הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה

5.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57235

⸱

20 ביוני 2018

 ,  , 
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

במאמר זה

סיכום

שיטה מוצגים כאן עבור הכנת הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) עם decellularization יעיל. TEM יכול לשמש פיגומים פונקציונלי של הבנייה מחדש של מודל קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC) לשון בתנאים סטטי או מנוער תרבות.

תקציר

על מנת לבנות מודל אפקטיבית ומציאותית עבור הלשון קשקש קרצינומה (TSCC) במבחנה, השיטות נוצרו כדי לייצר decellularized הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) אשר מספק פונקציונליות פיגומים בנייה TSCC. TEM מספק נישה במבחנה צמיחת תאים, בידול של נדידת תאים. מזערים של מטריצה חוץ-תאית מקורי (ECM) ויצירות ביוכימי בתוך המטריקס decellularized מספקים רקמות ספציפיות נישות עיגון תאים. הזיוף של TEM ניתן למימוש על ידי עיכול deoxyribonuclease (DNase) בליווי של רעלני אורגני או לא. פרוטוקול זה קלה לתפעול ומבטיחה יעילות גבוהה עבור decellularization. TEM הראה cytocompatibility חיובית עבור תאים TSCC בתנאים תרבות סטטי או מנוער, המאפשרת בניית המודל TSCC. ביוריאקטור מתוצרת עצמית שימש גם עבור התנאי מנוער מתמשך עבור תרבית תאים. TSCC שוחזר באמצעות TEM הראה את התכונות והמאפיינים הדומה histopathology TSCC קליני, מציעה את הפוטנציאל במחקר TSCC.

מבוא

הלשון יש תפקידים חשובים שונים, כגון deglutition, חיתוך, טעימות. לפיכך, ירידת ערך של פונקציה הלשון יש השפעה רבה על איכות החיים של המטופלים1. הגידול השכיח ביותר בחלל הפה הוא לשון קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC), אשר מתרחשת בדרך כלל אצל אנשים לשתות אלכוהול או לעשן טבק2.

בשנים האחרונות, הושגה התקדמות במחקר בסיסי על TSCC. היעדר מחקר יעיל במבחנה מודלים נשאר להיות אחת הבעיות הגדולות ביותר. לפיכך, מטריצות (ECM) הופך להיות פתרון אפשרי. מאז ה-ECM הוא מסגרת רשת מורכבת המורכב מטריקס מאורגן מאוד רכיבים, לגרדום חומרים שיש, מבנה דמוי ECM ו קומפוזיציה יהיה כשיר לחקר הסרטן. Decellularized ECM יכולה לספק באופן מושלם את הנישה התאים של אותו מקור במבחנה, אשר הופך להיות היתרון המשמעותי ביותר של ה-ECM.

ECM יכול להישמר עם מרכיבי התא הוסר מן הרקמות דרך decellularization באמצעות חומרי ניקוי ואנזימים. ECM רכיבים שונים, לרבות קולגן, fibronectin laminin במטריצת decellularized מספקים microenvironment דמויי רקמה מקורי של תאים בתרבית, לקדם את הישרדות, התפשטות, התמיינות של תאים3. יתר על כן, אפשר לצמצם את immunogenicity עבור השתלת ברמה מינימלית עם חסרונו של מרכיבי התא ב- ECM.

עד כה, נוסו שיטות ייצור עבור decellularized ECM ברקמות שונות ובאיברים, כגון הלב4,5,6,7, כבד8,9,10 ,11, ריאות12,13,14,15,16,17ו-18,כליות19 , 20. עם זאת, אין מחקרים רלוונטיים להיות מצאו בעבודה דומה בלשון לפי מיטב הידע שלנו.

במחקר זה, לשון decellularized מטריצה חוץ-תאית (TEM) היה מפוברק בצורה יעילה וגם בזול על ידי סדרה של פיזי, כימי, טיפול אנזימטי. ואז TEM שימשה מסכם את הדברים TSCC במבחנה, מציג סימולציה המתאים TSCC התנהגות והתפתחות. TEM יש הביו טוב, כמו גם היכולת להנחות את התאים הגומחה רקמות ספציפיות, אשר מציין כי TEM יכול להיות פוטנציאל גדול TSCC מחקר3. בפרוטוקול שמוצג כאן מספקת מבחר של החוקרים ללמוד על פתוגנזה או טיפולים קליניים של TSCC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העבודה חיה המבוצעת על פי חוק רווחת בעלי חיים, המוסדיים הנחיות ואושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה, אוניברסיטת סון יאט סן.

1. הכנת TEM

  1. מבצע עכברים באמצעות נקע בצוואר הרחם ולהסיר את הלשונות באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי סטרילי.
  2. לטבול את הלשונות 75% אתנול למשך 3 דקות, ולאחר מכן להכניס את הלשון כל mL 1.5 ראנבן (EP) שפופרת עם 1 מ"ל של 10 מ מ פוספט סטרילי buffered פתרון (PBS).
    הערה: הריכוז של PBS בכל השלבים הבאים הוא בדיוק כמו הריכוז בשלב זה.
  3. תא פירוק על ידי הקפאה הפשרה: להקפיא את הלשונות צינורות EP ב-80 מעלות צלזיוס עבור 1 h ולאחר מכן להפשיר את הלשונות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות 3 מחזורים.
  4. לטעון את כל הלשון על חתיכת תפירה באמצעות מחט כירורגית, לעטוף את סוף התפר עם חתיכה קטנה של אלומיניום סטרילי. ביצוע הפעולה לצלחת תרבות 3.5 ס"מ או 6 ס מ המכיל 75% אתנול בתנאים סטריליים.
    הערה: אורך כל פיסת תפירה המתאים הוא כ-20 ס מ, הגודל המתאים של כל חתיכה של נייר כסף על 0.3 ס מ2 (1 ס"מ × 0.3 ס מ). הלשון ייטען ליד זכרי.
  5. יש לשטוף את הלשון כל 3 מ"ל של PBS סטרילי בקערה תרבות 3.5 ס"מ או 6 ס מ עבור 30 ס' בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
  6. לשטוף את הלשונות במים הנדסה גנטית: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של מים הנדסה גנטית סטרילי ריכוז סופי של 90 µg/mL. מכניסים את הלשונות הבקבוק המכילה בר מערבבים. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
    הערה: עד 5 הלשונות ניתן להכניס את הבקבוק אותו תמורת מטפסים משתרגים של התפר. נייר הכסף הוא בסוף התפר הבקבוק כדי למנוע החלקה את הלשון. הלשונות יוצבו 2 ס מ מתחתית הבקבוק על-ידי התאמת אורך התפר שנותרו בתוך הבקבוק. הערה זו היא גם שלבים 1.8, 1.10, 1.12, ו- 1.16.
  7. לשים את הבקבוק פגים במשך 12 שעות.
  8. לשטוף את הלשונות עם NaCl: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של 1 סטרילי M NaCl כדי ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
  9. לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.
  10. תא פירוק על ידי טריטון X-100: להוסיף ampicilin ריכוז הסופי של 90 µg/mL לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של % 2 סטרילי טריטון X-100 ב- PBS. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
  11. לשים את הבקבוק פגים במשך 48 שעות.
  12. לשטוף את לשונות ב- /MgCl2CaCl2: הוספת ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של סטרילי 5 מ מ CaCl2/MgCl2 ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
  13. לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.
  14. עיכול על ידי DNase: הוספת 1 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) על כל שפופרת EP. להוסיף DNase לתוך HBSS בהתאמה לריכוז סופי של 300 מיקרומטר. להעביר את כל הלשון לתוך כל שפופרת EP, חלק התפר בחוץ. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
    הערה: ודא לחלק תפר אשר נשאר בתוך הבקבוקים השלבים הקודמים גם נשאר בתוך הצינור EP בשלב זה, וודא כי לחלק תפר אשר נשאר בחוץ הבקבוקים השלבים הקודמים גם נשאר בחוץ EP בשלב זה.
  15. דגירה הלשונות צינורות EP ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  16. לשטוף את הלשונות עם PBS: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של PBS סטרילי ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
  17. לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.
  18. אחסן את TEM מוכן סטרילי PBS ב 4 ° C עד השימוש.

2. תלת מימדי (3D) למפת TSCC

  1. בניית מודל TSCC סטטי
    1. זרע 1.0 x 106 TSCC תאים בודדים (Cal27) לתוך תבשיל תרבות 3.5 ס"מ. להוסיף 3 מיליליטר של Dulbecco ששינה בינוני/F12 (DF12) המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) של נשר, ampicilin 90 µg/mL ו 90 kanamycin µg/mL.
    2. התרבות התאים Cal27 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. ודא כי התאים לכסות לפחות 60% שטח של תחתית צלחת.
    3. להעמיס TEM על טפט Cal27 בצלחת תרבות.
    4. מכניסים את המנה חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 28 ימים.
    5. רענן המדיום תרבות כל יום במהלך תהליך התרבות תאים. ריכוז2 CO בחממה הוא 5%.
  2. בניית מודל TSCC מנוער
    1. הכנת minibioreactor מנוער מתוצרת עצמית
      1. . תוציא את הבוכנה של מזרק 10 מ
      2. . תחפור בור (בקוטר של 1 ס מ) ליד הטרמינל התחתון של המוט וטען בר מערבבים לתוך החור.
      3. . תחפור בור (בקוטר של 0.5 ס מ) במרכז הפקק של בקבוק פלסטיק רחב-הפה, לשים את מוט בוכנה דרך הכובע.
      4. לחתוך חצי שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, הכול על הצד החיצוני של הפקק.
      5. לצרף עוד קרסים המוט על ידי ליפוף המוט עם חוטי דייג אשר קשורות של עוד קרסים.
        הערה: עד 4 עוד קרסים שניתן לחבר לו מוט-ברזל.
      6. אוטוקלב המתחם מתוצרת עצמית לפני השימוש.
        הערה: לעשות לא אוטוקלבים. הפה רחב בקבוק הפלסטיק. שימוש חדש סטרילי רחב-הפה בקבוק פלסטיק בעת culturing תאים.
  3. תרבית תאים דינמי
    1. זרע 1.0 x 106 Cal27 תאים בודדים ב- minibioreactor מתוצרת עצמית. להוסיף 150 מ ל בינונית DF12 אשר מכיל 10% FBS, ampicilin µg/mL 90 ו kanamycin 90 µg/mL.
    2. להעמיס TEM על minibioreactor באמצעות את עוד קרסים מחובר המוט.
    3. להדק את הפקק ולשים את minibioreactor על פגים. הפעל את minibioreactor ב 200 סל ד ב חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7-14 ימים.
      הערה: ריכוז CO2 בחממה2 CO הוא 5%.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה עבור הכנת TEM מתברר להיות יעילים והולמים. TEM הראה decellularization מושלם לעומת רקמות בשפת. היעילות של decellularization אושר ע י hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת (איור 1א-ב). הוא מכתים את התוצאות חשף להיעלמותן של צביעת גרעינית ב- TEM (איור 1B). יתר על כן, ה-DNA כימות תוכן מהעבודה הקודמת הראו כי ה-DNA הוסר כמעט לחלוטין TEM3. פרוטוקול זה הראה גם נזק נדיר שלמות רק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול ומבוססת על ייצור ECM decellularized צריך לשמור את ההרכב ECM מקורית בעת הסרת רכיבים תאית ברקמות כמעט לחלוטין21. למרות decellularization כעת מדווחת פרוטוקולים אשר דורשים זלוף דרך להערכת להסיר חומרים הסלולר בתחבורה הולכת חום, עצבנות מכני אומצה, המכונה השיטה המסורתית פשוט וזול22 , 23 , 24 , 25 , 26. יתר על כן, מאז הלשון הוא עשיר li...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים להכיר את התמיכה של מענקי מחקר הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31371390), את תוכנית המיזם המדינה ההיי-טק פיתוח (2014AA020702), התוכנית של גואנג-דונג מדע וטכנולוגיה (2016B030231001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברי C57-BL/6Jמעבדת אוניברסיטת סון יאט-סן מרכז
אתנולגואנגג'ואו מפעל ריאגנטים כימייםHB15-GR-2.5L
נתרן כלוריסנגון ביוטקA501218
אשלגן כלוריסנגון ביוטקA100395
דיבסיסי נתרן פוספטגואנגג'ואו מפעלריאגנטים כימייםBE14-GR-500G
אשלגן פוספט מונובסיסי Sangon BiotechA501211
צינור EP 1.5 מ"לAxygenMCT-150-A
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד תרמו פישר סיינטיפיק
3.5 ס"מ צלחת תרבית תאיםתרמו פישר סיינטיפיק153066
6 ס"מ צלחת תרבית תאיםגריינר628160
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'V900502
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'746495
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ449164
DNaseSigma-AldrichD5025
מגנזיום סולפטסנגון ביוטקA601988
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'158968
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S5761
אמפיציליןסיגמא-אולדריץ'A9393
קנמיציןסיגמא-אולדריץPHR1487
תפר כירורגישנחאי Jinhuan
250 מ"ל בקבוק פה רחבSHUNIU1407
מערבל מגנטיAS ONE1-4602-32
CO2 חממהSHEL LABSCO5A
10 מ"ל מזרקHunan Pingan
50 מ"ל צינור צנטריפוגהגריינר227270
תא Cal27האקדמיה הסינית למדעים, בנק התאים של שנחאילשון קרצינומה של תאי קשקש קו תאים
FBSHycloneSH30084.03
4 ° מקרר CHaier
מטהר מיםELGA
המוציטומטרBLAU717805
בעלי חיים' ' U2OS תא האקדמיה הסינית למדעים, בנק התאים של שנחאי קו תאי אוסטאוסרקומה אנושית DMEM/F12 סיגמא-אולדריץ' D0547 נתרן פירובט סיגמא-אולדריץ' P5280 חומצה ללא הפס BBI A600264

מקורות

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מטריצה חוץ-תאית (ECM) של לשון לאחר דה-צלולריזציהעיכול ב-DNaseביו-ראקטור מתוכנן עצמיתתרבית תאים סטטיתתרבית תאים דינמיתצביעת H&Eתאי Cal-27דה-צלולריזציה של רקמה
ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.