מאמר שיטה

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

DOI:

10.3791/57194

⸱

19 במאי 2018

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להבחין בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) לתוך תאים, כמו hepatocyte (HLCs) מספק הזדמנויות חדשות ללמוד שגיאות מולדות בחילוף החומרים הכבד. עם זאת, כדי לספק פלטפורמה שתומכת הזיהוי של מולקולות קטנות פוטנציאלי יכול לשמש לטיפול במחלות כבד, ההליך דורש תבנית התרבות תואמת הקרנת אלפי תרכובות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשתמש בתנאים מוגדרים לגמרי תרבות, אשר מאפשרים את הבידול לשחזור של האדם iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות תרביות רקמה 96-ובכן. אנו מספקים גם דוגמה לשימוש את הפלטפורמה כדי תרכובות מסך בשל יכולתן להוריד אפוליפופרוטאין B (APOB) המופק נגזר iPSC hepatocytes שנוצר מן המטופל היפרכולסטרולמיה משפחתית. הזמינות של פלטפורמה מתאימה ל גילוי תרופות צריך לאפשר לחוקרים לזהות את הריפוי מחלות המשפיעות על הכבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצלחה בזיהוי סמים יכול לשמש למטרה מחלה נדירה מסתמך על התפתחות מבחני שיכול לשמש להקרנה. ההשערה או מסכי קליעה (פרמקולוגיה הפוכה) שימושיות, אך דורשות הבנה מפורטת של הבסיס המולקולרי של המחלה. מסכי פנוטיפי (פרמקולוגיה קלאסית) למנוע את הצורך הבנה מפורטת של משעולים הביוכימי, אך במקום להסתמך על פיתוח מודלים במדויק במראה הפתופיזיולוגיה של המחלה. למרות ההתלהבות עבור גישות קליעה, ניתוחים של ה-FDA אישר הראשון ב- class סמים חושפים כי המסכים פנוטיפי היה הרבה יותר מוצלח1. המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור פלטפורמה עבור תפוקה גבוהה הקרנת זה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד מטבולית. מספר מודלים במבחנה תוארו כולל hepatocytes העיקרי, הפטומה היא תאים תאים בכבד קדמון2. אולם, רוב המודלים האלה יש מגבלות, יש צורך עבור דגמים חדשים אשר ניתן לסכם במדויק הפתופיזיולוגיה של חילוף החומרים בכבד ליקויים בתרבות. לאחרונה, תאי גזע pluripotent האדם בשילוב עם ג'ין עריכה הציעו הזדמנות לדגמן אפילו הנדירים של מחלות נדירות בתרבות ללא הצורך לחולים גישה ישירות3. בעת השימוש iPSCs החולה הספציפי כפי כלי כדי לגלות מולקולות קטנות לטיפול של מחלות כבד נדירה סביר מבחינה מושגית, יש רק כמה דוחות הממחיש את הכדאיות של גישה זו4. עם זאת, לאחרונה הקמנו פלטפורמה שהיו הנגזרות iPSC hepatocytes בהצלחה לזהות תרופות שניתן יהיה לשנות את ייעודו לטיפול של ליקויים מטבוליזם בכבד5.

פרוטוקול זה מסביר את התהליך של הבחנה אנושית iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן ושימוש בהם למסך ספריה של מולקולות קטנות. הוא גם מתאר את הניתוח קצה היפרכולסטרולמיה כדוגמא של מחלת כבד מטבולית. גישה זו צריך להיות שימושי ללמוד את התפקידים ואת היישום של מולקולות קטנות בהקשר של מחלת כבד זיהומיות, מחלות כבד מטבולית, רעילות התרופה ובהפרעות כבד אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התרבות של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

  1. ציפוי רקומביננטי חלבון כימרי Fc E-קדהרין אנושי (E-cad-Fc) או אחרים מטריצות מתאים לתרבות hPSC 6
    1. לדלל E-cad-Fc כדי 15 μg/mL עם Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים המכילים סידן ומגנזיום (DPBS (+)).
    2. מעיל 100-מ מ הבולם מנות תרביות רקמה עם 5 מיליליטר מדולל E-cad-Fc, דגירה-37 הלעפה תרוטרפמט לפחות 1 ה' הסר המצע ולהחליף עם 5 מיליליטר בינונית (למשל, mTeSR1 כאל M-בינוני מעתה ואילך)7.
      הערה: המדיום תרבות בשימוש פרוטוקול זה מוכן לאחר שפורסמה בפרוטוקולים7. עם זאת, מספר תכשירים מדיה אחרים שתוארו, או זמינים מסחרית, כי הם כנראה תואם ההליך.
    3. אחזר בקבוקון של cryopreserved iPSCs של חנקן נוזלי. הפשרת-הלעפה תרוטרפמט 37 עד גביש קרח קטן נשאר. בעדינות פיפטה תאים לתוך סטרילי 15-mL חרוט צינור המכיל 4 מ"ל של M-המדיום.
    4. צנטריפוגה ב g 300 x 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות מחדש תאים עם 5 מ של המדיום בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632, מעכב סלקטיבי של רו-הקשורים, סליל מפותל המכילה חלבון (רוק).
    5. להסיר את M-בינוני שלב 1.1.2, ולהעביר 5 מ של תאים מהשלב 1.1.4 ל ההשעיה 100-מ מ E-cad-Fc-מצופה תרביות רקמה מנות.
  2. שמירה על iPSCs האדם בתרבות
    1. ברגע iPSCs מגיע סביב 80% confluency, הסר בינוני תרבות ולשטוף פעם עם סידן, מגנזיום חופשית DPBS (-). האחות של DPBS (-) ומוסיפים כמות מספקת של 0.02% פתרון EDTA לכסות את הלוחות, ולאחר מכן תקופת דגירה של עד 3 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: ב- 80% הנהרות, הצלחת להכיל בסביבות 2 x 107 תאים. חשוב לא לגדול פרא ולהשתלט על התאים, וכדי להבטיח כי התאים שומרים על מורפולוגיה מובחן. Pluripotency של התאים יכול להיקבע על ידי צביעת תאי גזע סמן העכבר ל- 1-60 או שוות ערך8.
    2. ברגע והתאים מתחילים לשחרר, הסר את הפתרון EDTA 0.02%, להציף את המנה עם 10 מ"ל של M-מדיום כדי לשחרר את התאים. הסיוע של הניתוק בין iPSCs על ידי בעדינות pipetting.
      הערה: זמן הדגירה הממוצע עבור תאים לנתק בסביבות 3 דקות, אבל זה צריך להיקבע מדעית עבור כל קו iPSC. התאים שאמור להתפרסם בתור בקבוצות קטנות המכילות סביב 5-10 iPSCs לכל אשכול.
    3. העברת 1/10 של התאים על תנאי לכל טריים E-cad-Fc 100 מ מ מצופה ההשעיה מאכל תרביות רקמה המכיל 5 מ של M-המדיום. דגירה התרבויות-37 הלעפה תרוטרפמט מתחת לגיל 4% או2/5% CO2 ושינוי המדיום מדי יום.
      הערה: למרות iPSCs באופן שגרתי מתורבתים בתנאים פיסיולוגיים חמצן כדי לקדם את pluripotency, iPSCs ניתן גם לגדל באמצעות חמצן סביבתי.

2. הבידול של האדם iPSCs לתאי Hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן

הערה: סעיף זה מתאר את הבידול של iPSCs בתבנית התואמת ההקרנה. באמצעות גישה זו, זה אפשרי לגרום iPSCs האנושי כדי להבדיל ויוצרים תאים דמויי hepatocyte ב- 20 ימים. אמנם זה מתאים עבור רוב מבחני, ניתן להרחיב את האורך של תרבות כדי לשפר את הבגרות של התאים.

  1. ציפוי תרביות רקמה 96-ובכן צלחות עם מטריקס קרום המרתף מופחת גורם גידול
    1. הכן את המניה על ידי דילול המטריקס כדי 2 מ"ג/מ"ל עם קרח DMEM/F12 תרביות רקמה בבסיס, אמצעי סטרילי. לחלק את המטריצה 250 μL aliquots ולאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט עד הנדרש. מקררים 10 מ"ל של DMEM/F12 בקרח במשך 30 דקות אחזר, μL aliquot של מניות מטריקס 2 מ"ג/מ"ל 250 ו הפשרה על קרח.
    2. משלבים את המטריקס עם 10 מ"ל של DMEM קר/F12 על ידי ערבוב בעדינות בעזרת פיפטה צוננת מראש כדי להפוך הריכוז הסופי של 0.05 מ"ג/מ"ל.
    3. העברת μL 100 של מטריקס מדולל כל טוב של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 לפחות 1 ה למחוק את המטריקס, להחליף μL 50 מ'-בינוני לכל טוב. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס, 4% או2/5% CO2 עד שהוא נדרש.
  2. צלחת תאים עבור בידול
    1. תרבות של iPSCs על צלחות 100-מ מ עד תאי זרימה 80%. ודא כי הצלחת מכיל 2 x 107 תאים. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד על-ידי תאים זרימה cytometer או hemocytometer.
      הערה: עם ניסיון, האיכות של התאים iPSCs יכולה להישפט על ידי מיקרוסקופ; עם זאת, קרוב 98% של התאים צריך לבטא סמנים pluripotency כמו epitope טרה-1-60 כאשר נמדדת FACS או immunostaining. חשוב כי התאים נשארים החלוקה באופן פעיל, הם לא מגודלת.
    2. כדי לקצור את iPSCs של כל צלחת 100-מ מ, תשאף המדיום תרבות ולשטוף עם 5 מ של DPBS (-). החלף את השטיפה 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא (למשל, accutase), תקופת דגירה של בערך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 4% או2/5% CO2.
      הערה: חשוב לעקוב אחרי הניתוק של תאים באמצעות מיקרוסקופ. לא מעל תקציר עם accutase. המטרה היא לשחרר את התאים כמו בקבוצות קטנות עם טיפול מינימלי.
    3. ברגע התאים נתחיל לנתק, הקציר על-ידי הוספת 7 מ של M-המדיום. פיפטה מספר פעמים מביצועם המושבות תא לתוך בקבוצות קטנות של סביב 3-6 תאים (איור 1 א').
    4. לאסוף את iPSCs לתוך צנטריפוגה סטרילי 15-mL צינור צנטריפוגה ב g 300 x במשך 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות בגדר תא ב 5 מ ל ז-בינוני.
    5. פזר באופן שווה את התאים על גבי לוחות מצופים מטריצה 96-ובכן מאת pipetting 50 μL של תאים ההשעיה לבאר כל. כדי להגדיר את כל צלחת 96-ובכן, להשתמש בצלחת 100-מ מ אחד של iPSCs עם תאים על 80% confluency המכיל בסביבות 5 x 106 תאים כדי להתקין את הבידול. השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי לזרז תהליך זה. התרבות התאים בן לילה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2.
      הערה: חשוב כי מספר שווה של תאים נצבר בכל טוב על מנת להבטיח differentiations לשחזור.
  3. זירוז התמיינות של תאים
    1. לבחון את הצלחות 96-ובכן על ידי מיקרוסקופ כדי להבטיח תאים לפחות 70% מפני השטח של כל אדם טוב. אם הכיסוי הוא פחות מ- 70%, להחליף את המדיום בינונית טרייה, תקופת דגירה של h 24 נוספים הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2.
      הערה: המקננת תאים עבור יותר מ- 48 שעות לאחר ציפוי ללא גרימת בדרך כלל התמיינות מפחית את היעילות של בידול. בידול תתרחש גם באמצעות חמצן סביבתי, למרות היעילות עשוי להיות מושפע.
    2. עבור 1 יום 2 יום של בידול, להחליף את המדיום תרבות RPMI בתוספת 2% B27 (ללא אינסולין), 100 ננוגרם למ"ל Activin A, 10 ננוגרם למ"ל BMP4 ו- 20 ng/mL FGF2. להוסיף 100 μL בינוני לכל טוב, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עם שינוי בינונית מדי יום במשך יומיים.
      הערה: התמודדות עם מספר גדול של צלחות 96-ובכן מחייבות השימוש של פיפטה בסיוע או רובוט. פיפטות 12 ערוצים וערוץ 96 הינם אידיאליים עבור שינוי בינונית מדי יום.
    3. יום 3-יום 5 של בידול, החלף המדיום תרבות עם RPMI בתוספת 2% B27 (ללא אינסולין) ו- 100 ננוגרם למ"ל Activin א התרבות תאים בחלק הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עם שינוי יומי בינונית למשך 3 ימים.
    4. ביום בידול 5, לפני החלפת טריים תרבות בינונית, לטפל בכל טוב עם 100 μL 0.02% EDTA פתרון עבור 30 s, אז הסרה והחלפה של טרי תרבות בינונית.
      הערה: אם בידול האנדודרם יעיל, טפט להבדיל תאים הוא נוטה פילינג מהצלחת. טיפול קצר עם פתרון EDTA 0.02% מסייע להקל על ניתוק התא. טיפול זה לא משפיע על בידול hepatocytes.
    5. עבור בידול בין 6 ימים ל- 10, להחליף את תרבות המדיום עם RPMI / 2% B27 (עם אינסולין) בתוספת 20 ng/mL BMP4 ו 10 ננוגרם למ"ל FGF2, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 במשך 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום. בשלב זה גורם לתאים להתמיין ובתאים הכבד.
    6. עבור בידול בין הימים 11 עד 15, החלף המדיום תרבות עם RPMI / 2% B27 (עם אינסולין) בתוספת 20 ng/mL דבורה שחר. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 במשך 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום.
    7. עבור בידול בין ימים 16 ל-20, החלף המדיום תרבות hepatocyte תא תרבות בינוני (HCM) בתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M (OSM). דגירה התאים-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 בשינוי בינונית מדי יום במשך 5 ימים.
      הערה: הפארמצבטית אבחנה בין בארות בודדים ביעילות יכול להיקבע על ידי מדידה לרמת אלבומין, AFP או APOB ומופרש אל המדיום מאת אליסה (ראה 3.2).

3. ההקרנה מולקולה קטנה

הערה: להלן תיאור ההליך המשמש לזיהוי תרכובות יכול לשמש כדי להוריד את רמת APOB במדיום של תאים hepatocyte דמוי נגזר היפרכולסטרולמיה משפחתית iPSCs. תיאור של הדגם והשימוש הזיהוי של תרופות להורדת כולסטרול שתיארנו ב פירוט בעבר5,9. בדוגמה הנוכחית, הוקרנו תרכובות 1,000 מתוך ספריית אוסף במתחם דרום קרוליינה (SC3). כל המתחם נבחנה על ריכוז של 2 μg/mL.

  1. טיפול iPSC - נגזר hepatocytes עם מולקולות קטנות
    1. לדלל הספרייה מתחם ראשיים לייצר הצלחות של מניות לעבוד עם תרכובות-ריכוז של 20 μg/mL 2% דימתיל סולפוקסיד וחנות ב-20 הלעפה תרוטרפמט.
    2. להכין מספיק צלחות 96-ובכן נגזר iPSC hepatocytes כדי לאפשר לכל מתחם להיבדק.
      הערה: מספר תרכובות שיוקרנו יכתיב את מספר הצלחות 96-ובכן הנדרשים. באופן כללי, סינגל טוב צריכים להיות מוכנים כל בארות מורכבים, בתוספת נוספים עבור כל דגימות הבקרה. הבארות החיצוני ביותר של הצלחת הם נמנעו בדרך כלל כדי לצמצם את האפשרות של אפקטים קצה יכולים להשחית פרשנות. ניתן לזהות פגיעות בשיטת ניקוד-z ללא הצורך להשתמש משכפל. אם משכפל כלולים, זה מתאים יותר להשתמש במבחן t.
    3. בסיום בידול (יום 20, ראה 2.3.7), להחליף את המדיום תרבות μL 100 של HCM טריבתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 עבור בדיוק 24 ח' לאחזר המדיום תרבות לתוך צלחת 96-ובכן טריים בחנות ב-20 הלעפה תרוטרפמט. להשתמש דגימה זו כדי לחשב את רמת APOB במדיום לפני התוספת של סמים.
    4. הוסף μL 90 של HCM טרי בתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M כל טוב. להוסיף 10 μL של כל המתחם מן המלאי לעבוד לאחר ערבוב על-ידי pipetting. להוסיף דימתיל סולפוקסיד 0.2% כדי לשלוט בארות כדי להתאים את הריכוז הסופי הדגימות שטופלו ואת דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עבור בדיוק 24 ה לאסוף המדיום תרבות ולאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט. השתמש דגימה זו כדי לקבוע את מידת APOB לאחר הטיפול עם תרכובות.
    5. אופציונלי - ניתן לעבד את התאים הנותרים עבור immunostaining, תא הכדאיות או ניתוחים של רמות ה-mRNA באמצעות גישות סטנדרטי.
      הערה: מסך זה נועד לזהות תרופות הייתה השפעה מהירה על APOB רמות. עם זאת, בהתאם המודל של המחלות, מבחני במורד הזרם, או מנגנון הפעולה של התרופה, זה עשוי להיות מועיל להתייחס המדגם במשך מספר ימים.
  2. לקבוע רמות APOB מאת אליסה
    1. לקבוע אפוליפופרוטאין B (APOB) ריכוז של שתי התרופות שלאחר קדם, דגימות שטופלו באמצעות ערכת פיתוח אנושי APOB אליסה בעקבות הפרוטוקולים של היצרן.
    2. הכנת את הפתרונות הבאים
      1. מאגר לשטוף, המורכב 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4. חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 עד השימוש.
      2. מאגר דגירה, מורכב של 0.05% Tween 20 ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS, pH 7.4. חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 עד השימוש.
    3. להכין נוגדן APOB (mAB 20/17) על ידי דילול עד 2 µg/מ"ל ב- PBS, pH 7.4. להוסיף 100 μL של הנוגדן מדולל לכל טוב, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 4 בן לילה.
    4. להסיר את הנוגדן הלוחות assay ולשטוף היטב פעמיים עם μL 200 ל- PBS, pH 7.4.
    5. להוסיף 200 μL/טוב של 0.05% Tween 20, 0.1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS, pH 7.4 דגירה על פלטפורמה חזק לשעה בטמפרטורת החדר.
    6. להכין מעגל מתומן רגיל באמצעות BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4 עם ריכוזי APOB הבאים: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ננוגרם למ"ל, 150 ng/mL, ננוגרם למ"ל 125, 100 ננוגרם למ"ל, 75 ng/mL, ו 50 ng/mL.
    7. לדלל את הבדיקה דגימות 1:4 עם BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4.
    8. לאחר h 1 של חסימת עם מאגר דגירה, לבטל את המאגר, לשטוף צלחות assay חמש פעמים עם 200 μL של 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4.
    9. לחלוטין להסיר כל מאגר כביסה שיורית, להעביר 90 μL של הדגימות מדולל ותקנים APOB הלוחות וזמינותו. דגירה בטמפרטורת החדר על מטרף לשעה.
    10. למחוק את הדגימה. ולשטוף עם 200 μL 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4 לכל טוב. חזור שוטף סך של 5 פעמים. הוסף μL 100 לכל טוב של LDL mAB 11-ביוטין 1:1,000 מדולל ב- BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4. דגירה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה חזק עבור 1 h.
    11. למחוק הכימית ולשטוף עם μL 200 לאדם טוב כביסה מאגר 5 פעמים. להוסיף μL 100 לכל טוב של נוגדן Streptavidin-HRP (1:1, 000 דילול באמצעות מאגר הדגירה), ואז דגירה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה חזק עבור 1 h.
    12. למחוק הכימית ולשטוף עם 200 μL 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4 לכל טוב. חזור שוטף סך של 5 פעמים. לחלוטין להסיר את המאגר כביסה שיורית הלוחות assay, להוסיף μL 100 לכל טוב של Tetramethylbenzidin (שוייץ) המצע פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 8 דקות.
    13. מבלי להסיר את המצע שוייץ, להוסיף ישירות μL 100 לכל טוב של להפסיק פתרון (1N HCl).
    14. לקבוע את ספיגת ב 450 nm שימוש בקורא צלחת.
    15. עיקול רגיל ניתן ליצור, באמצעות שיטת ארבע פרמטר רגרסיה לוגיסטית, ואז להשתמש כדי להגדיר את ריכוז APOB כל מדגם10.
    16. לבחון את התרופה קדם: היחס בין סמים שלאחר APOB בכל מדגם לזהות תרכובות עם פוטנציאל להורדת APOB רמות במדיום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דור של hepatocyte - כמו תאים: איור 1 מתאר את פרק הזמן של השינויים המתרחשים במהלך הבידול של iPSCs האנושי לתאים, כמו hepatocyte. התרבות של iPSCs על ה-Cad-Fc מספק כ- 2 מ מ קוטר מושבות המבטאים את סמן pluripotent OCT4 (איור 1 א'-ב'). המורפולוגיה של תאי צמח על מטריצה של E-קדהרין יהיה שונה במקצת לאלה תרבותי על משטחים אחרים. הם נוטים להיות בעלי מורפולוגיה שעברו שיטוח של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעד המבוסס על גילוי תרופות, שבה מולקולות קטנות מזוהים המשפיעים על הפעילות של חלבון ספציפי, הייתה המוקד של מאמצים רבים ההקרנה הקיים. אף-על-פי גישה זו סיפקה תרופות רבות, מסכי בהתבסס על היפוך של פנוטיפ, פרמקולוגיה קלאסית, היה מוצלח יותר בזיהוי הראשון ב- class שאמורות להיות אפקטיבי קלינית1. חיסרון גילוי תרופות פנוטיפי הוא זה מסתמך על הזמינות של דגמים המתאימים למחלות. זה יכול להיות אתגר כאשר התא מודלים של המחלה אינם זמינים, או כאשר מיני בעלי חיים משותפים של מחקר להיכשל כדי לסכם את הסימפטומים הקליניים....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (DK55743, DK087377, DK102716 ו- HG006398 כדי S.A.D). ברצוננו להודות ד ר Behshad Pournasr, ד ר ג'יימס Heslop, רן ג'ינג על תרומתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלי תרבית רקמה סטריליים בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ קורנינג430167
100 מ"מ x 20 מ"מ צלחות תרבית תרחיף סטריליותקורנינג430591
96 בארות Corning3595
אנטי אנושי אלבומיןDakoA 0001
אנטי אנושי FOXA2(6C12)Novus BiologicalH00003170-M12
אנטי אנושי HNF4 אלפאסנטה קרוזSC-6556
אנטי אנושי Oct-3/4 נוגדןסנטה קרוזSC-9081
אנטי אנושי SOX17R& DAF1924
אנטי-אנושי TRA-1-60 FITC מצומדMilliporeFCMAB115F
Activin A חלבון אנושי רקומביננטי InvitrogenPHC9563
B-27, בניכוי אינסולין Invitrogen0050129SA
תוסף תזונה B-27, ללא סרום Invitrogen17504044
BMP4 חלבון אנושי רקומביננטי InvitrogenPHC9533
מגיב דיסוציאציה של תאים StemPro  אקוטאז InvitrogenA1110501
CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים זוהרים Promega7572
DPBS+(סידן, מגנזיום)Invitrogen14040-133
DPBS-(ללא סידן, ללא מגנזיום)Invitrogen14190-144
DMEM/F-12, HEPES Invitrogen11330057
ELISA ערכת פיתוח APOB ELISA אנושיתMabtech3715-1H-20
גורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF2)InvitrogenPHG0023
מדיום תרבית הפטוציטים (ערכת כדורי HCM) LonzaCC-3198
מקדם גדילת הפטוציטים  (ה"ג)InvitrogenPHC0321
L-גלוטמין Invitrogen25030081
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותInvitrogen11140076
Oncostatin M (OSM) חלבון אנושי רקומביננטי InvitrogenPHC5015
פניצילין-סטרפטומיצין Invitrogen15140163
מזין מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים ללא מזין: mTesR1 STEMCELL טכנולוגיות5850
מטריצת ממברנת מרתף עם גורם גדילה מופחת InvitrogenA1413301
RPMI 1640 בינוני, HEPES Invitrogen22400105
StemStick מטריצה מוגדרת עבור hPSC (E-cad-Fc)Primorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA תמיסת מצעThermo Scientific 34022
Anti-TRA-1-60 FITC מצומדMilliporeFCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02% Lonza17-711E
Y-27632 מעכב ROCKSTEMCELL Technologies72302
תוסף

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15(2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96B

מאמרים קשורים