL 200 של טקסס-אדום לתוספי פתרון (ריכוז של 2.5 מ"ג/מ"ל) דרך וריד הזנב או הזרקת רטרו-מסלולית באמצעות על מזרק אינסולין (איור דו-ממדי).
  6. לסמן את האזור subcostal נכון עם סמן. הקו צריך ניתן להסיק מן הסרעפת בסוף הצלע. חותכים את האפידרמיס עם מלקחיים ומספריים (איור 2E, F).
  7. פתח את חלל הבטן בעזרת מיקרו-מספריים ומלקחיים, לחשוף את הכבד בקפידה. האונה השמאלית לרוחב צריך להיות התגלגל באמצעות ספוגיות כותנה (איור 2G, H).
  8. יוצקים µL 500 ל- PBS סטרילי על חלל הבטן כדי למנוע יובש של הכבד.
  9. למקם את העכבר במיקום נכון-חמצן בתוך תא אישית מעוצבת ולהחיל כמות קטנה של רקמת דבק על המיטה סיליקון. לאחר מכן, בזהירות לצרף את הכבד באמצעות ספוגיות כותנה (איור 2I).
    הערה: מכיוון רקמת הכבד ביותר לעזאזל, אין מכנית למשוך את הכבד. בעדינות גלגלו עם ספוגיות כותנה.
  10. כמה שניות לאחר מכן, רטוב הכבד שוב עם µL 500 ל- PBS סטרילי כדי למנוע ייבוש מתוך הכבד. להציב את המסגרת מתכת על הכבד ולתקן אותה בחוזקה עם אגוזים (איור 2J).

5. intravital הדמיה של הכבד, עם מיקרוסקופ שני הפוטונים

  1. הפעל תוכנת זן (Carl Zeiss) כדי להפעיל את הלייזר, לקבוע את אורך הגל עד 880 ננומטר, והינו ממוקם ירוק, וערוצי אדום. להתאים את עוצמת הלייזר על פי עוצמת קרינה פלואורסצנטית (איור 3 א). מידע אודות מסנן פליטה הוא כדלקמן: ירוק/Alexa488, 500-550 ננומטר, אדום/אלקסה 555, 575-610 nm.
  2. למקם את התא על הבמה הדמיה ולמקם את 20 X עדשה המטרה טבילה במי קרוב הזכוכית המכסה.
  3. לתקן את התנור גומי סיליקון מתחת לגופה בעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה (איור 3B).
  4. ירידה µL 500 של מים מזוקקים על מסגרת המתכת, ולאחר מכן משוך את העדשה המטרה קרוב הכבד (איור 3C).
  5. התאם את המוקד וקבע את העומק ואת הזמן של אזור ההדמיה.
  6. התנהגות הדמיה.
  7. עבור הדמיה לטווח ארוך, להזריק חצי מנה של תערובת tiletamine/zolazepam חריגות השירותים הווטרינריים כל שעה במהלך דימות. שמירה על טמפרטורת הגוף של העכברים ב 37 ° C חיוני בשלב זה. תמיד לשמור על העין העכבר, מאז זמן ההרדמה שונה מכל כל עכבר.
    הערה: שיטה זו היא לא מתאים השחזור לאחר כירורגיה והדמיה. מבחינה אתית, אנו מקריבים את העכבר מיד לאחר הניתוח.
  8. בדוק את הרפלקסים פדלים במשך כל 30 דקות על ההרדמה יציב.

6. ניתוח נתונים

  1. פתח את תוכנת ניתוח נתונים Volocity ולאחר מכן לייבא את הנתונים הגולמיים בספריה לתוך התוכנה.
  2. הסר את רעש התמונה כדי להתאים את המצב ואת תצלום בזק.
    הערה: כדי לקבל תמונות חלקה, השתמש במסנן 'קנס' או 'חציון'. יתר על כן, השתמש בתכונה 'ניגודיות שיפור' כדי ליצור תמונות כהה או מטושטשות לברורה.
  3. להתאים את הפריטים הערוך 100% וייצוא קבצי JPEG או TIFF עבור תמונות תמונה, קבצי AVI סרטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הומצאה תא הדמיה פשוטה ויציבה מאוד. החלק התחתון של תא היה מכוסה סיליקון, אשר מנעו החלקה של העכבר הגוף והאיברים. בנוסף, בגלל הסיליקון יש את הכמות הנכונה של גמישות, זה יכול למנוע נזק הצפוי המושרה על ידי הלחץ של השקופית כיסוי (איור 1 א', ג). דבק השני, רקמות-כספת (הוטרינר בונד) הוחלה על מנת לתקן את הכבד שחולצו על המיטה סיליקון בצורת עיגול. שיטה זו אפשרה לנו להימנע רועד נגרמת על ידי פעימות הלב או תנועה respirational. לבסוף שקופית כיסוי מתכת היה להצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכבד נחקרה באופן פעיל על ידי הרבה קבוצות3,10, בשל חשיבות תפקודה. למשל, היימן ואח הציע שיטה עדינה באמצעות agarose. למרות ששיטה זו נמצאה להיות מדויק מאוד, ההגדרה agarose לוקח זמן. עם זאת, עם המתודולוגיה שלנו, כל ההליכים יכול להתבצע בתוך 30 דקות, צמצום גורמים אחרים מבלבלים. שנית, ייצוב הכבד הוא מאוד חשוב כי פעימות יכולים להפריע את הוידאו. כדי למנוע תופעה זו, אנחנו לטאבים העכברים למצב חימום נכון.

צעד קריטי נוסף פרוטוקול זה היה ייצור של המס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענק של נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP; מענק מס 2016R1A2B4008199 Y-מ'. ח'), ו משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI14C1324).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תא מעוצב בהתאמה אישיתמכשיריבגודל מעוצב בהתאמה אישית
שקופית כיסוי מתכתמכשירי תא חי בגודלמעוצב בהתאמה אישית
כיסוי זכוכיתמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי #72204-03
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןדאו קורנינג
ארלנמאיירדוראן21 216 36
צלחת תרבית תאים (סוג שטוח)HYUNDAI Micro Co.H31006
DesiccatorADARSH55204
High Q Bond SE 5 mLBJM LABכדי להפוך סכר קבוע למחמם
גומי סיליקון גמישOmegaSRFR / SRFG SERIES, M1250/0800
DC ספק כוחToyotechDP30-03A
מלחתוצרת בית
ליפופוליסכרידים (LPS) מסלמונלה enteria serotype enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן
בהירות גבוהה		FALCON14-959-49B
0.45 μ מסנן m (מסנן מזרק מיניסארט)Sartorius16555k
1.5 מ"ל מיקרו שפופרת, ענבראקסיג'ןMCT-150-Xלחסימת אור
1 מ"למזרק קוריאה חיסוןKV-S01
3 מ"ל מזרקקוריאה KV-S03
10 מ"ל מזרקקוריאה KV-S10
0.3 מ"ל מזרק אינסוליןבקטון דיקינסון324900
קרם להסרת שיער 100 מ"לגוף טבעי
צמר גפןABDI
Zoletil 50 5 מ"לVirbac
Rompun 10 מ"לבאייר
חימום צלחת LiveCell InstrumentsPH-S-10גודל מותאם אישית
בקר DCCell InstrumentsCU-301
מספריים מיקרו-חתךמכשיר הרווארד72-5418
מספרייםRobozRS-5882
מלקחייםRobozRS-5137
וטרינר בונד3M1469SB
תוכנת ZEN (מהדורה שחורה)תוכנית קרל זייסעבור LSM 7 מגה פיקסל
LSM 7 מגה פיקסלקארל זייס
VolocityPerkinתוכנית ניתוח אלמר
תא חיים בקבוק חוצץ פוספט Live

מקורות

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LPS

מאמרים קשורים