Method Article

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

DOI:

10.3791/57242

⸱

April 4th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספרואיד (צבירה multicellular) נחשב מודל של חיים רקמות בגוף האדם. למרות קידום משמעותי בתרבויות ספרואיד, רשת כלי הדם perfusable ב spheroids עדיין אתגר קריטי לתרבות לטווח ארוך נדרש לשמור ולפתח את הפונקציות שלהם, כגון חלבון ביטויים מורפוגנזה. הפרוטוקול מציג שיטה להשתלב רשת כלי הדם perfusable בתוך ספרואיד התקן microfluidic. כדי לגרום לרשת כלי הדם perfusable ספרואיד, הונחו נבטים האנגיוגנזה מחובר microchannels כדי ספרואיד ניצול גורמי אנגיוגנזה של אמבריולוגיה fibroblasts תרבותי ב ספרואיד. נבטים האנגיוגנזה הגיעו ספרואיד, התמזגה עם תאי אנדותל ותרבותית משותפת ב- ספרואיד, ויצרו רשת כלי דם רציפה. רשת כלי הדם יכול perfuse את הפנים של ספרואיד ללא דליפה כלשהי. נבנה לרשת כלי הדם ניתן להשתמש עוד יותר עבור אספקה של חומרים מזינים והסרה של חומרי פסולת, מחקה את זרימת הדם בתוך vivoכמו מסלול. השיטה מספקת פלטפורמה חדשה בתרבות ספרואיד לכיוון נעלה יותר של רקמות החי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעבר בין תרבות (דו מימדי) חד שכבתי לתרבות תלת מימדי מונע ע י צורך לעבוד עם מודלים תרבות המחקים את הפונקציות הסלולר של חיים רקמות1,2,3. מצעים פלסטיק שטוחה וקשה נפוץ תרבית תאים לא דומים ביותר של סביבות חוץ-תאית בגוף האדם. למעשה, מחקרים רבים להפגין ארכיטקטורה תלת מימדי התרבות הזו של רקמות ספציפיות לשחזר מכני וביוכימי רמזים, תקשורת, אשר לא נצפו תרבות דו מימדי קונבנציונאלי4, 5,-6,-7,-8.

צבירה multicellular ספרואיד, הוא אחד של טכניקות המבטיחים ביותר להבין זה תלת מימדי התרבות9,10. התאים המפרישים את מטריצה חוץ-תאית (ECM), יכולים לקיים אינטראקציה עם אחרים ספרואיד. למרות כמה אחרים בביו-הנדסה מתקרב11,12,13,14, כגון תא בערימה, בהצלחה לשכפל את המורכבות המרחבי של הגוף האנושי, הגישות הללו יש רק שניים או שלושה סוגים של תאים עבור להקל על ניתוח ממוקד רק תפקיד אחד של אברי המטרה. לעומת זאת, תאים spheroids חשופים לסביבות תרבות שונים בהתאם עמדותיהם ספרואיד בשל הטרוגניות אספקת חומרים מזינים, חמצן, ואת paracrine autocrine מולקולות ב ספרואיד איתות. תכונה זו של spheroids מחקה באופן חלקי ויוו תרבות תנאי, ומאפשרים התאים spheroids ליצירת רקמות מורכבים הרבה יותר, מאורגנת מבנה במבחנה מאלה תרבותי הערימה רקמות9, 15 , 16. הערה אם ספרואיד מורכבת מסוג אחד של תאים, תפקוד התאים ספרואיד אינו אחיד עקב בסביבה הטרוגנית ספרואיד. בשנים האחרונות, ספרואיד תרבויות מותר בתאי גזע pluripotent בתאי גזע עובריים (ESCs), המושרה (iPSCs) או בתאי גזע רקמות תושב לחקות ויוו רצפים התפתחותיים ואף ליצור מיני-איברים כגון המוח17, הכבד18ו כליות19,20.

למרות התקדמות משמעותית בשיטות תרבות ספרואיד, culturing spheroids גדול במשך זמן רב הוא עדיין בעייתי. טישו תלת מימדי, תאים צריך להיות ממוקם בתוך 150-200 מיקרומטר של כלי דם בגלל אספקת חמצן וחומרים מזינים21מוגבלת. רשתות כלי דם בתוך ספרואיד נחוצים לסכם החלפת חומרים בין הדם ורקמות בתוך vivo. כדי להשיג זאת, קבוצות אחרות משותף תרבותי תאי אנדותל עם היעד תאים22,23,24 או המושרה את הבידול של תאים pluripotent לתוך תאים CD31-חיוביות20. ובכל זאת, המבנים כלי דמוי דווח על אין סוף פתוח לומינה לאספקת חמצן וחומרים מזינים למרכז ספרואיד. כדי לחקות את תפקיד כלי הדם לטפח תאים בתרבות תלת מימדי, פתוח, perfusable רשת כלי הדם חייב להיות שפותחה ב- ספרואיד.

במהלך השנים האחרונות, כמה קבוצות מחקר בתחום microengineering דיווח שיטות לבנות רשת כלי דם perfusable, באופן ספונטני הנוצרת במכשיר microfluidic על-ידי ניצול גורמי אנגיוגנזה מתאי פיברובלסט cocultured25 ,26. רשתות אלה כלי הדם יש של המורפולוגיה דומה לכלים המקבילים ויוו , יכול להיות שופצה על ידי גורמים סביבתיים, שהופך אותם למתאימים עבור מחקה פונקציות וסקולרית בתרבות ספרואיד. המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד באמצעות פלטפורמה של microfluidic27. המכשיר microfluidic הוא שונה התקן שדווחה בעבר25 כך ספרואיד ניתן לשלב. על ידי הפניית הפרשה אנגיוגנזה של תאי פיברובלסט ספרואיד לתאי אנדותל של microchannels, האנגיוגנזה נבטים של microchannels את anastomosed עם ספרואיד ויצרו רשת כלי הדם perfusable. שיטה זו מאפשרת משלוח ישיר של מגוון רחב של חומרים, כגון פלורסנט מולקולות וחרוזים מיקרומטר-סולם אל פנים ספרואיד, אשר מספקת את המסגרת תרביות רקמה לטווח ארוך עם רשתות כלי דם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור התבנית Microfluidic התקן

  1. עיצוב התבנית של המכשיר microfluidic באמצעות תוכנה זמינים מסחרית (Clewin5 או AutoCAD 2016, וכו.). עבור הפונקציה של Clewin5, עיין במדריך למשתמש (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
    הערה: הקובץ עיצוב זמין 1 קובץ משלים.
  2. להעביר את הקובץ עיצוב מחולל מיקרו דפוס וטען את הכלי עם מסיכה כרום מצופה של photoresist חיובי.
  3. לחשוף את photoresist חיובי באזור דפוס באמצעות גנרטור דפוס מיקרו.
  4. לפתח את photoresist חיובי באמצעות היזם (טבלה של חומרים), יש לשטוף את המסכה במים (DI) יונים.
  5. באמצעות etchant של כרום (טבלה של חומרים), לחרוט הכרומיום באזור החשוף שבו הוסר את photoresist חיובי. יש לשטוף את המסכה במים DI.
  6. הסר photoresist על המסכה באמצעות אצטון הנותרים.
    הערה: שקיפות מסיכה יכול להיות חלופה עבור המסכה Cr.
  7. להכין רקיק סיליקון נקי (4 אינץ, P(100)) וספין מעיל hexamethyldisilazane (HMDS) ב-3000 סל ד ל 30 s.
  8. HMDS Softbake למשך 5 דקות על 120 ° C וקריר כשהפחד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. Spincoat photoresist שלילי (טבלה של חומרים) ב 500 סל ד עבור 10 s ו 1,200 סל ד ל 30 s.
    הערה: התנאי ציפוי ספין אמור להניב את השכבות photoresist עם עובי של 100 מיקרומטר על מוצרי קונדיטוריה לאחר פוטוליתוגרפיה.
  10. Prebake את photoresist שלילי 45 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, מגניב כשהפחד עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. בדוק את עוצמת אור UV ניסוי, לחשב את זמן החשיפה מנה אנרגיה חשיפה סה כ- 250 mW/cm2. מניחים את photomask (שלב 1.1-1.6) על כשהפחד, לחשוף אותם לאור UV.
  12. Postbake photoresist שליליות עבור 1 דקות ב- 65 ° C ו- 5 דקות-95 מעלות צלזיוס. לאפשר את לחם הקודש להתקרר למשך 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. לפתח את השכבה photoresist שלילית למשך 15 דקות באמבט מפתח (טבלה של חומרים) הראשון ו- 2 דקות באמבטיה השני. לשטוף את לחם הקודש באמבטיה אלכוהול איזופרופיל (IPA) הראשון 10 s ובאמבט IPA השני במשך 10 s.
  14. Hardbake photoresist שלילי במשך 30 דקות ב- 200 ° C וקריר כשהפחד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. למדוד את עובי השכבה photoresist שלילי בעזרת פרופיילר משטח.
  16. הכנס את לחם הקודש desiccator מחובר משאבת ואקום ולהוסיף 200 µL של silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). תדליק את המשאבה 10 דקות, ולאחר מכן כבה את זה ולשמור כשהפחד ב desiccator במשך 4 שעות.

2. צעדים ייצור, ההרכבה של שכבות PDMS

  1. הטלת הפולימר טרום polydimethylsiloxane (PDMS) (PDMS בסיס: אשפרה הסוכן = 10:1 (w/w)), דגה בתוך תא ואקום כבר שעתיים.
  2. התרופה PDMS ב 80 מעלות צלזיוס בתנור עם דש אוויר בין לילה.
  3. לקלף את PDMS מן כשהפחד סיליקון.
  4. אגרוף של 1A חורים - 3B (איור 1) ואת תרבות ספרואיד היטב. להשתמש אגרוף בקוטר 2-מ מ 1A חורים - 3B, בקוטר 1 מ מ אגרוף עבור ספרואיד טוב.
  5. לנקות המתים PDMS ואת תגית כיסוי זכוכית (24 מ"מ × 24 מ"מ) עם דבק, מאת שוב ושוב נדבקת, פילינג ביטול את הקלטת. אז תתייחס המתים PDMS עם אוויר פלזמה 40 s (40 mW, 50 sccm).
  6. בונד המתים PDMS על גבי בתגית כיסוי זכוכית לגרש את כל בועות האוויר מפני השטח בין המתים PDMS ואת מכסה התרופה ב 80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 שעות.

3. ספרואיד הכנה

הערה: במחקר, חלבון פלואורסצנטי אדום לבטא את חבל הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (RFP-HUVECs) ולבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP-HUVECs) HUVECs משמשים ספרואיד, microchannels, בהתאמה, כדי להבחין את מקור HUVECs לאחר הקמת רשת כלי הדם perfusable. אם המקור של HUVECs לא נחוצה, ללא תווית HUVECs הן מספיק בשביל הניסוי.

  1. להפשיר את RFP-HUVECs (3.0 × 105 תאים/מבחנה) ואת פיברובלסט אמבריולוגיה (hLF) (1.0 × 106 תאים/מבחנה) ולהוסיף אותם לתוך 10 מ"ל של מדיום עבור תאי אנדותל ותאים פיברובלסט, בהתאמה (טבלה של חומרים). תרבות אותם בקערה 100-מ מ- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 2-3 ימים עבור תת confluent RFP-HUVECs ו- hLFs. ההכנה הזאת תניב ~ 200 spheroids.
  2. לנתק את RFP-HUVECs ואת hLFs מתוך מבחר המאכלים עם 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, לעצור את תגובת טריפסין עם 4 מ"ל DMEM המכיל 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS) ו- 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין.
  3. לאחר צנטריפוגה ב g x 220 למשך 3 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את RFP-HUVECs ואת hLFs של המדיום אנדותל ריכוזי התא האחרון ב 2.5 × 104 ו- 1.0 × 105 תאים למ"ל, בהתאמה.
  4. להוסיף בעדינות µL 200 של התליה תא (5,000 תאים עבור RFP-HUVECs) ותאים 20,000 עבור hLFs לכל טוב בצלחת 96-ובכן עם משטח איגוד נמוך במיוחד.
  5. דגירה לצלחת 96-ובכן-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לתקופה של 2-4 ימים.
    הערה: מאז הקוטר ספרואיד תלוי תרבות תקופת ואת מספר הטלפון הראשונית בצלחת 96-ובכן, זה יכול להיות נשלט על ידי שני פרמטרים אלו.

4. תא זריעה במכשיר Microfluidic

הערה: המוסכמה למתן את החורים, ערוצים, ספרואיד את טוב מודגמות באיור1. אנו מגדירים יום 0 היום לאחר קציר תאים לתוך המכשיר microfluidic יושלם. תיאור סכמטי של צירי הזמן ניסיוני מוצג באיור2.

  1. טעינת ספרואיד יום − 1)
    הערה: בשלב הבא יש לבצעו על קרח כדי למנוע gelation של קולגן, פיברין.
    1. להמיס פיברינוגן בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עבור ריכוז סופי של 2.80 mg/mL.
    2. להכין ינוטרלו קולגן (3.0 מ"ג/מ"ל ב- PBS) על פי הפרוטוקול של היצרן.
    3. לשלב µL 107.2 בפתרון פיברינוגן (2.80 mg/mL), µL 8.0 ינוטרלו הקולגן (3.0 מ"ג/מ"ל) ו- 3.6 µL של aprotinin (5 U/mL) לכל תגובה בשפופרת. פתרון זה מתויג "הפתרון מיקס מאסטר" (MS).
      הערה: אמצעי האחסון נמצא מספיק עבור טעינת ספרואיד אחד. אם יש יותר מאחד ספרואיד, להכפיל כל אמצעי אחסון לפי מספר spheroids.
    4. להמיס תרומבין ב- PBS עבור ריכוז סופי של 50 U/mL.
      הערה: Aliquots של U/mL 50 תרומבין (20 µL tube) מאוחסנים −30 ° C, הם הקרת לפני ניסוי.
    5. מקם את הצלחת 96-ובכן המכיל את spheroids בתוך ארון אבטחה.
    6. להכין שתי צלחות פטרי 35 מ מ בפנים אבטחה, מארון עם צלחת אחת על קרח (תבשיל 1), המנה אחרים-benchtop (תבשיל 2). Pipet 99 µL של MS במרכז צלחת 1 (איור 3a) כדי ליצור droplet.
    7. לקצץ את הטיפים של 2 צהוב (10-100 µL) ונקה 3 טיפים פיפטה (1-100 µL) עבור האוסף של spheroids מהצלחת 96-ובכן, ערבוב תרומבין עם MS, אוסף מדויק spheroids, להזריק את spheroids לתוך המכשיר ולאחר הזרקת מדיה לתוך המכשיר , בהתאמה. גודל הנקבוביות של הקצה צריך להיות מעט גדול יותר מקוטר החורים 1A - 3B של ערוצים 1 ו- 3 או להתאים ספרואיד גם ערוץ 2 צמוד.
      הערה: בעתיד, אלא אם צוין אחרת, השתמש פיפטה בעצות לחתוך בשלב זה. הצילום של טיפים לחתוך זמין באיור4.
    8. לאסוף ספרואיד עם 100 µL בינוני מהצלחת 96-ובכן ולהוסיף אותו תבשיל 2 (איור 3 א).
    9. לאסוף את ספרואיד עם נפח מינימלי של מדיה מקערה 2. בעוד אתה מחזיק את pipettor זקוף, ספרואיד תנוע לכיוון התחתון של קצה pipet על ידי הכבידה. הוצא את ספרואיד על-ידי נגיעה בקצה pipet על גבי במניסקוס ה-droplet MS מנה 1 (איור 3 א).
      הערה: השלבים הבאים 4.1.10 & 4.1.11 צריכה להתבצע במהירות.
    10. מוסיפים 1 µL של תרומבין (50 U/mL) ומערבבים בעדינות עם קצה צהוב pipet.
    11. עם מוגדר 7 µL הפיפטה לאסוף את ספרואיד ומניחים לאט אותו לתוך הבאר ספרואיד (איור 3b).
    12. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 ° C עבור gelation של פיברין.
    13. לאט לאט להחדיר האמצעי אנדותל חורים בערוצים 1A, 3A, מילוי 1 ו- 3 עם מדיה (20 ~ 30 µL/ערוץ).
    14. מניחים את המכשיר בצלחת 100-מ מ עם Kimwipe רטוב כדי למנוע אידוי של מדיה מהמכשיר (איור 3 c).
    15. מקם את המכשיר ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 24 שעות ביממה להסיר את הבועות על הממשק בין המדיה לבין פיברין.
  2. יום 0) HUVECs טעינה
    1. הפשרת GFP-HUVECs (3.0 x 105 תאים/מבחנה) ולהוסיף אותם 10 מ"ל של המדיום אנדותל. תרבות אותם בקערה 100-מ מ- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 2-3 ימים להגיע sub-confluency. צלחת אחת של GFP confluent תת-HUVECs מספיקה להכנת 8-10 התקנים.
    2. ניתוק GFP-HUVECs מתוך מבחר המאכלים עם 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA ולהפסיק את תגובת טריפסין עם 4 מ"ל DMEM המכיל 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS) ו- 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין.
    3. לאחר צנטריפוגה ב g x 220 למשך 3 דקות, resuspend את ה-GFP-HUVECs במדיום אנדותל-5.0 x 106 תאים למ"ל.
    4. מזריקים HUVECs תא ההשעיה לתוך ערוץ 1 דרך החור 1B (µL לערוץ 20).
    5. להטות את המכשיר microfluidic 90°, להניח אותה על הצד, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להבטיח HUVECs לדבוק פיברין בערוץ 2.
      1. לאשר את הקובץ המצורף של HUVECs על פיברין. כאשר מספר HUVECs המחוברים הממשק בין ג'ל מדיום אינה מספיקה, להערכת עלול להתנתק בבסיס כלי הדם לאחר כמה ימים של המכשיר תרבות (איור 5). בפרוטוקול, שיעור ההצלחה זלוף הוא > 50%.
    6. חזור על הצעדים 4.2.4 ו 4.2.5 ערוץ 3.
    7. התרבות תאים בצלחת 100-מ מ עם Kimwipe לחה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 7-14 ימים.
  3. יום 1 ~) החלפת המדיה
    1. להחליף חצי של אמצעי התקשורת בערוצים 1 ו- 3 כל יום.

5. הגרעינים מכתים

  1. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.
  2. הסר את המדיה בערוצים 1 ו- 3 ולהוסיף 20 µL של 4% מחברים לכל ערוץ. כדי להחליף את הפתרון ב 4% מחברים, אני חוזר הסרת הפתרון מהמכשיר והוספת 4% PFA שלוש פעמים.
  3. דגירה המכשיר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. להסיר 4% מחברים התקן, לשטוף הערוצים שלוש פעמים עם PBS.
  5. הוסף 20 µL של µg/mL 10 הפלורסנט (טבלה של חומרים) לערוץ כתם גרעינים הסלולר. כדי להחליף את הפתרון במכשיר, חזור על הסרת הפתרון מהמכשיר והוספת µg 10/mL של הפלורסנט שלוש פעמים.
  6. לאחסן את המכשיר ב 4 ° C עבור 24 שעות.

6. נוזל זלוף של ספרואיד

  1. הכינו את ספרואיד לאחר culturing יותר מ 7 ימים את ההתקן-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 להשלמת שביל דם רציפה.
  2. הסר את המדיום חורים 1A, 1B, 3A ו- 3B.
  3. להציג את µL 10 של 10 מיקרומטר פתרון של fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי ב- PBS לתוך חורים 1A ו- 1B.
  4. נטר את הזרימה של גרגרי או צבע FITC תחת מיקרוסקופ הפוכה.

7. כימות של אורך נבט

הערה: התוכנה ver. 1.49 ImageJ משמש עבור כל ניתוח של התמונה במחקר זה.

  1. חופפים תמונות מהימים GFP-HUVECs 0, 1, 3, 5 ו- 7.
  2. להחסיר את המיקום של הקצה להערכת של יום 0 מאותו מיקום על התמונות שצולמו בימים 1, 3, 5 ו-7.
  3. לקבוע את הצמיחה של קצה וסקולרית מהמיקום שורש (איור 6). המרחק בין קצה כלי הדם לבין השורש הוגדרה כמו אורך נבט במחקר זה (איור 7 ב).

8. כימות של זוויות כלי דם

הערה: זווית וסקולרית הוגדרה כמו הזווית הורכב על ידי כלי הדם זווית, שורש, מרכז ספרואיד (איור 7c).

  1. Binarize את הדימויים ספרואיד coculture המכיל RFP-HUVECs פלורסנט ולמדוד את העמדה "centroid" על ידי ניתוח פונקציה ב- ImageJ. במחקר זה, המיקום נמדד "centroid" מוגדר במרכז ספרואיד (איור 6).
  2. לקבוע את המיקום של עצות כלי הדם ואת השורשים באותו אופן בשלב 7.
  3. למדוד את הזוויות כלי הדם באמצעות ניתוח פונקציית בתוכנה ImageJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מראה של עיצוב תמונה של המכשיר microfluidic. . יש לו שלושה ערוצי מקבילים, איזה ערוץ 2 מכיל את ספרואיד טוב... בערוצים 1 ו- 3 משמשים את התרבות HUVEC, ערוץ 2 מיועד ספרואיד. בכל אחד מהערוצים מופרדת באמצעות microposts הבסיסי נועד דפוס PDMS. Microposts למנוע את הידרוג בערוץ 2 דולפים לתוך בערוצים 1 ו- 3 על ידי מתח ומאפשרים החלפת חומרים בין ספרואיד HUVECs microchannels28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיווחים קודמים מראים כי hLFs מפרישים קוקטייל של מספר גורמי אנגיוגנזה, angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte פקטורי גדילה, שינוי צורה של גורם גדילה-α, הגידול נקרוזה מקדם, כמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים29, 30. Assay הזה מסתמך על הפרשה האנגיוגנזה מ hLFs ב ספרואיד coculture, אשר הוא המגבלה של הטכניקה. לכן, זה קריטי עבור מערך כלי הדם יציב להגדיר ספרואיד coculture בתחתית הבאר כך המרחק בין ספרואיד coculture את HUVECs את ערוצים 1 ו- 3 יכול להתקצר. אורך כלי דם מן fibroblas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרסט JST (גרנט מספר JPMJCR14W4), החברה עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI (גרנט מספר 25600060, 16K 16386), מרכז של חדשנות תוכנית MEXT, JST, התמקד בפיתוח טכנולוגיה הערכה מפתח מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED, Mizuho קרן לקידום מדעי. מיקרו-מלאכותית נתמכה על ידי אוניברסיטת קיוטו ננו טכנולוגיה Hub.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD 2017AutodeskAutoCAD 2017
מסכת כרום מצופה AZP 1350.טכנולוגיית משטח נקיCBL2506Bu-AZP
מחולל תבניות מיקרוהיידלברגuPG101
MF CD-26 מפתחחומרים אלקטרוניים רוהם והאס-מפתחבפרוטוקול 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24תחריט כרום בפרוטוקול 1.5
AcetonWako012-00343
פרוסת סיליקוןCanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS)Tokyo Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-Negativephotoresist בפרוטוקול 1.9
חשיפה UVטכנולוגיה ננומטרית בע"מLA310s
SU-8 מפתחMicroChemY020100מפתח לפוטו-רזיסט השלילי בפרוטוקול 1.13
2-פרופנולWako163-04841
פרופיל פני השטחVeecoVeeco Dektak XT-S
(טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאןסיגמא448931
פולידימתילסילוקסן (PDMS)Dow Corning Toray184W/C
ביופסיה אגרוף (1.0 מ"מ) Kai IndustriesBP-10F
ביופסיה אגרוף (2.0 מ"מ) Kai IndustriesBP-20F
מערכת פלזמהFemto ScienceCOVANCE
כיסוי זכוכיתMATSUNAMI זכוכיתC024241
תרבית כליםIwaki1000-035
RFP מבטא וריד טבורי אנושי תאי אנדותלאנגיו פרוטאומיcAP-0001RFP
פיברובלסטים ריאות אנושיים רגיליםלונזהCC-2512
גידול תאי אנדותל בינוניLonzaCC-3162
ערכות מדיה גידול פיברובלסטיםLonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific11965092
סרום בקרעוברי תרמו פישר Scientific26140079
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןWako168-23191
0.05w/v% טריפסין-0.53mmol/l EDTA• תמיסת 4Na עם פנולאדום Wako204-16935
PBS (מלחי חוצץ פוספט)Takara bioT900
96-well plateSumitomo bakelite631-21031
1000ul ChipNIPPON GeneticsFG-402
200ul  צ'יפNIPPON GeneticsFG-301
10ul צ'יפNIPPON Genetics37650
CO2 חממהתרמו פישר מודל מדעי370
GFP מבטא וריד טבורי אנושי תאי אנדותלאנגיו פרוטאומיcAP-0001GFP
פיברינוגן מפלזמת בקרסיגמאF8630
אפרוטינין מריאות בקרסיגמאA6279
קולגן Iקורנינג354236
תרומבין מפלזמת בקרסיגמאT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492צבע פלואורסצנטי להכתמת גרעינים בפרוטוקול 5.5
תמיסת פרפורמלדהידWako163-25983
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךOLYMPUSIX71
מצלמת CCD DegitalOLYMPUSORCA-R2
סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופ ביולוגיOLYMPUSFV1000
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךOLYMPUSIX-83
פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרןסיגמאFD70S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
  5. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  6. Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
  8. Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  11. Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
  12. Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373(2013).
  18. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481(2013).
  19. Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  20. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  21. Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
  22. Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
  23. Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
  24. Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
  25. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  26. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  27. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  28. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  29. Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513(2013).
  30. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  31. Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
  32. Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
  33. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Perfusable Vascular NetworkMicrofluidic DeviceSpheroid CultureAngiogenic SproutsEndothelial CellsPDMS SlabFibrin GelHUVEC LoadingVascular AnastomosisFITC Dextran Perfusion

Related Articles