פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית
במאמר זה
סיכום
תקציר
סויה (מקסימום גליצין (ל') עליזה משחק.) הוא מין חשוב חיתוך, הפך למודל קטניות המחקרים של מסלולים גנטי וביוכימי. לכן, חשוב להקים מערכת ביטוי גנים ארעי יעיל סויה. כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט להכנת protoplasts סויה ויישומו עבור ניתוחים פונקציונליים ארעית. מצאנו כי צעיר עוזב unifoliate של סויה שתילים, גרמו כמויות גדולות של protoplasts באיכות גבוהה. על-ידי מיטוב שיטה פג סידן-בתיווך טרנספורמציה, השגנו יעילות המרה גבוהה באמצעות protoplasts unifoliate סויה. מערכת זו מספקת מודל רב תכליתי ויעיל לבדיקה של מנגנונים מורכבים איתות ולניהולו בתאים חיים סויה, עזרה טוב יותר להבין תהליכים מגוונים הסלולר, התפתחותית, פיזיולוגיים של קטניות.
מבוא
Protoplasts הם תאי הצמח יש קירות התא הוסר. ככל שישמרו על רוב תכונות ופעילויות של תאי צמחים, protoplasts הם מערכת מודל טוב להתבונן ולהעריך מגוון אירועים הסלולר, הם כלי רב ערך מחקר סומאטית hybridisation1 ולשתול התחדשות2. Protoplasts כבר נעזרו גם נרחב צמח טרנספורמציה3,4,5, שכן קירות התא אחרת לחסום את המעבר של ה-DNA בתא. Protoplasts מחזיקים חלק התגובות הפיזיולוגיות, תהליכים תאיים של צמחים שלמים, ולכן מציע ערך יסוד במחקר בסיסי ללמוד חלבון subcellular לוקליזציה6,7,<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הגידול של הצמחים
- לזרוע זרעי סויה 5-10 (82 וויליאמס) בתוך סיר 13 ס מ בחממה בתנאים היום (16 h אור 1,500 µmol m s-2 -1) 25 ° c-תערובת אדמה מותאם אישית עבור סויה (1:1:1 יחס של חול אדמה, פרליט, טורפדו).
2. הכנת פלסמיד דנ א
- באמצעות פיפטה סטרילי עצה או קיסם, בחר שמושבה בודדת או גליצרול קפואים מלאי של e. coli נושאת את פלסמיד המכיל את הגן עניין, לחסן אותו 20 מ"ל לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי באנטיביוטיקה המתאימה בבקבוקון 50 מ.
- דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מטרף. לאסוף את החיידקים על ידי צריך שתוציאו את המתלים ב g x 12,000 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומחיקת את תגו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איברים שונים של פולי סויה 10 - בן יום נבדקו עבור פרוטופלאסט הכנה (איור 1), התשואות נצפו תחת המיקרוסקופ (איור 2). קירות התא hypocotyl, epicotyl היו בקושי מתעכל, ונשאר כמה תאים המחוברים אחד לשני (איור 2B, 2 ג). Cotyledon (דמות 2D), שורש (איור 2 א), קירות התא הוסרו רק בחלק קטן של התאים. לעומת זאת, נצפו מספר רב של protoplasts un.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה עבור בידודו של סויה protoplasts לבין היישום ללימודים ביטוי ארעית נבדק ביסודיות, עובד טוב מאוד במעבדה שלנו. ההליכים הם פשוט וקל, דורשת ציוד רגיל, עלות מינימלית. פרוטוקול שלנו מניב כמויות גדולות של protoplasts איכותי אחיד לעומת שיטות שדווחה בעבר34,35,36,37,38. עם זאת, מאז, ישנם גורמים רבים המשפיעים על התשואות פרוטופלאסט וקצבי טרנספורמציה מומלץ לחוקרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי צמח הגנום תוכנית מחקר של הקרן הלאומית למדע (NSF-PGRP-IOS-1339388).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| צלולאז CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| פקטוליאז Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| צלולאז "ONOZUKA" R-10 | צלולאז | 10 גרם | |
| MACEROZYME R-10 | קיבול | 10 גרם | |
| מניטול | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| רשת ניילון | קרולינה | 652222N | |
| צלחות תרבית רקמות | ארה"ב Scientific | CC7682-7506 | |
| סכיני גילוח | פישר | 12-640 | |
| המציטומטר | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA פלסמיד miniprep ערכת | אומגה | D6942-01 | |
| GeneJET פלסמיד Miniprep ערכת | תרמו מדעי | K0502 | |
| צנטריפוגה 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| צנטריפוגה 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet בקר | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל | אמביון | AM12450 | |
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה | דנוויל | C1018-P | |
| 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה | דנוויל | C1060-P | |
| סרום עגל יילוד | תרמו מדעי | 16010159 | |
| אדמה | משתלת | ||
| פרלייט | Vigoro | 100521091 | |
| חול טורפדו | JKS Ventures | ||
| LB מרק, לנוקס (אבקה) | Fisher | BP1427-500 |
מקורות
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
