Method Article

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

DOI:

10.3791/57295

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות pBIBAC-GW וקטור בינארי הופך ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד ללא פגע, תהליך קל ופשוט. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג מדריך את הקורא לאורך התהליך הטרנסגניים תודרנית מפעלים לייצור, ובדיקות את הצמחים על intactness, להעתיק מספר התוספות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת יצירת הצמחים הטרנסגניים, בדרך כלל המטרה היא שיהיה יציב לביטוי transgene. פעולה זו דורשת שילוב יחיד, שלם של transgene, גם מרובת עותקים שילובים נחשפים לעיתים קרובות ג'ין להחרשת. הווקטור שער תואמת בינארית המבוסס על חיידקי מלאכותי כרומוזומים (pBIBAC-GW), כמו אחרים נגזרים pBIBAC, מאפשר החדרת transgenes עותק יחיד עם יעילות גבוהה. כמו שיפור pBIBAC המקורי, קלטת שער נשלטה לתוך pBIBAC-ג'י, כך הרצפים של עניין ניתן עכשיו בקלות לשלב ההעברה וקטור DNA (T-DNA) על-ידי שיבוט שער. בדרך כלל, השינוי עם pBIBAC-GW תוצאות יעילות של 0.2-0.5%, לפיה מחצית transgenics נושא שילוב יחיד-עותק שלם ב- T-dna. PBIBAC-GW הווקטורים זמינים עם עמידות Glufosinate-אמוניום או DsRed זריחה במעילים seed עבור בחירה בצמחים, ועם התנגדות kanamycin כבחירה של חיידקים. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג שמנחים את הקורא לאורך התהליך של יצירת הצמחים הטרנסגניים באמצעות pBIBAC-GW: החל משילוב מחדש את רצפי עניין לתוך וקטור pBIBAC-GW של בחירה, לשתול טרנספורמציה עם Agrobacterium, מבחר של transgenics, ובדיקות את הצמחים על מספר intactness, ולהעתיק הכיסויים באמצעות DNA סופג. תשומת לב ניתנת לתכנון אסטרטגיה blotting DNA לזהות copy יחיד מרובי שילובים-לוקוסים מרובות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת יצירת הצמחים הטרנסגניים, בדרך כלל המטרה היא לקיים את transgene(s) משולב stably הביע. זו יכולה להיות מושגת על ידי עותק בודד ללא פגע שילובים של transgene. שילובים מרובות עלולה לגרום ביטוי מוגבר transgene, אלא גם ג'ין להחרשת. וכמובן transgenes סביר יותר אם רצפים שנוספו מסודרים טנדם או הפוך חזרה1,2,3,4. וקטורים בינארי משמשים הסעות ב Agrobacterium-מתווכת טרנספורמציה ניסויים כדי לספק את רצפי עניין לתוך הגנום הצמח. מספר שילובים לתוך הגנום הצמח תלויה עותק מספר בינארי וקטור ב-5, Agrobacterium tumefaciens6. וקטורים בינאריים נפוצים רבים הן וקטורי העתק גבוהה, ולכן התשואה מספר עותק transgene ממוצע גבוה: 3.3 ל 4.9 עותקים תודרנית5.

ניתן להוריד את מספר שילובים T-DNA באמצעות וקטורים בינארי כי יש מספר נמוך-עותק tumefaciens א, כגון BIBAC7, או על-ידי שיגור T-DNA בין כרומוזום tumefaciens א 5. המספר הממוצע של שילובי transgene במקרים כאלה הוא מתחת 25,8,9,10. בשל היותם עותק יחיד ב- tumefaciens א, וגם ב- Escherichia coli, BIBAC-נגזרים יכול לתחזק ולספק בונה גדול כמו 150 kb11.

GW תואמי BIBAC וקטורים10,12 לאפשר הקדמה קלה של הגנים של עניין לתוך הווקטור באמצעות שער שיבוט. השימוש בטכנולוגיה שער מאוד מפשט את הליך השיבוט, אבל גם מתגבר על בעיות נפוצות המשויך וקטורים נמוך-העתקה-מספר גדול13,14, כגון תשואה נמוכה של DNA ומבחר מצומצם של הגבלת ייחודי אתרים זמינים עבור שכפול7,11. נגזרות pBIBAC-GW זמינים גם התנגדות Glufosinate-אמוניום (pBIBAC-בר-GW) או DsRed זריחה במעילים הזרע (pBIBAC-RFP-GW) לבחירת צמחים (איור 1)10,12. עבור שני וקטורים, גן עמידות kanamycin משמש סמן הבחירה של חיידקים.

לשלב הווקטורים pBIBAC-GW: מניפולציה גנטית ב e. coliו שילובים עותק יחיד (2) שלם ב הפיסקו יעילות גבוהה ועיצוב קל (1). PBIBAC-GW וקטורים התשואה על שילובים בממוצע 1.7 ב תודרנית כמחצית הצמחים הטרנסגניים נושא יחיד משולב T-DNA10.

ביטוי יציב של transgenes הוא דרישה עבור רוב transgenics שנוצר. Transgene יציב הביטוי יכולה להיות מושגת על ידי שילובים ללא פגע, עותק יחיד. עבודה עם הצמחים הטרנסגניים נושא שלם, עותק יחיד שילובים היא, עם זאת, חשוב אפילו יותר אם לדוגמה, המטרה היא לחקור את היעילות של תהליכים מבוססי-כרומטין, כגון מוטגנזה מכוונת, רקומבינציה, או לתקן את התלות של אלה תהליכים על המיקום גנומית ומבנה כרומטין במתחם הכניסה. על האינטרסים שלנו, ללמוד את התלות של oligonucleotide ביים מוטגנזה מכוונת (ODM) על ההקשר המקומי גנומית, קבוצה של קווים כתב עם תוספות ללא פגע, עותק יחיד של גנים כתב מוטגנזה מכוונת היה (איור 2) שנוצר10. באמצעות ערכת שורות, זה הוצג כי היעילות ODM משתנה בין לוקוסים הטרנסגניים משולב במקומות שונים גנומית, למרות רמות הביטוי transgene להיות דומה למדי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הוספת רצף של עניין וקטור בינארי

  1. להכין את שער הכניסה וקטורים בינארי.
    1. לבודד את הווקטור שער כניסה הכוללת של מקטע דנ א או הגן עניין באמצעות ערכת הכנה מיני לפי ההמלצות של הספק.
      הערה: BIBAC-GW וקטורים דורשים שימוש kanamycin (ק מ) לבחירה של חיידקים, לכן, השתמש וקטור כניסה עם עוד סמן ההתנגדות במקום kanamycin. למשל, וקטור pENTR ג ' נרל מוטורס, נושא גן עמידות גנטמיצין, הוא בחירה טובה12.
    2. הפץ ולבודד את הווקטור BIBAC-GW של עניין. השתמש זן e. coli אשר עמיד בפני הרעילות של הגן ccdB מתנה בתוך בקלטת שער. ולבודד BIBAC-וקטורים באמצעות פרוטוקולים או ערכות שתוכננה במיוחד עבור פלסמידים גדול פי השאות של הספק.
  2. לבצע את תגובת שער.
    1. להכין את התגובה רקומבינציה LR לפי ההמלצות של הספק. לערבב את המרכיבים הבאים בצינור microcentrifuge 1.5 mL בטמפרטורת החדר (RT): 100 – 300 ng כניסה שיבוט (supercoiled), 300 ng של BIBAC-GW וקטור, LR Clonase התגובה מאגר (הריכוז הסופי: 1 x). לכוונן את עוצמת התערובת µL 16 עם טה (10 מ"מ. טריס, 1 מ מ EDTA, pH 8.0). לבסוף, להוסיף 4 µL LR Clonase האנזים לערבב, לערבב בעזרת vortexing. דגירה התערובת 25 ° c עבור 1 h.
    2. לסיים את התגובה LR על-ידי הוספת 2 µL של פתרון Proteinase K (2 µg/µL) לתערובת מוכן בשלב 1.2.1. לערבב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. להפוך e. coli עם תערובת התגובה שער על ידי אלקטרופורציה.
    1. Desalt את תערובת התגובה LR לפני אלקטרופורציה.
      הערה: שלב זה הוא קריטי עבור אלקטרופורציה מוצלחת. להלן דיאליזה שיטה זו שיטות המתוארים, אך אחרים כגון משקעים עם סודיום אצטט, אתנול יכול לשמש גם.
      1. היכונו הגדרת מסנן דיאליזה התגובה LR. שופכים 20 מיליליטר מים יונים הנדסה גנטית לתוך צלחת פטרי סטריליות. מקום דיסק סנן ממברנה (גודל הנקבוביות = 0.025 מיקרומטר) על פני המים.
      2. Pipette התגובה LR כולו בזהירות על גבי הקרום ולאפשר את התערובת עד dialyze ב RT לשעה.
    2. להוסיף 5 µL של המיקס LR desalted לתאים DH10B אלקטרו-המוסמכת cuvette אלקטרופורציה (0.1 ס מ). Electroporate התאים (V 1.5/ס, התנגדות 200 Ω, קיבוליות 25 µF), מיד להוסיף 1 מ"ל ומחוממת מראש Catabolite אופטימלית סופר הדיכוי (SOC) בינוני על התאים, ואחריו הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, 180 סל ד. (SOC בינוני, 1 l: 20 גר', מה נשארתי טריפטון, 5 גר' שמרים לחלץ, 0.5 גר' NaCl, 2.5 מ של 1 מ' אשלגן כלורי, 20 מ של 1 מ' מסנן-עיקור גלוקוז).
      הערה: DH10B תאים הרבה מכדי התאים האחרים, e. coli stably לשמור על פלסמידים גדולים.
      הערה: התנאים אלקטרופורציה אופטימלית תלויות המכשיר אלקטרופורציה בשימוש.
    3. גלולה החיידקים במהירות המרבית עבור 30 s באמצעות של microcentrifuge, להסיר את עודף SOC, resuspend בגדר כ 50-100 µL בינוני לוריא-Bertani (ליברות). להפיץ את החיידקים על צלחות kanamycin-ליברות (ק-ליברות) (ריכוז ק מ, µg 40/mL), דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. (LB בינוני, 1 l: 10 גרם של מה נשארתי טריפטון, 5 גר' שמרים לחלץ, 10 גרם של NaCl. בינוני מוצק הוסיפו אגר, 15 גר'/ליטר).
  4. לזהות את המעו ף משולבות מחדש של BIBAC-ג'י, לבודד דנ א פלסמיד.
    1. כדי שתוכל לגדול על צלחות ק מ- LB, התאים e. coli צריך להכיל את פלסמיד BIBAC-GW משולבות מחדש של שבו רצף ccdB מוחלף עם הוספת הרצוי. השתמש המושבה פולימראז תגובת שרשרת (PCR)15 כדי לבדוק אם מושבות חיידקים על הצלחת להכיל את פלסמידים הנכונה, יש עמוד השדרה BIBAC-GW והוספה של עניין.
      1. כדי לזהות את עמוד השדרה pBIBAC-בר-GW, לבצע תגובה15 PCR עם תחל DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'ו DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. קבוצה זו תחל מגביר את קטע bp 563 של הגן בר .
      2. כדי לבדוק הנוכחות של עמוד השדרה BIBAC-RFP-GW, לבצע PCR15 תגובה, באמצעות תחל M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'ו M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. שילוב זה פריימר מגביר את קטע bp 791 חופפים הרצף promotor ו- rfp cruciferin.
      3. לבצע PCR15 תגובות באמצעות תחל גנים ספציפיים כדי לבדוק נוכחות של הוספה עניין.
    2. לחסן מושבה בודדת חיובית ב- 2-5 מ ל LB בינוני המכיל kanamycin (40 µg/mL) עבור בידוד של דנ א16. דגירה-37 מעלות צלזיוס על תפקודי לב / נשימה-180 סל ד, בין לילה.
    3. לבודד את פלסמיד דנ א (ראה שלב 1.1.2).

2. הכנת tumefaciens א לטבילה פרחוני של תודרנית

  1. להפוך BIBAC-GW נגזרים כדי tumefaciens א.
    1. להכין תאים אלקטרו-המוסמכת של המסייע זן C58C1 נושאת את pCH32 tumefaciens א פלסמיד7. לגדול חיידקים בנוכחות טטרציקלין (5 µg/mL), ריפאמפיצין (100 µg/mL) כדי לבחור את pCH32 ולהבטיח צמיחת תאים Agrobacterium .
    2. להוסיף 0.25-0.5 µg-DNA של נגזרת pBIBAC-ג'י, מראש מומס במים 10 – 20 µL סטרילי הנדסה גנטית יונים, לתאים 20 µL המוסמכת Agrobacterium אלקטרופורציה וואקום (0.1 ס מ). לשמור תאים על קרח.
    3. Electroporate התאים (1.5 V/ס מ, התנגדות 400 Ω, קיבוליות 25 µF). מיד לאחר אלקטרופורציה, להוסיף 1 מ"ל ומחוממת מראש (28 מעלות צלזיוס) SOC בינוני של חיידקים, דגירה התאים ב 28 מעלות צלזיוס למשך 60-90 דקות.
    4. להפיץ 100 µL ואת שאר החיידקים על צלחות LB נפרד המכיל ריפאמפיצין (100 µg/mL), טטרציקלין (5 µg/mL) ו kanamycin (40 µg/mL) ולאחר תקופת דגירה בחושך ב 28 ° C של 1-2 ימים.
  2. הכינו את המתלים Agrobacterium .
    1. בדוק על-ידי ה-PCR מספר המושבות tumefaciens א מהצלחת מוכן בשלב 2.1.4, נוכחות של הווקטור המתאים (ראה שלב 1.4.1).
    2. פס שמושבה בודדת אישר להכיל את הווקטור בינארי עם תותב המתאים בצלחת LB אנטיביוטיקה (ראה שלב 2.1.4). לגדול-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. חזור על ומבטא עם שמושבה בודדת שהושג בשלב 2.2.2.
    4. לחסן מושבה בודדת ב- 2.5 מ של מדיום LC בתוספת אנטיביוטיקה (ראה שלב 2.1.4) עבור preculture. דגירה על 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 8 שעות או למשך הלילה, 180 סל ד. (LC בינוני, 1 l: 10 גרם של מה נשארתי טריפטון, 5 גר' שמרים לחלץ, 0.5 g של NaCl, 2.5 גר' MgSO4 · 7 שעות2א, 2 גרם מלטוז).
    5. הוסף את preculture צעד 2.2.4. 250 מ ל LC בתוספת אנטיביוטיקה (ראה שלב 2.1.4) ולחצו לגדול ב 28 ° C, ב 180 סל ד, בין לילה.
    6. צניפה התרבות על ידי ספינינג-g x 5,500 עבור 12 מינימלית מחדש להשעות בגדר 100 מ ל תמיסת המכילה 5% סוכרוז, 0.05% Silwet L-77, 0.5 x גב' Pour ההשעיה לתוך מיכל סטרילי לטבילה פרחוני של הצמחים.

3. תודרנית טרנספורמציה

  1. היכונו הצמחים תודרנית לשינוי.
    1. לגדל צמחים תודרנית בחדר גדילה מבוקרת חממה או היסטוריים עד שהם פורחים (12 סירים עם 9 צמחים כל לכל טבילה).
    2. קליפ את המנעולים הראשונה כדי לאפשר יותר משני ברגים להגיח. צמחים מוכנים לטבילה 4-6 ימים לאחר החיתוך, כאשר הצמחים יש ראשים פרח לא בשלה רבים ורבים לא מופרית siliques.
  2. טובלים פרחוני
    1. טובלים התפרחות במשך 5-10 s ההשעיה Agrobacterium מוכן בשלב 2.2.6. השתמש עצבנות עדין.
    2. לעטוף את החלקים מעל הקרקע של הצמחים תיאחז הסרט כדי לשמור על לחות גבוהה, מכסים של סירים צמח עם קופסא כדי לשמור על הצמחים בחושך. דגירה הצמחים במשך יומיים בחדר חממה/צמיחה.
    3. הסר את תיבת ואת הסרט תיאחז ולגדול הצמחים לפדיון בחדר חממה/צמיחה.
      הערה: כדי להגדיל את היעילות של טרנספורמציה, הצמחים אותו ניתן מחדש טבל 7 ימים לאחר טבילה ראשונה.
    4. לקצור את הזרעים. בריכה ולנתח את הזרעים (T1) של צמחים, טרנספורמציה עם הבונה אותו, כערכה בודדת.
  3. מסך עבור הצמחים הטרנסגניים.
    1. על המסך עבור הצמחים הטרנסגניים טרנספורמציה עם נגזרת pBIBAC-RFP-GW, לנתח את הזרעים באמצעות מיקרוסקופ זריחה. על מנת לזהות ביטוי DsRed במעילים זרע, תמונה את הזרעים של עירור של 560 ננומטר, פליטה של 600-650 ננומטר. להפריד את הזרעים פלורסנט עמיתיהם הלא-פלורסנט באמצעות מלקחיים.
    2. על המסך עבור הצמחים הטרנסגניים טרנספורמציה עם נגזרת pBIBAC-בר-GW, לזרוע את הזרעים במגשים מלא אדמה (~ 2,500 זרעים/0.1 מ'2). כדי להבטיח אפילו שמתפשטת של זרעים מגשים, להשעות את הזרעים ב- 0.1% אגר ב 0.5 x בינוני Murashige Skoog (MS), להפיץ את הזרעים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
      הערה: כדי לעורר את הזרעים לנבוט באופן סינכרוני, דגירה הזרעים לפחות 2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. זה יכול להיעשות לפני או אחרי זורעים את הזרעים.
      1. לרסס את השתילים עם 0.5% Glufosinate-אמוניום פתרון 2 שבועות ו- 3 שבועות לאחר הזריעה המגשים. השתמש 500 מ"ל של Glufosinate-אמוניום פתרון לכל 1 מ'2.
      2. העברת השתילים ששרד סירים נפרדים. תמונה אופיינית של מגש עם שתילים לפני ואחרי טיפול Glufosinate-אמוניום (השני) מוצגים באיור3.
      3. לנתח את הצמחים Glufosinate אמוניום-עמיד על ידי ה-PCR לנוכחות של הבונה של הריבית (ראה שלב 1.4.1. עבור תחל).
        1. לבודד את ה-DNA גנומי צמח עבור ה-PCR באמצעות השיטה המתוארת על ידי אדוארדס. et al. 17

4. אפיון את Transgenics על המספר ועל שלמות של שילובי T-DNA

  1. האסטרטגיה של הגבלת digestions
    הערה: לקבוע את מספר שילובים T-DNA ואת היושר שלהם על ידי DNA סופג באמצעות אנזימי הגבלה. שיטה זו מאפשרת לזהות יחיד, אך גם חזר על שילובים-לוקוסים זהים או שונים בגנום.
    1. השתמש סדרה של הגבלת digestions כדי לזהות את דפוסי אינטגרציה שונים אפשריים:
      1. בחר אנזים שחותך פעם אחת באמצע T-DNA, כדי שתוכל לחקור באופן עצמאי את רצפי ויוצאת של אתר ההגבלה (איור 4A ואיור 7 א-ג). ראה איור 4A, והאגדה איור על התוצאות הצפויות ועל פרשנות.
      2. בחר אנזים או שילוב של אנזימים חותכים את הרצף כולו עניין בו זמנית (איור 4B וכן איור 7 א-D). כל סטייה מן האורך ידוע מציין לחיתוך בקלטת משולב.
        הערה: לטפל כדי להשתמש רק אנזימי הגבלה שאינם רגישים ציטוזין מתילציה.
  2. להכין דגימות ה-DNA גנומי.
    1. לבודד את ה-DNA גנומי מצמחים נושאת הבונה של ריבית. שיטה miniprep CTAB DNA יכול לשמש עבור בידוד של דנ א18. לדנ א כתם ניתוח של תודרנית דנ א, 2 – 2.5 µg של דנ א גנומי נדרש. להמיס את הדנ א ב 50 µL של טה.
    2. בדוק את שלמות הדנ א על ידי ג'ל אלקטרופורזה16. שלמות הדנ א נודד כלהקה דיסקרטית אחד בחלק העליון של הג'ל. ניתן לזהות DNA השפלה כמו הנוכחות של כתם. כדי למנוע נזק לדנ א עקב חוזר ונשנה לאפס-מפשיר, נשמרות דגימות דנ א גנומי ב 4 º C.
    3. לעכל את הדנ א (2-2.5 µg במקרה של דנ א גנומי תודרנית ) בהנפח הכולל של 50 µL, בן לילה, באמצעות מאגר תנאים שהוצעה על ידי הספק אנזים.
      1. במבחנה, מערבבים 2 – 2.5 µg של תודרנית הדנ א, 5 µL 10 x הגבלת מאגר 5 אנזים הגבלה U סך של 50 µL מים יונים הנדסה גנטית.
    4. להוסיף צבע טעינה (1 x ריכוז סופי) הדגימות ההגבלה לפני טעינת על ג'ל. עבור מעקב ויזואלי טוב, השתמש באחת מהאפשרויות הבאות: comigrating עם שברים קטנים (כחול Bromophenol, 350 – 400 bp), או comigrating עם שברים גדולים יותר (Cylene cyanol, kbp 3-4).
  3. הפעל את הג'ל הדנ א.
    1. להכין הרבה זמן (20 ס"מ) 0.5 x TBE agarose ג'ל19. האחוזים של agarose הג'ל תלוי גודל המקטע צפוי. 0.8-1% מפריד בצורה אופטימלית בין שברי > בגודל של 1 kb. השתמש 1 – 1.5% agarose על שברי < 1 kb. אל תוסיף אתידיום ברומיד לג'ל. (5 x TBE, l: 54 1g של Trizma בסיס, 27.5 גר' חומצת, g 3.75 של EDTA).
      הערה: כדי למנוע זיהום ה-DNA, מגשי ג'ל לשימוש שלא נעשה בהם שימוש כדי fractionate פלסמיד ו- PCR מוגבר הדנ א.
    2. לטעון את הדגימות ג'ל19.
    3. להוסיף סמני DNA הג'ל הנמצאים בטווח גודל של השברים הצפוי. לטעון כ 1 µg של סמן (50-250 ng של קטע בגדלים שונים) על הג'ל כדי לאפשר הדמיה על ידי אור UV.
    4. Fractionate בן לילה של ה-DNA-מתח נמוך (40 – 50 V/500 mA) גודל.
  4. היכונו העברה של ה-DNA של הג'ל agarose למוח ניילון.
    1. להעביר את הג'ל במגש נפרד, את הכתם למשך 20-25 דקות ב- 0.5 x TBE המכיל אתידיום ברומיד (5 µg/mL) על-ידי סיבוב ב 40 סל ד ב תפקודי לב / נשימה.
    2. דמיינו את הג'ל על transilluminator UV. ודא ההפרדה בגודל של ה-DNA גנומי, כולל הניראות של להקות בלוויין דיסקרטית (איור 5A). כתם לכיוון מידות משקל מולקולרי נמוך מצביע על DNA השפלה.
    3. על transilluminator UV, שכב שקיפות על הג'ל, לסמן את המיקום של החריצים הלהקות מרקר עם עט מרקר (איור 5B). זה יקל קביעת גודל השברים hybridized מאוחר יותר, במקרה סמן רצפי לא hybridize במיוחד עם החללית ה-DNA. על ידי המציינת את השברים סמן בשלב זה, זה ניתן לאתר את הגודל של השברים hybridizing.
    4. מקם את הג'ל לתוך המגש, לשטוף עם מים יונים הנדסה גנטית, ולאחר לתוכה 0.25 M HCl למשך 15 דקות כדי fragmentize את ה-DNA בתוך הג'ל. לשטוף עם מים יונים הנדסה גנטית. השתמש HCl מספיק מים כדי לכסות את הג'ל במגש, וסובב את המגש עם הג'ל המשוקע ב 40 סל ד ב תפקודי לב / נשימה.
    5. דגירה הג'ל במאגר דנטורציה עבור 30 דקות לשטוף עם מים יונים הנדסה גנטית. השתמש מאגר מספיק מים כדי לכסות את הג'ל במגש, וסובב את המגש עם הג'ל המשוקע ב 40 סל ד ב תפקודי לב / נשימה. (דנטורציה מאגר: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
    6. דגירה הג'ל במאגר ניטרול במשך 30 דקות לשטוף עם מים יונים הנדסה גנטית. השתמש מאגר מספיק מים כדי לכסות את הג'ל במגש, לסובב את המגש עם ג'ל המשוקע ב 40 סל ד ב תפקודי לב / נשימה. (ניטרול מאגר: 0.5 M טריס, 1.5 M NaCl, 220 מ"מ HCl, pH 7.6).
  5. להעביר את ה-DNA קרום ניילון.
    1. הכינו את הכיוונון להעברה נימי של ה-DNA גנומי. מניחים צלחת פלסטיק (בערך בגודל של הג'ל או גדול יותר) על מגש מלא עם 20 x תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס). מקפלים פיסת נייר סינון עבה מעל המגש, כך שניהם מקצוותיו תלויות הממונים. חותכים חתיכה בגודל ג'ל של ניילון הטעון חיובית ממברנה N Hybond +, ו- 2 חתיכות נייר סינון עבה. (20 x האס: NaCl 3 מ', 0.3 M סודיום ציטרט).
    2. הכינו את ההתקנה blotting (איור 6) על ידי הנחת הג'ל, חריצי למטה על נייר הסינון בצלחת פלסטיק. מקום Hybond N+ קרום עליון, ואחריו 2 שכבות של נייר סינון. טרום רטוב כל שכבה ב 20 x SSC לפני הוספתן לאסיפה. הקפד להסיר את כל בועות האוויר בין שכבות כמו אלה לעכב את העברת הדנ א.
    3. מכסים את מכלול עם שכבה עבה של נייר טישו. מניחים צלחת פלסטיק עם משקל, כגון בקבוק קטן, על העליונה. ודא כי הלחץ מחולק באופן שווה על-פני הג'ל. פעולה זו תבטיח העברה נכונה של ה-DNA.
      הערה: המשקל צריך להיות בערך 200-300 גר'; משקולות כבדים ה"בלתי העברת הדנ א.
    4. לכסות את האזור שמסביב ההרכבה, כולל נייר סינון חשוף, עם תיאחז הסרט (איור 6) כדי למנוע אידוי של מאגר x SSC 20, המטרה שנימי כוחות לכיוון קרום ניילון. כתם בן לילה.
    5. לסמן את המיקום של חריצים, שם, ו/או של תאריך על גבי הקרום עם עיפרון, ולהסיר את הקרום מההרכבה. שימו לב כי הצד התחתון בא במגע עם הג'ל, נושא ה-DNA.
    6. מיד לתקן את ה-DNA למוח על ידי הקרנת UV (2,400 µJ/m2) באמצעות Crosslinker UV.
      הערה: תנאים Crosslinking תלויות בסוג של הממברנה משמש.
      הערה: בשלב זה הקרום ניתן להיות מאוחסנים ב-20 ° C, המשמש הכלאה עם מכשיר בדיקה מאוחר יותר. לשטוף את הקרום תפור 2 x האס ואני חותם על זה מראש מקופל צינורות פוליאתילן heat-sealable לפני הנחת ב-20 ° C.
  6. להכין את החללית של הכלאה.
    1. להגביר את רצף כדי לשמש את המכשיר עבור ה-DNA סופג PCR20. 50-100 ננוגרם של קטע ה-PCR kbp bp-2 250 משמש מכשיר בדיקה. שני רגשים נפרדים, אחד hybridizing אזור הגבול הנכון proximal והשני באזור proximal גבולו השמאלי ב- T-dna, יכול לשמש כדי להעריך את הנוכחות של כולו T-DNA (איור 4A ואיור 7).
    2. לדלל 50-100 ננוגרם של מוצר ה-PCR µL 24 של הנדסה גנטית יונים מים במבחנה.
    3. Denature את המוצר PCR מדולל על ידי הרתחה זה עבור 5 דקות בתוך בלוק מים או חום, ואז צנני ישירות על קרח.
    4. הפשרת premade GCT-מיקס על קרח. (GCT-מיקס: dGTP, dCTP, dTTP (כל 0.5 מ"מ), אקראי hexamers 43.2 ng/µL, Acetylated BSA 1.33 מ"ג/מ"ל, 33 מ מ של β-mercaptoethanol, Hepes 0.67 מ', מ מ 0.17 טריס pH 6.8, 17 מ"מ MgCl).
    5. הוסף µL 21 של GCT-לערבב 2 U של Klenow פרגמנט למוצר ה-PCR.
    6. להוסיף 2 µL של ATP [32P] לתערובת, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
      התראה: כל השלבים הכרוכים ATP [32P] צריך להתבצע בסביבה המיועד לעבודה רדיואקטיבי תוך שימוש ההגנה המתאים.
      הערה: ודא [32P] מ- ATP הוא טרי (לא יותר מ 1 בחצי משרה עבר).
    7. להכין G-50 ספדקס עמודה (גס או בינוני)21 לטיהור החללית עם תוויות של טריטוריה נוקלאוטידים (רדיואקטיבי). לקחת מזרק 2 mL, ו כיסוי לשקע עם מעגל קטן של נייר סינון עבה. להוסיף 2 מיליליטר ספדקס G-50 מומס טה לתוך המזרק, להסיר כל נוזל מן העמודה על-ידי ספינינג.
    8. למקם את העמודה לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל, לטעון את המכשיר עם תוויות בעמודה ו ספין בטמפרטורת החדר (להגדיר לצנטריפוגה ב g 750 x, לאפשר את סל ד להגדיל עד 750 גרם x, אז תפסיק לצנטריפוגה ולאפשר את הסיבוב לירידה של 0 x g) כדי elute החללית. µL 200 של טה להוסיף העמודה ואת spin כדי elute את המכשיר הנותרים; חזור על פעם אחת. בתנאים אלה, שברי דנ א שכותרתו אינם נכללים המטריקס ספדקס, elute, בעוד נוקלאוטידים חופשי להישאר בעמודה.
    9. השתמש µL 300 של המכשיר שכותרתו למחזור הכלאה. תמשיך הנותרים החללית שכותרתו ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר. עם זאת, זכור את המחצית של ATP [32P].
  7. Hybridize את האבן החשופה של ה-DNA.
    1. חום 2 x SSC, הכלאה מאגר (15 מ"ל למחזור הכלאה, מקסימום של 2 שהכלים למחזור) עד 65 ° C. (הכלאה מאגר: 10% לתוספי סולפט, 1% מרחביות, 1 M NaCl, 50 מ מ טריס pH 7.5, מתמוסס ב 65 ° C, תמשיך aliquots ב-20 ° C).
    2. מחממים מראש תנור הכלאה ל 65 ° C.
    3. מניחים רשת ניילון מגש עם קצת מחומם (65 ° C) 2 x SSC כדי לכסות את המגש. את המקום את האבן החשופה של הדנ א על גבי הרשת, עם הצד ה-DNA. לגלגל את האבן החשופה יחד עם רשת השינוי והכנס את הגליל לתוך צינור הכלאה. יוצקים את 2 עודף x SSC.
    4. צינור microcentrifuge, מרתיחים µL 150 ה-DNA של הזרע סלמון (ריכוז 10 מ"ג/מ"ל) למחזור הכלאה במשך 5 דקות (ראה גם שלב 4.6.3). מגניב מיד על קרח והוסף למאגר הכלאה מחומם מראש.
    5. להוסיף את הפתרון זרע של מאגר-סלמון הכלאה ברכבת התחתית עם האבן החשופה. טרום hybridize-65 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה על גלגל מסתובב, על סל ד 12.
    6. בעת הדגירה מראש בשלב 4.7.5. . זה כמעט גמור, הרתיחה 300 µL של המכשיר עם תוויות עבור 5 דקות (ראה גם שלב 4.6.3) ולהוסיף מיד האבן החשופה לאחר הדגירה.
    7. Hybridize בן לילה הגלגל מסתובב ב 63 ° C, סל ד 12. לא pipette את המכשיר ישירות על האבן החשופה, אלא אל הפתרון זרע של מאגר-סלמון הכלאה.
  8. לשטוף את האבן החשופה.
    1. מחממים את פתרונות כביסה (1 x הצהבת, מרחביות 0.1% ו- 0.1 x SSPE, 0.1% מרחביות) עד 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 מילימטר NaH2PO4, 20 מ מ EDTA, pH 7.0).
    2. תשליך את הפתרון הכלאה ולהוסיף כ 100 – 150 מ ל 1 x SSPE, 0.1% מרחביות לפתרון הצינורית הכלאה, לסגור את הצינור, וסובב בעבודת יד. יוצקים הכלאה ושטיפת פתרון פסולת רדיואקטיבית נוזלית המתאים.
    3. להוסיף בערך 100 – 150 מ ל 1 x SSPE, 0.1% מרחביות לפתרון הצינורית, סגור ולאחר דגירה הצינור למשך 15 דקות ב 63 ° C הגלגל מסתובב, סל ד 12. תבטל את הפתרון כביסה כראוי.
    4. להוסיף בערך 100 – 150 מ"ל של 0.1 x SSPE, 0.1% מרחביות לפתרון הצינורית הכלאה, סגור, וסובב את הצינור עבור 5 דקות ב 63 ° C, סל ד 12. תבטל את הפתרון כביסה כראוי.
    5. . קח את האבן החשופה יצאה מהשפופרת ולמקם אותו מגש ובו מספיק טרופה 0.1 x הצהבת, מרחביות 0.1% ו- shake למשך 3 דקות באמבט מים חזק ב- 65 מעלות צלזיוס. בינתיים, יש לשטוף את רשת השינוי מגש מלא במים.
    6. להוציא את האבן החשופה, למקם אותו בין פלסטיק מראש מקופל (צינורות פוליאתילן), בזהירות לנגב עודף נוזלים, והנח את כתם יבש בקצרה. שימו לב כי נוזל יהרוס את המסך phosphorimager.
    7. חותם את האבן החשופה בפלסטיק משלושה צדדים. להסיר את כל עודפי נוזלים המקיפים את האבן החשופה וסגור את צינור פלסטיק על ידי איטום הצד הרביעי. חתוך את העודף של פלסטיק. ודא שהאבן החשופה אטום לא דולף הפלסטיק הוא יבש מבחוץ.
  9. לחשוף את המסך phosphorimager.
    1. מקם את האבן החשופה אטום קלטת phosphorimager, עם המסך phosphorimager פונה לצד ה-DNA של האבן החשופה. לסגור את הקלטת ולהשאיר עבור ± 2 – 4 ימים, בהתאם לעוצמת תיוג רדיואקטיבי רגישות phosphorimager.
    2. סריקת המסך phosphorimager משתמש של phosphorimager. לטפל כדי לחשוף את המסך מעט ככל האפשר לאור לפני סריקה. לשמור את התמונה. למחוק את המסך מ אות על ידי לחשוף את זה באור בהיר.
  10. לנתח את האבן החשופה.
    1. הניתוח תלוי האסטרטגיה הגבלה בשימוש שלב 4.1. כאשר מנתחים את האבן החשופה המוכנים לפי האסטרטגיה המוצגים בשלב 4.1.1.1 (איור 4A), לספור את כמות הרסיסים זוהה. באסטרטגיה זו, מספר קטעים hybridized מתייחס למספר של שילובי T-DNA.
      1. השווה את המספר של השברים מזוהה עם מכשיר בדיקה עבור מימין (איור 7 ב) וכן את החלק הימני (איור 7C) ב- T-dna.
        הערה: אם מספר שונה של קטעים hybridizing זוהה, ואז גם i) T-DNA עותקים מרובים (גם בכיוון ההפוך, או ישירות), או שהיישום ii) משולב T-DNAs נוכחים.
      2. הערכת הגודל של קטעים hybridized על האבן החשופה בהתבסס על הגודל של הלהקות סמן, ולהשוות הגדלים של שברי hybridized לרסיס הצפוי גדלים מחושב בהתבסס על האסטרטגיה ההגבלה של טנדם הוספות (איור 4A) כדי זיהוי אפשרי טנדם סידור של T-DNAs. השתמש את דמות 4A כמדריך כדי לחשב את הגודל של קטעים הצפוי.
        הערה: אם הגודל של קטעים hybridized אינו מסכים עם אלה מחושבים, ואז לוודאי אחת של שילובי הנוכחי אינה שלמה.
    2. כאשר מנתחים את האבן החשופה המוכנים לפי אסטרטגיה המוצגים בשלב 4.1.1.2 (איור 4B), להעריך את הגודל של השבר hybridizing על האבן החשופה בהתבסס על גודל סמן להקות, ולהשוות אותם עם הגודל הצפוי. הכנסת טקסט שלמים מניבה קטע בודד באורך מוגדר. כל סטייה של אורך הצפוי מציינת שילוב לא שלם (איור 7D).
  11. רצועת האבן החשופה של הכלאה מחדש (אופציונלי).
    הערה: האבן החשופה אותו יכול שהוכלא ברצף עם הגששים שונים. לפני שתמשיך עם מכשיר בדיקה חדשה, רצועת בדיקה hybridized הקודם מ האבן החשופה.
    1. כדי להסיר את המכשיר האבן החשופה, מקם את האבן החשופה מגש עם ה-DNA-הצד שלו פונה כלפי מטה. יוצקים עודף של 0.5% מרחביות במגש. מרתיחים את הקרום למשך 2-5 דקות. משך הטיפול תלוי בגודל GC-תוכן של המכשיר בשימוש. הגששים יותר, עשירה יותר-GC זקוק לטיפול ארוך יותר.
    2. אחרי ששללו, hybridize את האבן החשופה עם רובוט נוסף, או לאטום ולאחסן ב-20 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מערכת BIBAC-ג'י, כתב בונה לימוד ODM בצמחים היו שנוצר10. המבנים היו בעיצוב שער כניסה וקטור pENTR-gm12 , מוכנס לתוך pBIBAC-בר-GW (איור 1) באמצעות התגובה רקומבינציה שער LR.

תודרנית נהפכו עם pDM19, BIBAC-בר-GW פלסמיד עם כתב mTurquoise-eYFP נושא של translational stop codon במסגרת הקריאה eYFP במיקום 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קריטי כדי לייצר transgenics עם שילובי יחיד, שלם של transgene הוא הבחירה של וקטור בינארי המשמש. וקטורים משפחה BIBAC שימשו להעביר רצפים של תחומי עניין רבים צמח מינים23,24,25,26,27,28. וקטורים BIBAC, BIBAC-ג'י, לרבות תשואות עותק יחיד שילובים עם יעילות גבוהה: המספר הממוצע של הוספות בכל שורה הוא 1.5-2, בהשוואה ל- 3 ומעלה עבור בינא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי ההולנדי בטכנולוגיית קרן STW (12385), אשר הוא חלק מהארגון הולנד על מחקר מדעי (בתחרות), אשר ממומן בחלקו על ידי משרד כלכלי פרשיות (OTP גרנט 12385 ל MS).  אנו מודים קרול מ המילטון (אוניברסיטת קורנל, ארה ב) על מתן pCH20, עמוד השדרה של הווקטורים BIBAC-GW.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
קנמיצין סולפט מונוהידראטDuchefaK0126
Gentamycin sulphateDuchefaG0124
RifampicinDuchefaR0146
Tetracycline hydrochlorideSigmaT-3383
DB3.1 תאים מוכשריםThermo Scientific - Invitrogen11782-018זריקה אחת ccdB הישרדות 2 תאים מוכשרים T1R (A10460) על ידי Invitrogen או כל זן אחר עמיד ל-ccdB E. coli ניתן להשתמש במקום   
תאים מוכשרים DH10BThermo Scientific - Invitrogen18290-015
תערובת אנזימים קלונאז Gateway LR Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
תלת-נתרן ציטראט דיהידרטMerck106432
בסיס טריזמהSigma-AldrichT1503
EDTA דיסודיום דיהידראטDuchefaE0511
Proteinase KThermo Scientific EO0491
Bacto טריפטוןBDתמצית
BD212750
נתרן כלוריHoneywell Fluka13423
אשלגן כלוריMerck104936
D(+)-גלוקוז מונוהידראטMerck108346
קוביות אלקטרופורציה, מרווח של 0.1 ס"מBiorad
Electroporator Gene PulserBioRad
מגנזיום סולפט הפטאהידרטCalbiochem442613
D(+)-מלטוז מונוהידראט 90%Acros Organics32991
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinate-ammonium (Basta)Bayer79391781
אנזימי הגבלהNEB
Ethidium BromideBio-Rad1610433
מערכת אלקטרופורזהBio-Rad
נתרן הידרוקסידMerck106498
חומצה הידרוכלוריתMerck100316
Blotting ממברנת ניילון Hybond N+Sigma Aldrich15358או GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr נייר ספיגהGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
אצטילציה BSAסיגמא-אולדריץ'B2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoethanolMerck805740
Sephadex G-50 גסGE Healthcare Life Sciences17004401או Sephadex G-50 בינוני (17004301)
דקסטרן סולפט מלח נתרןסיגמא-אולדריץ'D8906
נתרן דודציל סולפט ארה"ב ביולוגיS5010
זרע סלמון DNAסיגמא-אולדריץ'D7656
נתרן דימימן פוספט מונוהידראטMerck106346
Storage מסך זרחן וקלטתGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
מצלמת זרחןGE Healthcare Life Sciencesטייפון FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
(עטיפת סרן)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
חומצה בוריתMerck100165
סמן DNA ' בלאו'; סולם DNA.MRC הולנדMCT8070
סמן DNA ' רוד'; סולם DNAMRC הולנדMCT8080
תערובת הקסנוקלאוטידRoche11277081001
ערכת מבנה גדולQiagen12462
צינורות פוליאתילן הניתנים לאיטום בחום, ברוריםספקיםרוחב הצינור צריך להיות רחב יותר מזה של קרום סופגים
אוטם
מסנן קרום דיסקMerckVSWP02500
מגנזיום כלורידMerck105833
רשת היברידיזציהGE Healthcare Life SciencesRPN2519
שמרים 211705 1652089 סרט נצמד שונים חום

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33(2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208(2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644(2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BIBAC GW VectorGateway RecombinationTransgenic PlantsSingle copy InsertionsDNA BlottingAgrobacterium TransformationGlufosinate SelectionDsRed FluorescenceRestriction EnzymesT DNA Integrity

Related Articles