Method Article

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סויה (מקסימום גליצין (ל') עליזה משחק.) הוא מין חשוב חיתוך, הפך למודל קטניות המחקרים של מסלולים גנטי וביוכימי. לכן, חשוב להקים מערכת ביטוי גנים ארעי יעיל סויה. כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט להכנת protoplasts סויה ויישומו עבור ניתוחים פונקציונליים ארעית. מצאנו כי צעיר עוזב unifoliate של סויה שתילים, גרמו כמויות גדולות של protoplasts באיכות גבוהה. על-ידי מיטוב שיטה פג סידן-בתיווך טרנספורמציה, השגנו יעילות המרה גבוהה באמצעות protoplasts unifoliate סויה. מערכת זו מספקת מודל רב תכליתי ויעיל לבדיקה של מנגנונים מורכבים איתות ולניהולו בתאים חיים סויה, עזרה טוב יותר להבין תהליכים מגוונים הסלולר, התפתחותית, פיזיולוגיים של קטניות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protoplasts הם תאי הצמח יש קירות התא הוסר. ככל שישמרו על רוב תכונות ופעילויות של תאי צמחים, protoplasts הם מערכת מודל טוב להתבונן ולהעריך מגוון אירועים הסלולר, הם כלי רב ערך מחקר סומאטית hybridisation1 ולשתול התחדשות2. Protoplasts כבר נעזרו גם נרחב צמח טרנספורמציה3,4,5, שכן קירות התא אחרת לחסום את המעבר של ה-DNA בתא. Protoplasts מחזיקים חלק התגובות הפיזיולוגיות, תהליכים תאיים של צמחים שלמים, ולכן מציע ערך יסוד במחקר בסיסי ללמוד חלבון subcellular לוקליזציה6,7,<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הגידול של הצמחים

  1. לזרוע זרעי סויה 5-10 (82 וויליאמס) בתוך סיר 13 ס מ בחממה בתנאים היום (16 h אור 1,500 µmol m s-2 -1) 25 ° c-תערובת אדמה מותאם אישית עבור סויה (1:1:1 יחס של חול אדמה, פרליט, טורפדו).

2. הכנת פלסמיד דנ א

  1. באמצעות פיפטה סטרילי עצה או קיסם, בחר שמושבה בודדת או גליצרול קפואים מלאי של e. coli נושאת את פלסמיד המכיל את הגן עניין, לחסן אותו 20 מ"ל לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי באנטיביוטיקה המתאימה בבקבוקון 50 מ.
  2. דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מטרף. לאסוף את החיידקים על ידי צריך שתוציאו את המתלים ב g x 12,000 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומחיקת את תגו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איברים שונים של פולי סויה 10 - בן יום נבדקו עבור פרוטופלאסט הכנה (איור 1), התשואות נצפו תחת המיקרוסקופ (איור 2). קירות התא hypocotyl, epicotyl היו בקושי מתעכל, ונשאר כמה תאים המחוברים אחד לשני (איור 2B, 2 ג). Cotyledon (דמות 2D), שורש (איור 2 א), קירות התא הוסרו רק בחלק קטן של התאים. לעומת זאת, נצפו מספר רב של protoplasts un.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עבור בידודו של סויה protoplasts לבין היישום ללימודים ביטוי ארעית נבדק ביסודיות, עובד טוב מאוד במעבדה שלנו. ההליכים הם פשוט וקל, דורשת ציוד רגיל, עלות מינימלית. פרוטוקול שלנו מניב כמויות גדולות של protoplasts איכותי אחיד לעומת שיטות שדווחה בעבר34,35,36,37,38. עם זאת, מאז, ישנם גורמים רבים המשפיעים על התשואות פרוטופלאסט וקצבי טרנספורמציה מומלץ לחוקרי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי צמח הגנום תוכנית מחקר של הקרן הלאומית למדע (NSF-PGRP-IOS-1339388).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
צלולאז CELFWorthington Biological CorporationLS002611
פקטוליאז Y-23BioWorld9033-35-6
צלולאז "ONOZUKA" R-10צלולאז10 גרם
MACEROZYME R-10קיבול10 גרם
מניטולICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
רשת ניילוןקרולינה652222N
צלחות תרבית רקמותארה"ב ScientificCC7682-7506
סכיני גילוחפישר12-640
המציטומטרhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA פלסמיד miniprep ערכתאומגהD6942-01
GeneJET פלסמיד Miniprep ערכתתרמו מדעיK0502
צנטריפוגה 5810eppendorf5811000827
צנטריפוגה 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet בקרJencons14526-202
Zeiss 710 מיקרוסקופ קונפוקליZeissN/A
Nonstick, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"לאמביוןAM12450
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהדנווילC1018-P
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהדנווילC1060-P
סרום עגל יילודתרמו מדעי16010159
אדמהמשתלת
פרלייטVigoro100521091
חול טורפדוJKS Ventures
LB מרק, לנוקס (אבקה)FisherBP1427-500
אינגרם

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soybean ProtoplastsProtoplast IsolationPEG TransformationTransient Gene ExpressionEnzyme DigestionW5 SolutionConfocal MicroscopyHemocytometer CountingUnifoliate LeavesSoybean Seedlings

Related Articles