מאמר שיטה

ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים

DOI:

10.3791/57240

⸱

29 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina, 2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, 3Department of Instructions and Teacher Education, University of South Carolina

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ירוק הדר היא מחלה הרסנית במיוחד להשפיע על גידולי הדרים באופן גלובלי. המוצג כאן שיטה פשוטה משתמש PCR, דנ א גנומי, הפקת רקמת העלה הדר לצורך זיהוי ומדויקים המחלה ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, היא מחלה הדר הרסני ravaging החוות הדרים באופן גלובלי. מחלה זו גורמת עלה הצהובים סימטרית mottling וריד הצהבה, defoliation, שורש דעיכה, בסופו של דבר, למותו של הצמח הדרים. כאשר נגוע, הצמחים הדר יש קצב גדילתם ומפיקים פרחים מחוץ לעונה. הפרחים האלה נדירות מניבים פרי, ואלו המניבים פירות הדר קטן, מריר, חריגה זה לא רצוי. מחלה זו היא התפשטה את psyllid הדר אסיאתי, Diaphorina קמחית, ועל ידי משתילים רקמת הדר נגועים. המחלה יש תקופת הדגירה ארוכה ומשתנה בתוך המפעל הדרים – לפעמים שנים, לפני הופעת התסמינים. ניסיונות תרבות פתוגן זה במבחנה כבר נכשל, ייתכן שעקב הנמוך ואת ריכוז לא אחידה של המחלה בתוך נגוע רקמות הדרים, או כי קשה לשכפל את הסביבה תנאים להצטיינות הצמיחה של הפתוגן. . זה קשה מאוד לזהות את המחלה לפני שהיא התפשטה, בשל תקופת הדגירה ארוכה שלו ואת היכולת של חוקרי תרבות את הפתוגן. כתוצאה מכך, המחלה רק הופכת נראית לעין לאחר השמדת לפתע התשואה כולה של חקלאי הדרים. המובאת כאן היא שיטת איתור מדויק וספציפי הפתוגן ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp. באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי PCR. שיטה זו היא פשוט, יעיל, חסכוני, ו וישימה אנליזה כמותית. בשיטה זו ניתן להתאים לשימוש על כל רקמות הדרים; עם זאת, זה פוטנציאל מוגבל לפי הסכום של פתוגן נוכח הרקמה. ובכל זאת, שיטה זו לאפשר חקלאים הדר לזהות צמחים נגועים הדר קודם לכן, לבלום את התפשטות המחלה ההרסנית הזאת לפני זה יכול להתפשט עוד יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, גרמה לאובדן משמעותי של עצי הדר. במקרה זה פלורידה, שבו המחלה היא תחזית כדי לגרום 70% לירידה בייצור של פלורידה כתום תיבות של 244 מיליון תיבות עונת 1997-1998 70 מיליון תיבות עד 2016-2017 עונה1 מעל 90% של עצי הדר בפלורידה הם נגועים2, ההערכה היא כי תעשיית הדר פלורידה מאבד כמיליארד דולר בשנה עקב מחלות הדרים, שבו הדר ירוק ממלא תפקיד מרכזי3. ירוק הדר מופצת בעיקר על ידי פולשני psyllid אסיה הדרים Diaphorina קמחית, אבל גם יכול להיות להתפשט על-ידי הארכת רקמות הנגוע. המחלה גורמת הצהבה של ורידים, עלה הצהובים סימטרית mottling, defoliation מוקדמת, dieback זרד, שורש, ומוות של הצמח. חשוב לציין, המחלה גורמת תחנת הדר כדי לייצר פרחים מחוץ לעונה, אשר לעתים נדירות מייצרים פירות. הפרי המיוצר על ידי צמחים נגועים הדר הן ילדותי, ירוק ומריר טעימות4.

מטרת שיטה זו היא מדויקת ואת לזהות במדויק את החיידק תאי Candidatus liberibacter spp., סוכן סיבתי של ירוק הדרים, שחיו במרחק שיפה של עצי הדר נגוע5. דנ א גנומי מופק מרקמות העלה כולו, אשר מכיל חיידקים חיים. את הדנ א הגנומי שחולצו משמש כתבנית עבור PCR קונבנציונאלי, איפה oligonucleotides משלימים לרצף rDNA מטוסי אף-16 של החיידק משמשים כדי להגביר את הרצף הזה. Oligonucleotides משלים FBOX גן הדרים משמשים פקד הגברה פנימית. בחרנו להשתמש בשיטה זו, כי הוכח כדי להיות מוצלחת מחקר קודמות6.

בשיטה זו יש יתרון ברור של להיות פשוטה, זולה יחסית, ומסוגל לבצע במעבדה ביוכימיה בדרך כלל מאובזר בכל. בנוסף, ה-PCR נשאר שיטת ומדויקים מדויק ביותר עבור זיהוי הפתוגן הזה, בשל הקושי culturing הזאת הפתוגן7, ואת היכולת של המחלה לשרוד להתרבות במשך שנים בתוך המארח אסימפטומטיים8. מבחני ה-PCR מיוחדים שונים רבים השתמשו בהצלחה לזהות את הפתוגן; עם זאת, PCR קונבנציונאלי נשאר וזמינותו הפשוטה ביותר לצורך זיהוי מדויק וספציפי, במיוחד בתוך מארחים ללא תסמינים8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. לבודד דנ א גנומי מרקמות הצמח באמצעות ערכת חילוץ גנומית

  1. להשיג את רקמת העלה הדר על ידי חיתוך רענן כל העלים מעץ הדרים באמצעות מספריים נקי, ולמקם העלה לשקית פלסטיק נקי אוכל.
    הערה: התיק המכיל את רקמת העלה יוצבו במקרר 4 ° C או על קרח במיכל מבודד בהקדם האפשרי לאחר אוסף כדי למנוע קלקול.
  2. להוסיף כמות קטנה של חנקן נוזלי להרגע ומכתש. בעוד הם הם מצמרר, להשתמש במספריים לחתוך חתיכה קטנה של רקמת העלה, כ 1 אינץ ' רבוע בגודל. מקם את הרקמה לחתוך המליטה לעצור באופן מיידי את זה. להוסיף עוד חנקן נוזלי, במידת הצורך.
    הערה: כפפות מבודדות צריך תמיד להיות משוחק תוך טיפול בחנקן נוזלי.
  3. במהירות לטחון את רקמת הצמח לאבקה בסדר בעזרת המרגמה. המשך שחיקה עד החנקן הנוזלי מתאדה לגמרי, נותרה אבקה ירוקה.
  4. בקצרה צינת מרית מתכת בחנקן נוזלי עבור s 10-15, לאחר מכן סקופ הרקמה הקרקע בתוך המליטה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, בעזרת המרית.
  5. להוסיף 600 µL של פתרון פירוק גרעיני (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה µL 1000 ו מערבולת המדגם עבור s 1-3, ואז דגירה באמבט מים 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. להוסיף 3 µL של פתרון RNase lysate באמצעות פיפטה 10µL, להפוך את הצינור 2 - 5 פעמים כדי לערבב את זה, דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה בארון למשך 15 דקות.
    הערה: אפשר לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.
  7. להוסיף 200 µL של חלבון משקעים פתרון, מערבולת על מהירות גבוהה עבור 20 s ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 13,000 g x כדי ליצור גלולה המשרד. בעוד הוא להיות centrifuged לדוגמה, להוסיף µL 600 של אלכוהול איזופרופיל בטמפרטורת החדר צינור microcentrifuge mL 1.5 טריים.
  8. באמצעות פיפטה µL של 1000, הסר בזהירות את תגובת שיקוע מדגם centrifuged, העברת אותו הצינור microcentrifuge mL 1.5 טריים המכילים אלכוהול איזופרופיל. עכשיו יכול להיות מושלך בגדר.
    הערה: להימנע מזיהום את תגובת שיקוע עם חלבונים על ידי השארת כמות מזערית של תגובת שיקוע מעל בגדר.
  9. היפוך הצינור עד ה-DNA הופך לגלוי כמו מסה של חוט כמו קווצות ולאחר מכן צנטריפוגה-13,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. Decant את תגובת שיקוע, להוסיף 600 µL של 70% אתנול בגדר, להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את ה-DNA, צנטריפוגה-13,000 g x עבור 1 דקות.
  11. בזהירות תשאף האתנול, עוזב בגדר DNA חופשי, ואז פתח, היפוך ברכבת התחתית, נח על נייר סופג. האוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  12. להוסיף 100 µL של ה-DNA התייבשות פתרון בגדר דנ א מיובשים, ולאחר מכן דגירה הדנ א באמבט מים 65 ° C עבור 1 h, תוך כדי ערבוב מדי פעם על-ידי הקשה ברכבת התחתית.
  13. מקום 1 µL של מים מטוהרים על microcuvette ולאחר להכניס אותו לתוך ספקטרופוטומטרים כדי לשמש מקום ריק. חשב את ריכוז הדנ א הנוכחי על-ידי הצבת µL 1 מדגם microcuvette ולאחר הוספת ספקטרופוטומטרים. ריכוז ה-DNA (ng/µL) יכול להיות גורם דילול מחושב כמו (260-320) × × 50 ng/µL.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את הדגימה ב 4 º C.

2. לבצע את ה-PCR על דגימות דנ א גנומי

  1. לשלב 10 µL 2 x PCR מאסטר לערבב (ראה טבלה של חומרים), µL 1 קדימה פריימר (pM 10/µL), 1 µL הפוך פריימר (pM 10/µL) (ראה טבלה 2 רצפים פריימר), 100 ננוגרם של דנ א גנומי שחולצו מן המדגם, וטיהרו מים (עד 20 נפח סופי µL) ב 50 µL PCR צינור קפיצי לערבב, בקצרה צנטריפוגה.
  2. להכניס את הצינור PCR thermocycler ולהפעיל בהתאם (ראה טבלה 1).
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. במידת הצורך, לאחסן מדגם ב 4 ° C בתום התגובה.

3. ה-DNA מוגבר בג'ל Agarose electrophorese

  1. שוקל 0.4 g agarose אבקת ולהוסיף אותו יחד עם מאגר x TAE 1 נקי 200 מל Erlenmeyer את הבקבוק, מילוי עד 50 מ.
  2. מבשלים במיקרוגל בחום גבוה למשך דקות 1.5, רועדת בכל 30 s, עד agarose הוא להתמוססות מלאה.
    הערה: כפפות מבודדות לענידה לטיפול agarose נוזלי כדי למנוע כוויות.
  3. להוסיף 2.5 µL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד agarose נוזלי ו- shake לערבב ולאחר מכן שופכים את הג'ל agarose נוזלי לתוך תבנית ג'ל ברמה. להוסיף במהירות מסרקים ג'ל 12-שן רגילה לאחר שמזג.
  4. לאפשר את הג'ל להתקרר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את הג'ל מסרקים, ולמקם את הג'ל לתוך קופסת ג'ל ברמה מלא עם מאגר x TAE 1.
  5. שימוש של micropipette, לטעון את דגימות ה-DNA מוגבר הכולל לתוך בארות. להוסיף 5 µL של ה-DNA סולם (ראה טבלה של חומרים) לבאר נפרד מדגימות שלך.
  6. Electrophorese את הדגימות במשך 35 דקות קבועה 90 V, ולאחר מכן להסיר את הג'ל ולמקם transilluminator UV.
  7. צילום ולנתח את הג'ל פסי צבע דפוס תוך שימוש UV transillumination-302 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאה חיובית התשואות להקה ברורים המתאימים 500 bp טיריה Liberibacter Candidatus Las606/Lss6, ו/או להקה ברורים המתאימים ל- 700 bp Laa2/Laj5, מוסף בβ ribosomal מטוסי אף-16 אופרון9. הלהקה בקרת הגברה פנימית להופיע גם 400 bp. הלהקה הזאת מקביל הגברה של ג'ין FBOX הדר10, חייב להופיע על תוצאה להיחשב חוקיים (איור 1 ,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. זה קריטי כי כל השלבים עוקבים בדיוק כדי להשיג את התנאים האופטימליים ניסיוני רקמת כל העלה שימש במהלך הפגנה זו; עם זאת, ניתן לשנות בפרוטוקול תיאורטית לכלול כל סוג של רקמת הצמח. בעבר, חוקרים מופק דנ א גנומי רקמת הווריד של העלה, יותר מאשר רקמת העלה כולו, השיגו תוצאות דומות11. אם הלהקה התואם הגן FBOX הדר נכשל להופיע, התוצאה אינה חוקית, ייתכן שיש אחד או יותר של מספר שגיאות טכניות בהליך הפעלה. השגיאות הנפוצות כוללות: באמצעות מים מזוהמים או לא סטריליים, טיפים micropipette או צינורות microcentrif...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חן הואן, איאן ארתור פאלמר, ג'יאן חן, מינג צ'אנג, סטיבן ל' תומפסון, Fengquan Liu ו פו צ'ינג ג'נג מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וימשיג, ע מ ו צ ש פ; החקירה, ח ג, ג' C ו- F ש צ; משאבים, צ ש פ; כתיבת - הטיוטה המקורית, א פ א; כתיבה – סקירה & עריכה, פ א א, י ג, ה ג, S. T ל' ו צ ש פ; ויזואליזציה, ה ג; פיקוח, צ ש פ; מימון הרכישה, צ ש F ול' ש פ

פרוייקט הנתמך על ידי דרום קרוליינה שיפור המורה איכות ההשכלה הגבוהה המדינה מענק שכותרתו שיפור האמצעי ציונים מורים למדע של הידע של הצמח תהליכים, מבנים, פונקציות באמצעות מעורבות במחקר מדעי הצמח (צמח מדע)

קרנות הוענק על ידי יונייטד משביעה את משרד החינוך (CFDA מספר 84.367B)

המחברים רוצה להודות ד ר וואנג Nian באוניברסיטת פלורידה למתן דגימות דנ א גנומי מן נגוע סיננסיס הדר ולנסיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אשף ערכת טיהור DNA גנומיPromegaA1120מקור לפתרונות ליזיס גרעינים, RNase, משקעי חלבון ו-DNA
חנקןנוזלי מוצרי אווירN/A
Mastercycler pro עם לוח בקרהEppendorf6321000019
1250 WPanasonicN/A
5424 צנטריפוגה שולחניתEppendorf05-403-93
Isotemp 215 אמבט מים דיגיטליפישר מדעי15-462-15Q
מרית מתכתסיגמא-אולדריץ'Z283274
מרגמה ועליסיגמא-אולדריץ'Z247464
LSE מערבולת מיקסרקורנינג6775
2-פרופנולסיגמא-אולדריץ'I9516
סטרילי 10 μ טיפים LTipOne1161-3730
סטרילי 200 μ טיפים LTipOne1163-1730
סטרילי 1250 μ טיפים LTipOne1161-1750
ערכת פיפטור בנפח משתנהVWR75788-460
אתידיום ברומידסיגמא-אולדריץ'E1510
אגרוזIBI ScientificIB70041
EDTAתרמו פישר סיינטיפיק17892
חומצה אצטיתפישר כימיA38-212
בסיס טריססיגמא-אולדריץ'10708976001
μ קובטEppendorf6138000018
מגש יציקה ומסרקים הניתנים לערמהCarolina213655
PowerPac ספק כוח בסיסיBio-Rad1645050
Mini-Sub Cell GT SystemBio-Rad1704487EDU
ביוספקטרומטר בסיסיEppendorf6135000009
0.2 מ"ל צינורות PCRפישר מדעיAB-0620
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק3439
2X Taq ירוק PCR מאסטר מיקסPromegaM7122
פריימר קדימהתרמו פישר מדעיN/A
פריימר הפוךתרמו פישר מדעיN/A
סיגמא-אולדריץ'בדרגת PCR3315953001
Gel Doc XR+Bio-Rad1708195
1 KB+ סולם DNAThermo Fisher Scientific10787018
מיקרוגל מים,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
  4. UICEP. Pathology. , (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
  6. Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
  7. Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
  10. Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263(2012).
  11. Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRDNADNAUV

מאמרים קשורים