הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Summary

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

Abstract

עקב ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה, הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM) הופך במהירות שיטה סטנדרטית לניתוח המבני של חלבון מתחמי ברזולוציה אטומית. עם זאת, חלבון בידוד טכניקות ושיטות הכנה לדוגמה עבור EM נשארים צוואר בקבוק. מספר קטן יחסית (100,000 כמה מיליונים) של חלקיקים בודדים חלבון צריך לדימות לניתוח ברזולוציה גבוהה של חלבונים על ידי חלקיק הנע הגישה EM, ביצוע דגימת ולמחקר בטיפול טכניקות ועקרונות microfluidic ריאלי.

מיניאטורי, נייר סופג-ללא EM רשת הכנה שיטת מיזוג מראש לדוגמה, EM רשת לקרקע, לאחר העיבוד שצורכת רק nanoliter-כרכים של מדגם מוצג. השיטה משתמשת מערכת שחולק בדייקנות sub-nanoliter ספיגת נוזלים שליטה של EM רשת לקרקע, פלטפורמה לשלוט בטמפרטורה הרשת ובכך לקבוע את הלחות היחסית מעל הרשת EM, פיק--מים עמוקים-מנגנון למדגם ויטריפיקציה. הקפאה-EM, רשת EM מושם על הבמה מבוקרי טמפרטורה, המדגם הוא aspirated לתוך נים. הטיפ נימי ממוקם בסמיכות אל פני השטח רשת, הרשת היא עמוסה המדגם, עודף היא aspirated מחדש לתוך microcapillary. לאחר מכן, הסרט מדגם התייצב, מדולל במעט מים מבוקרת אידוי מוסדר על ידי ההיסט של הטמפרטורה פלטפורמה ביחס לנקודת הטל. בכל רגע נתון יופעל מנגנון פיק-ומים עמוקים, במהירות העברת הרשת EM להתקפת לתוך נוזלי אתאן עבור מדגם ויטריפיקציה. לחלופין, לדוגמה-מיזוג שיטות זמינות להכשיר אחסון מדגם בגודל nanoliter כתם שלילי (NS) EM.

למתודולוגיות מאוד לצמצם את צריכת מדגם ולהימנע גישות מזיקים חלבונים, כגון מסנן נייר סופג המשמש בשיטות המקובלות. יתר על כן, כמות הדגימה הדרושה זעיר מאפשר אסטרטגיות ניסיוני חדשניים, כגון מהיר דוגמת מיזוג, בשילוב עם פירוק תא בודד עבור "פרוטאומיקס חזותי", או המדגם "אובדן", לקראת ניתוח כמותי של דוגמאות מורכבות.

Introduction

חומרה, תוכנה לניתוח המבני של חלבון מתחמי מאת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מאסיבית כולל מתקדמת במהלך השנים האחרונות. השיפורים סלל את הדרך "מהפיכת הרזולוציה"^1,2 , נוגש המחקר המבני. המהפכה החלה עם כניסתו של הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM)^3,4, המאפשר ההכנה של דגימות ביולוגיות. תחת קרוב בתנאים פיזיולוגיים תוך הפחתת רגישות לקרינה ומניעת לדוגמה אידוי אבק גבוהה של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים⁵. בשנים הבאות, בהדרגה ההתקדמות הטכנולוגית מצטבר הרזולוציה השגה. בין חידושים אלה היו היישום של פליטת שדה רובים^6,7, ומשופר, לאחרונה, אלגוריתמים של ניתוח נתונים, כגון נראות מקסימלית שיטות^8,9. אלקטרון ישירה גלאי מצלמות^10,11,12,13, הסרט במצב הדמיה ומן הנלווה תוכנה התפתחויות^{14,15, 16 , 17}, סיפק את פריצת הדרך האחרונה הדרוש להשגת ברזולוציה אטומית עבור דגימות ביולוגיות על ידי חלקיק יחיד ןועברל (ראו סקירה צ'אנג, Grigorieff, et al. ¹⁸)-החשיבות של הקפאה-EM הוכרה לאחרונה על ידי בפרס הנובל לכימיה של החלוצים שלושה.

כדי דמות דגימה ביולוגית על ידי TEM, השיטה שבה נעשה שימוש כדי לטעון את הרשת EM עם דגימת (המכונה לאחר מכן "רשת הכנה") עליך לוודא כי השכבה מדגם וכתוצאה מכך (i) הוא מספיק דק (< 100 ננומטר) כדי למנוע רעש מקיף מאת ששינוי או להכפיל מפוזרים אלקטרונים, (ii) עומד על ואקום גבוה של מיקרוסקופ אלקטרונים, ומגן (iii) של מולקולות מפני נזקי קרינה. שתי שיטות עיקריות משמשות כדי למלא את perquisites האלה: כתם שלילי(NS)^19,20 הליכים (איור 1א') לספוח את הדגימה כדי סרט דק פחמן, להטביע את מולקולות במטאל אמורפי ולאחר מכן לאפשר את מכלול להתייבש באוויר. זו פשוטה ומהירה, הרשתות EM טעון (המכונה לאחר מכן "רשתות דוגמת") הם קל לאחסן, יכול להישמר לתקופה ממושכת של זמן (בדרך כלל שנים). TEM, ההכנות התערוכה חדות גבוהה עקב המחלקה ולא לסבול מינונים גבוהים יותר אלקטרונים מאשר הקפאה-הכנות, אבל הפתרון הוא מוגבל לשגרות Å. הקפאה-EM כ-20 מעסיקים (איור 1B) פחמן חור תומך. בשכבה דקיקה של הפתרון מדגם זה לפרוס על פני החורים ואת הרשת EM הוא צלל לתוך cryogen, אתאן בדרך כלל נוזלי, במהירות לצנן את זה מתחת-150 מעלות צלזיוס. התוצאה היא אמורפי, vitrified, 50 ל- 100 ננומטר בעובי הסרט של הפתרון החורים תמיכה. הסרט דק, אמורפי עומד על ואקום גבוה במיקרוסקופ אלקטרונים ושומר, במקרה האידיאלי, מבנים ביולוגיים במצבם המקורי. ההליך מאפשר דגימות ביולוגיות ליצירת תמונה ברזולוציה. עם זאת, הרשת מדגם חייב להישמר בטמפרטורות מתחת-150 º C בכל עת כדי להימנע devitrification. זה יכול השיקוף באמצעות מינונים גבוהים יחסית אלקטרונים בשל הטמפרטורה הנמוכה, אבל הניגוד, יחס אות לרעש אף על פי כן הוא נמוך. לכן, שיטות חישוב ממוצע רגיל הם מועסקים כדי להגדיל את החדות, בתנאי המדגם הוא עם תמונה מזוויות שונות, מפת תלת מימדי (3D) ברזולוציה גבוהה ניתן יורכבו. הנפוץ ביותר, שיטת מוצלח ביותר עבור שחזור תלת-ממד מעתה הגישה חלקיק יחיד. לסקירה האחרונה, ראה נג ב al.¹⁸.

כתם שלילי TEM (NS-EM) הוא חשוב עבור הקרנה, בקרת איכות, כאשר חדות גבוהה נדרשת או כאשר רק כמות מוגבלת של מדגם זמינים (ספיחה לסרט פחמן מתרכז בדרך כלל המדגם). חלקיק יחיד הקפאה-EM היא השיטה בתקן זהב אם שחזורים תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של חלבון מבנה נועדו עבור.

איור 1: השוואה בין קלאסי (לוח A, B) בגישה microfluidic (לוח C, D) והכנה של רשת עקרונות של TEM. A) קלאסית NS-EM רשת ההכנה: 3 על µL מדגם pipetted בעבודת יד על גבי רשת EM מכוסה סרט פחמן רציפה (המכונה לאחר מכן 'רשת NS-EM') (i). לאחר דגירה במשך כ 10 s, נייר סינון משמש כדי למחוק משם את הנוזל עודף מהצד (ii), עוזב את מולקולות הספוחה בסרט מים דק. לאחר מכן, החלבון מודגרת תמיסת מלח מתכות כבדות, למשל, אצטט uranyl 2%, עבור 20 s (iii), ושוב הנוזל יוסר על ידי סופג מן הצד באמצעות נייר סינון (iv). לבסוף, EM-הרשת נותר להתייבש באוויר. B) הקפאה קלאסית-EM רשת ההכנה: 3 על µL מדגם הן pipetted על ידי יד על גבי סרט פחמן חור. כדי ליצור סרט דק לדוגמה, הנוזל העודף יוסר על ידי נייר סופג הפנים-של אחד או שני הצדדים (ii). בסופו של דבר, הרשת הוא צלל במהירות לתוך נוזלי אתאן עבור ויטריפיקציה (iii). C) NS-EM רשת הכנה באמצעות הגדרת cryoWriter: כרך א' 5 nL הוא aspirated מן המלאי מדגם באמצעות של microcapillary (i). עבור מדגם מיזוג, הטיפ microcapillary הוא שקוע בתוך מיזוג תמיסת, למשל, 2% אמוניום אצטט. יונים ומולקולות קטנות מוחלפים על ידי דיפוזיה (ii). שימו לב כי הממדים של microcapillary להבטיח כי התהליך כולו הוא דיפוזיה מונע. חלבונים יש הרבה קבועים דיפוזיה נמוך יותר מאשר יונים מלח, לא באופן משמעותי אבודים²⁴. לבסוף, המדגם ויתרו על גבי הרשת, להתייבש (iii). D) עקרונות הכנת רשת הקפאה-EM בשיטה מבוססת-cryoWriter: EM רשת מכוסה סרט פחמן חור הוא להציב על פני השטח של פלטפורמה מבוקרי טמפרטורה, מוחזק על ידי פינצטה. הטמפרטורה של פלטפורמת נשלטת בהיסט מ הטמפרטורה נקודת הטל של סביבת רשת. הרשת מועברת באופן יחסי microcapillary המכיל את הדגימה, microcapillary היא יורדת עד כמה מיקרומטר מעל הרשת. כתוצאה מכך, כמה nanoliters מדגם הם ויתרו ממנו בזמן השלב מועבר בדפוס ספירלה; עודף נוזלים היא aspirated מחדש (i). לאחר רשת EM הטרמה, microcapillary נסוגה, ה-grid נשאר בפלטפורמה טמפרטורה מבוקרת (לאחר מכן כאל נקודת הטל (DP) שלב) לזמן קצר לאפשר כמות מבוקרת של הדגימה כדי להתאדות. עבור מים עמוקים קפוא, הרשת במהירות מסוגר החל משלב באמצעות את הפינצטה (ii), התהפך 90 ° לתוך המיקום האנכי, צלל לתוך אמבט cryogen (iii) (המכונה לאחר מכן מנגנון 'פיק-ומים עמוקים'). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

למרבה הצער, שיטות הכנה הרשת המשמשים NS הקפאה-EM לא השתפרו באופן משמעותי מאז המציאו. החסרונות הנוכחי הם הצריכה דגימה גבוהים (כ – 3 µL של חלבון 1 מ"ג/מ"ל) ואיבד הסכום גדול (> 99%) מדגם (איור 1A, B). יתר על כן, שיטת קלאסית המשמשת כדי להתכונן רשתות הקפאה-EM הוא הליך קשה חלבונים: ראשית, זה כרוך נרחב עם הפנים נייר סופג צעד (איור 1B, ii), שנית, החלבון נחשף לממשק מים אוויר עבור כמות משמעותית של זמן²¹. . הנה, שיטה חלופית עבור מדגם מראש מיזוג, הכנת רשת הדוגמא, עיבוד דפוס (רשת ייבוש או ויטריפיקציה) NS-EM (איור 1C) או הקפאה-EM (איור 1D) מוצג. הגדרת שנבנה ללא צורך במיקור חוץ, שנקרא "cryoWriter", משתמש ולמחקר הדגימה טיפול עקרונות וטכנולוגיה microfluidic מחוק לגמרי, מצב של לוותר על הדגימה, הימנעות נייר סופג לחלוטין ומספקת שיטות אלטרנטיביות למניעת הדוגמאות דק עבור הקפאה-EM. זה משמעותי מפחית את צריכת מדגם ומשפר את המשתמש-שליטה על הכנת הדוגמא בכללותה. יתר על כן, שיטת מאפשרת יישומים חדשניים ניסיוני; כגון הכנת מבודדים מרכיבים ביולוגיים של תאים בודדים בגישה נקרא "תא בודד פרוטאומיקס חזותי"^22,23,24,25.

Protocol

"CryoWriter" (איור 2; לפרטים נוספים ראו הקודם עבודה^24,26,27) או מכשור המקבילה נדרש עבור הפרוטוקולים הבאים. רשימה של ספקים עבור חלקים עיקריים ו מעבדתי ניתנת טבלה של חומרים.

1. שלילי הכנה רשת הכתם (NS)

1. הפעל את המכשיר ולאחר הפעלת התוכנה. אפשרות לאתחל כל המודולים הדרושים (מזרק משאבה בקר שלבים ממונעת, מצלמות מעקב, שלב נקודת הטל).
2. מגניב את התמיכה מדגם ואת השלב נקודת הטל. אם נדרש, ודא כי הטמפרטורה שלב נקודת הטל מוסדר 1-2 מעלות צלזיוס מעל נקודת הטל.
   הערה: הבמה הוא מקורר על ידי מכשיר Peltier מסחרי עם בקר PID.
3. הכן NS על ידי מילוי של 100 או 200 µL PCR צינור עם 100-150 µL של NS (למשל, tungstate 2% מתילאמין זמינים מסחרית). מניחים את הצינורית על מדגם מקורר התמיכה של המכשיר.
4. מקם את הדגימה.
   1. שים המדגם (0.5 - 1 מיקרומטר) לתוך צינור PCR µL 100 או 200. אם פחות מ- 50 µL מדגם זמין, לחתוך את החלק התחתון של צינור ה-PCR עם סכין גילוח ולהשתמש בו בתור מדגם טוב. פעולה זו תבטיח microcapillary ניתן להגיע בקלות את הדגימה.
      הערה: זה הקלה ביותר לרוקן דגימות 100 או 200 µL המבחנות, כי microcapillary להשתמש בו לאחר מכן לרוקן את הדגימה מטים מעט כיוון הנסיעה-גובה ציר z היא מוגבלת.
   2. במקום הצינור/המכולה PCR על התמיכה מדגם מקורר בכלי כדי למנוע התאיידות. לחלופין, ניתן aspirated דגימות של צלחות טוב בחממה מיקרוסקופ השלב העליון בטמפרטורת החדר; קירור אינה מיושמת עבור לוחות היטב.
5. הגדרת תפקידים. השתמש הג'ויסטיק cryoWriter השולטת xy ממונע-שלב של התוכנה לחצני בקרה ליניארית x-, y-, ו בשלבים ציר z כדי למקם את microcapillary. להשתמש במצלמה כדי לבדוק את המיקום של נימי.
   1. להעביר את microcapillary למאגר דגימה. לטבול את הטיפ לתוך הנוזל מדגם ולשמור על עמדה זו כמו "sample".
   2. להעביר את microcapillary אל הצינור NS PCR, לטבול את הטיפ בתוך תמיסת NS ולשמור על עמדה זו כמו "כתם".
   3. מקם את microcapillary בערך 100 מיקרומטר מעל המרכז של חריץ שבו הרשת EM ימוקמו ולשמור את עמדה זו כמו "grid_save".
6. האחות לדוגמה, במצב זה עבור NS-EM.
   1. אם לא מותקן, לטעון מזרק 10-µL (0.46 מ"מ קוטר פנימי) משאבת מזרק דיוק.
   2. מדביקים את קצה אחד של 30 ס מ ארוך fused סיליקה microcapillary (הקוטר החיצוני 360 מיקרומטר, הקוטר הפנימי 150 מיקרומטר) שקע מזרק.
   3. לחבר את microcapillary סוף microcapillary כדי קצר (5 ס מ) צמצום זמן אחרים דרך העיתונות מתאים מחבר. קצה ישרים microcapillary קצרה טפסים הטיפ שחולק.
   4. למלא את המזרק עם degassed מים מזוקק פעמיים (ddH₂O; נוזל מערכת) ולמנוע היווצרות בועות אוויר.
   5. לוותר על כמה עשרות nanoliters של נוזל מערכת ולהסיר כל טיפות microcapillary עם טישו נטולת מוך.
   6. לחץ פעמיים על מיקום הדגימה שנשמרה. זה עמדות microcapillary את המדגם היטב. בעוד נימי הוא נע, לוותר על 3 x 0.5 nL של נוזל מערכת לפני הטיפ microcapillary הוא שקוע לתוך הדגימה כדי למנוע בועת האוויר להיות. לכוד שם (ראה הערה 2 להלן).
   7. NL וביופסיה 5 מדגם.
   8. לחץ פעמיים על המיקום NS שנשמרו. Microcapillary הוא נסוג מן הדגימה ועבר המאגר NS באופן אוטומטי. בעוד נימי הוא נע, באופן ידני לוותר על 3 x 0.5 nL של דגימת נוזל בדיוק לפני הטיפ הוא שקוע לתוך המאגר כדי לוודא שאין אין אוויר בועות (ראה הערה 2 להלן).
      הערה: חשוב: (1) בעת מעבר בין השאיפה למצב שחולק או להיפך, יש הפסד קטן המוחי בוכנה בשל תנועת הנגד לגלגלי השיניים של המשאבה מזרק. לדברי היצרן, נמצא התגובה הנגדית של יחידה חדשה בין 7 ל 12 מיקרומטר. עבור שלנו מזרק עם קוטר הקנה של 0.46 מ מ, זה מתרגם ל nL 1-2. לכן, 1-2 nL יכול "ובשמפו", לפני הדגימה היא למעשה ויתרו. טיפונת קטנטנה מתחיל בדרך כלל לצאת את הטיפ microcapillary לאחר 0.5 השלישי nL לוותר על שלב. (2) בועת אוויר לכוד מעל/מתחת המדגם להפוך dispensing פחות מדויק וכדי למנוע מיזוג מדגם באמצעות דיפוזיה.
   9. להשאיר את microcapillary שקוע 3-12 דקות, בהתאם לדוגמה מאגר זרבובית גאומטריה.
      הערה: ריכוז גבוה יותר מלח ו/או פוספט במאגר, ככל הזמן הנדרש טבילה. NS (יחסית מהר) מפזרת לתוך התקע הדגימה תוך מאגר מלחי (יחסית מהר) וחלבון (הרבה יותר לאט) ' מאטום לשקוף ' החוצה. שילוב זה מפחית את ריכוז מלחים מאגר במדגם מונע מהם התגבשות כאשר הרשת טעון מתייבש. יתרה מזאת, פוספט נוטה ליצור את התמיסה בשילוב עם NS.
7. הכנת רשת, להפקיד נקודה של המדגם ממוזגים.
   1. בעוד המדגם להיות מותנה, קחי פיסה של סרט דביק ובלוק PDMS ולנקות עם החלק העליון של PDMS על-ידי החלת והסרה של סרט דביק על מנת להבטיח כי שם אין אבק. הכניסו את הבלוק PDMS צלחת פטרי.
      הערה: בלוקים חדשים PDMS נלקחים מן החדר נקי.
   2. בזהירות לאסוף רשת (למשל, Cu, 200 או 400 רשת מצופה עם סרט Parlodion/C). ודא לגעת רק הקצה של הרשת עם הפינצטה. מקום זה על הבלוק PDMS נקי עם הסרט פחמן כלפי מעלה.
   3. המקום הרחוב PDMS עם רשת יחידת זוהר-פריקה האוויר ואת זוהר הפרשות זה 20 s עם כוח 100 W-0.4 mbar. חנות הרשת בצלוחית סגור. עוד זוהר פריקה פעמים בדרך כלל להוביל מריחה גדול יותר של אמצעי האחסון מדגם הופקדו על הרשת. כתוצאה מכך, בשכבת הכתם הופך לדליל (הכתם חלש יותר).
   4. 1 דקות לפני השעה טבילה, לאחוז את הרשת משוחררים-זוהר עם הפינצטה cryoWriter. ודא שהאלקטרומגנט מופעלת; אחרת להפעיל אותו על התוכנה. לטעון את הפינצטה-האלקטרומגנט ולהשתמש הבורג micromanipulator ידנית כדי ליישר את הרשת שטוחה על הבמה נקודת הטל, פחמן לצד הסרט למעלה. ודא כי הטמפרטורה שלב נקודת הטל מוסדר 1-2 מעלות צלזיוס מעל נקודת הטל כדי להפחית את קצב אידוי לאחר מדגם זה טעון.
   5. כאשר נגמר הזמן טבילה, לחץ פעמיים על "grid_save". הטיפ microcapillary ימוקם בבטחה מעל פני השטח רשת. באופן ידני להביא את הטיפ microcapillary במגע עם הרשת. להרים את הזרבובית על ידי 10 מיקרומטר ומקם אותה מעל המרכז.
      התראה: דוגמאות המכילות דטרגנטים נוטים להתקדם לאורך המשטח החיצוני של microcapillary כאשר נוזלי הוא ויתרו בשל המתח המשטח התחתון. חשוב להיות מאוד קרוב לפני השטח רשת כדי למנוע אובדן כזה.
   6. לוותר על 5 nL מדגם על גבי הרשת. ביום יבש, כאשר התאדות מתרחשת בקצה microcapillary, פעם אחת יכול לוותר גם לאט עד המדגם הוא בקצה מאוד, ואז לדלג במהירות 5 nL.
   7. למשוך את microcapillary ולתת את הדגימה ממוזגים יבש לאט על הבמה נקודת הטל (DP-שלב).
   8. ברגע במקום מדגם התייבש, להסיר ברשת ואחסן אותו בטמפרטורת החדר בתיבת רשת או צלחת פטרי.
   9. לוותר על 500 nL של מערכת הנוזל. microcapillary להסיר אותו עם טישו נטולת מוך. לרוקן את נימי 5 פעמים עם אתנול, חומרי ניקוי או 1 M NaOH. זה מנקה את microcapillary ולאפשר לו לשמש עם דגימה שונה.

2. הקפאה רשת הכנה

1. כדי להכין את כלי הנגינה ואת דגימה, בצע שלבים 1.1 1.5 שתוארו לעיל. אם אס אינה נחוצה, להשמיט שלבים 1.3 ו- 1.5.2. כדי להחליף את המאגר מדגם או להתנות את הדגימה על הקפאה-EM על-ידי דיאליזה, למשל, כדי להפחית את ריכוז מאגר מלחי או להציג תוספים (למשל, טרהלוז, דטרגנטים) להשתמש המאגר הרצוי במקום NS בשלבים 1.3 ו- 1.5.2.
2. להכין אתאן נוזלי בתוך מיכל הקפאה סטנדרטי.
   1. להרכיב את גביע אתאן בעל תיבת הקפאה, עכביש, למלא את המיכל cryogen עד הקצה עם חנקן נוזלי; בדרך כלל דורש בערך 200 מ. המתן מספר דקות עד בגביע אתאן התקררות, ללא תשלום של חנקן נוזלי.
   2. פותחים את הבקבוק גז אתאן ולתת לאט את זרם הגז לתוך הכוס אתאן. תנו לו למלא עם אתאן נוזלי עד הרמה היא 2-3 מ מ מתחת לקצה העליון; זה לוקח כמה דקות ודורש בערך 5 מ של אתאן נוזלי.
   3. לקחת קופסת הקפאה ולמקם אותו חריץ בחינם בתוך המיכל cryogen.
   4. להסיר את העכביש, למקם את המכסה polystyrol למעלה, ומניחים את המיכל cryogen על ההרכבה ב cryoWriter.
3. פריקה זוהר ברשת של EM.
   1. קחי פיסה של דבק, רחוב polydimethylsiloxane (PDMS) ולנקות את הצד העליון PDMS על-ידי החלת והסרה של דבק (מסיר אבק). הכניסו את הבלוק PDMS צלחת פטרי.
   2. לבחור בקפידה רשת מתוך תיבת רשת. ודא לגעת רק הקצה של הרשת עם הפינצטה. מקום זה על בלוק PDMS נקי עם הסרט פחמן חור כלפי מעלה.
   3. המקום PDMS לחסום עם הרשת ב פלזמה פלזמה-clean ונקייה על פני רשת (למשל שימוש 75% Ar/25% H_2, כוח 50 W, הלחץ 25 mTorr). מקם את הבלוק PDMS עם רשת משוחררים-זוהר צלחת פטרי.
4. מיקום הרשת בכלי
   1. לתפוס את הרשת משוחררים-זוהר עם הפינצטה cryoWriter. ודא שהאלקטרומגנט מופעלת; אחרת להפעיל אותו על התוכנה. לטעון את הפינצטה-האלקטרומגנט ולהשתמש הבורג micromanipulator ידנית כדי ליישר את הרשת שטוחה על הבמה, לצד הסרט פחמן למעלה.
   2. לחץ פעמיים על "grid_save". להתאים את המיקום microcapillary כך הקצה הוא כ- 10 מיקרומטר מעל פני השטח רשת. ודא כי microcapillary יכול לנוע בחופשיות ברחבי הרשת מבלי לגעת בו בכל מקום, אם יש צורך למשוך microcapillary מיקרומטר כמה.
   3. לחזור למרכז הרשת ולשמור על המיקום החדש כמו "רשת".
      התראה: שמות הנכון הוא חובה עבור ה-script מאקרו לעבוד.
5. לכתוב רשת מים עמוקים-הקפאת ולדגום.
   1. לשטוף את microcapillary עם כמה עשרות nanoliters של נוזל מערכת ולהסיר כל טיפות microcapillary עם טישו נטולת מוך.
   2. הפעל מאקרו script. שהמאקרו יבצע את הפעולות הבאות:
      1. לוותר על 5 nL (כדי להסיר את כל הבועות אוויר בקצה) וללכת מיקום הדגימה.
      2. NL וביופסיה 65 מדגם. להשרות 5 nL בחזרה לתוך הצינור הדגימה. תנועת הנגד הזאת חשבונות עבור מערכת ולאפשר כתיבה מסונכרן, כלומר., כדי להבטיח את dispensing שלב התחלת התנועה באותו זמן.
      3. הזז למיקום "רשת".
      4. ליזום 'כתיבה דוגמת מילוי', אשר יגרום את microcapillary לעבור על פני הרשת, בו זמנית dispensing 45 nL מדגם.
      5. לאחר מכן, העבר את microcapillary חזרה למרכז של הרשת, להוריד אותו עוד 10 מיקרומטר, ולסגת לדוגמה עודף נוזלים.
      6. למשוך את microcapillary וכבה את האלקטרומגנט. זה משחרר את הצעד פינצטה, יוזם קפוא.
6. לאחוז את הפינצטה ולשחרר בקפידה את המתאם מגנטי של הבוכנה. במהירות העבר הרשת בגביע אתאן לתוך המיכל cryogen המכיל תיבת הקפאה ולמקם את הרשת בחריץ חינם.

3. החד-תאיים הכנה Lysate

1. להכין את microcapillaries אלקטרופורציה.
   הערה: microcapillaries מחודדות סיליקה (משך-לייזר, שנבדק) fused יש ציפוי פוליאימיד מגן מבחוץ, מלבד הטיפ, איפה הציפוי הוא נשרפו במהלך תהליך דקיקות.
   1. כדי להרגיע את microcapillaries עם שכבת מוליך, את הר אותם בזווית של 45 מעלות על מסילה מתכת, עם הטיפים מכוון כלפי מעלה. השתמש רדיד אלומיניום כדי לחסום. את הקצה התחתון (2 ס מ) טיפים, פוליאימיד ללא ציפוי צורות האיטום הטוב ביותר עם המחברים הקש להתאמה המועסקים מאוחר יותר.
   2. לרעוד. להוציא להפקיד שכבה דביקה של 20 ננומטר Ti/W ולאחר מכן 200 ננומטר בעובי שכבה של Pt.
2. להפוך את הטיפ microcapillary הידרופובי.
   1. להכין פתרון 1 מ' של 1-dodecanethiol ב EtOH.
   2. זוהר-פריקה microcapillary באוויר במשך 1 דקה עם כוח 100 W-0.4 mbar.
   3. לטבול את קצה microcapillary בפתרון 1 מ' 1-dodecanethiol לכמה שעות (אידיאלי ללילה).
      הערה: מומלץ להכין טיפים טריים יום אחד לפני השימוש.
3. התקן של microcapillary החדש.
   1. הסר את microcapillary של הפתרון 1-dodecanethiol, לשטוף בחוץ עם אתנול, לשטוף מבפנים עם אתנול באמצעות מזרק.
      הערה: אם אין microcapillaries functionalized זמינים, במהירות זוהר לשחרר את קצה microcapillary וטובל בטיפה של טיפול חלון רכב מסחרי, הכולל עירוב של PDMS, חומצה גופרתית. Functionalization הידרופוביות וכתוצאה מכך הוא לא טוב כמו עם 1-dodecanethiol, אבל בדרך כלל מספיקות.
   2. קליב את סופו ללא ציפוי עם חותך קפילר.
      הערה: חתך נקי חשוב סגירה עם מחבר הקש להתאמה.
   3. השתמש קיסם כדי להחיל הדבק כסף הגבול חד שנוצר בין זכוכית הציפוי פוליאימיד כאשר הציפוי פוליאימיד היה נשרפו על ידי הלייזר במהלך משיכת נימי.
      הערה: חיזוק זה הכרחי כמו הציפוי Pt חלש מאוד באזור זה, וההולכה ניתן בקלות לפרק.
   4. רחץ פוליאימיד סוף microcapillary עם אצטון. להשאיר טיפה קטנה של אצטון בסוף והוספתו לתוך כגדולים של המחבר הקש להתאמה. הפעילו לחץ קל להקים סגירה.
4. כיילו את המיקום microcapillary.
   1. להפעיל את המכשיר ולהתחיל את התוכנה כפי שמתואר בשלב 1.1. בנוסף, אפשרות לאתחל את המצלמה מיקרוסקופ, את מחולל.
   2. במקום זכוכית מיקרוסקופ שקופית לתוך מחזיק שקופיות על המיקרוסקופ.
   3. הנמך את microcapillary ליד השקופית זכוכית, מרכז זה מעל המטרה מיקרוסקופ עד שיופיע בתצוגת מצלמת מיקרוסקופ. השתמש בשלבים ליניאריים ציר x ו- y כדי למקם את קצה microcapillary במרכז התמונה. אז הורידו לאט את הטיפ עד מעט שייגע השקופית זכוכית.
      התראה: לבחור צעדים קטנים מאוד (5 מיקרומטר) לקראת סוף המסלול. אחרת, הטיפ יכול להינזק.
   4. לחץ על לחצן "לכייל זרבובית". זה המופרע של microcapillary 40 מ מ, וערכות זה הצב בתור דף הבית עמדה.
5. הכנת מבויילת PDMS חתיכות, איטו שקופיות
   1. מיקס PDMS ו- crosslinker ב- 10:1 יחס, שופכים לתוך צלחת פטרי גדולה עד לעומק של 2-3 מ מ. אופים ב 60 מעלות צלזיוס לכמה שעות הכלאה חממה או התקן דומה.
   2. עם פטיש, חותמת (12 מ"מ קוטר), חותכים חורים בשכבת PDMS. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לגזור 2 ס מ ארוך לריבועים או מלבנים כולל את החורים להשיג חתיכות מבויילת שמתאימים בשקופית מיקרוסקופ. בדרך כלל, שתי חתיכות מבויילת הם רכוב על שקופיות מיקרוסקופ אחד.
   3. לשטוף את החלקים PDMS השקופיות איטו קודם עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול. למקם אותם, רטוב, פטרי ולתת האתנול להתאדות לחלוטין בתוך תנור ב 60 מעלות צלזיוס.
   4. קריטון שקופיות עבור 1 דקות עם 100 W זוהר-פריקה חשמל ב- 0.4 mbar ולאחר מכן החל 1 מ"ל של ציפוי פתרון (למשל, פולי-L-ליזין (PLL)). תקופת דגירה של 5 דקות, להסיר את הפתרון עם פיפטה ולהחיל 1 מ"ל של ddH₂O. מעט להתסיס עבור 1 דקות ולאחר מכן הסר את ddH₂O בעזרת פיפטה של. . תן את השקופיות יבש ב 60 מעלות צלזיוס.
6. הכינו את התרבות תאים. עקוב אחר תאים חסיד culturing נוהל מקובל (למשל, ארנולד, et al. ^{24 , 25}). זרע תאים על איטו במהלך ריצות פיצול/passaging רגילה.
   1. קח שקופית טרי מצופה PLL איטו, להוסיף פריט PDMS. ללחוץ כדי ליצור את הבתולין. זה מייצר וולס קטן כאשר השקופית כבסיס שלהם.
   2. להוסיף כ- 300 µL של תאים מושעה בינוני טריים לבארות PDMS. צפיפות זריעה צריך להיות בסביבות 75,000 תאים לכל טוב.
   3. תקופת דגירה של השקופיות איטו של 1-2 ימים בתנאים רגילים.
7. היכונו לניסוי פירוק התא:
   1. לחמם כמה מיליליטר של המאגר אלקטרופורציה (למשל, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)).
   2. להתכונן הגדרת NS-EM רשת הכנה
      הערה: פרטי עבור הכנת את הסידור מוצגים שלבי 1.1-1.5 (NS) או צעד 2.1 2.4 (הקפאה). כאן נתאר את השלבים החשובים ביותר להכנה-NS.
      1. הכן NS על ידי מילוי של 100 או 200 µL PCR צינור עם 100-150 µL של NS (למשל, tungstate 2% מתילאמין זמינים מסחרית). מניחים את הצינורית על מדגם מקורר התמיכה של המכשיר.
      2. להעביר את microcapillary אל הצינור NS PCR, לטבול את הטיפ בתוך תמיסת NS ולשמור על עמדה זו כמו "כתם".
   3. לטעון את הפרמטרים פירוק סטנדרטי, למשל, המתח פירוק.
   4. קח את השקופית איטו מן החממה, לעלות אותו על הוספה מיקרוסקופ. להשתמש את שני הברגים כדי לתקן את השקופית על תותב אלומיניום וכדי להבטיח קשר חשמלי בין קריטון ציפוי של השקופית, מסגרת אלומיניום חשמלית מקורקע.
   5. להסיר את המדיום התרבות תאים, לשטוף פעמיים עם µL 300 אלקטרופורציה המאגר. שמור את התאים אלקטרופורציה מאגר.
   6. המקום האלומיניום הכנס מחזיק את השקופית איטו בשלב החממה לחיות תאים על הכיוונון.
   7. אתר התרבות התא בתצוגה מיקרוסקופ ובחרו שטח עם אין תאים. גש בקצה השטח איטו בעדינות לגעת בו, ואז למשוך את טיפ 100 מיקרומטר, להציל את המיקום כמו "תאים".
   8. במהירות לעזוב את התרבות תאים, לשטוף את הטיפ microcapillary עם כמה עשרות nanoliters של נוזל מערכת ואז הכנסתו למצב התרבות התא שוב. לוותר על כמה nanoliters במהלך טבילה לתוך הבאר PDMS להבטיח כי אין אוויר בועות לכוד בקצה.
   9. בעדינות הגישה השטח איטו (בתחילה, אתה חייב להיות במיקום "תאים", כלומר., 100 מיקרומטר מעל פני השטח). לאחר יצירת קשר, משכי עצה 10 מיקרומטר.
   10. בחר בתא הסמוך על פירוק. מניחים את קצה microcapillary שמעל לתא יישוב.
8. הפעל מאקרו התסריט של פירוק תא בודד.
   1. יש להעביר את שם המיקום microcapillary לאחר תא יש כבר בהצלחה lysed. זה יהיה מאגר NS (NS-EM), מאגר desalting (הקפאה-EM) או אם הרשת (הקפאה-EM). להימנע משגיאות איות ולחץ על "אישור".
   2. המאקרו ממשיך ללא התערבות המשתמש:
      1. i) מיקרומטר תרבות 100 מיקרוסקופ הבמה ותא מועברים משמאל, תמונת של התא יישוב היא לקח, ועוד 50 nL של ddH₂O מערכת נוזל הם ויתרו מ microcapillary. זה משוגע, נכון, מדלל את המאגר מלח גבוהה ומחיל לחץ אוסמוטי אל התא.
      2. ii שלב) מועברת חזרה כדי למקם את הטיפ שמעל לתא יישוב שוב. פרץ מתח מראש מוחל, ומתחיל לאחר 500 ms מערכת משאבת לרוקן 3 nL מדגם בספיקה של µL 2/min.
      3. iii שלב) הוא זז שמאלה שוב, המאפשר את התא שייבדקו. מופיע חלון, ושאלת לקלט מהמשתמש.
   3. אומרים אם הצעד פירוק הצליח או לא.
      1. אם התשובה היא לא, להשתלט, לרוקן את microcapillary, המטרה תא חדש.
      2. אם התשובה היא כן, תמונה של התא (lysed) שהוסר נלקח, לאחר מכן microcapillary מועבר למיקום שצוין ב- 3.8.1. אם זה NS או המאגר מאגר, להשתמש בממשק משתמש רגיל כדי לוותר על 3 x 0.5 nL של נוזל תוך microcapillary עוברת להבטיח כי שם אין בועות אוויר. הטיפ הוא שקוע בתוך הנוזל מאגר על-ידי המאקרו.
         הערה: אפשר להמשיך במצב המדגם ולהכין רשתות, כפי שמוסבר בסעיפים 1.6.9 - 1.7.9 NS-EM או בסעיף 2.2-2.6 הקפאה-EM. להלן, הסביר את הצעדים הדרושים להכנת NS-grid.
   4. להשאיר את microcapillary שקוע במשך 8-12 דקות, תלוי הגיאומטריה של זרבובית
      הערה: ריכוז גבוה פוספט במאגר דורשת זמן רב יותר טבילה עבור מיזוג.
   5. לוותר על 5 nL של התא ממוזגים lysate על גבי הרשת.
   6. למשוך את microcapillary, תן הדגימה ממוזגים יבש לאט על הבמה נקודת הטל (DP-שלב) מוסדר 1-2 מעלות צלזיוס מעל הטמפרטורה נקודת הטל.
   7. הסר את הרשת ואחסן אותו בטמפרטורת החדר בתיבת רשת או צלחת פטרי.

Results

הגדרת "cryoWriter" פותחה (מתוארים באיור2) על מנת לבחון את ההליכים ולמחקר של הכנה רשת אמ הציע איור 1C, D. איור 2 A מציג סקירה של הרכיבים השונים שמגרד במיקרוסקופ פלורסצנטיות ההופכי. מודול culturing התא מותקן על הצד השמאלי של המיקרוסקופ; מודול עבור הכנת רשת EM ממוקם בצד הימין. המודול culturing תא (איור 2B) מאפשר את הצמיחה של התאים האיקריוטים חסיד הדמיה לחיות תאים של התרבות תאים על ידי מיקרוסקופ אור. תאים בודדים הם lysed על-ידי הפעולה המשולבת של שוק אוסמוטי, אלקטרופורציה שאיפה של תוכן התא לתוך^24,microcapillary (איור 2B, איור 6א)²⁵. הדוגמה lysate aspirated יכול לשמש לאחר מכן להכין רשתות עבור NS - או הקפאה-EM. לחלופין, פתרון חלבון מניות בשפופרת PCR יכול להיות מקור הדגימה. Microcapillary (איור 2B) מועסק קשורה מערכת משאבת דיוק גבוהה המאפשר אחסון מדגם aspirated, ויצרנו sub-nL דיוק. כמפורט הפרוטוקולים, כל עיבוד הדגימה מבוצעת בתוך microcapillary הזה או על הרשת EM עצמה ללא תחבורה דגימה משמעותי. לדוגמה, microcapillary אותו משמש lyse התאים האיקריוטים בודדים, וארוקן את lysate, במצב זה, בסופו של דבר לוותר על aliquots על גבי רשתות EM. המודול הכנה רשת מורכב מטלטלין DP-שלב זה מאפשר את הטמפרטורה של רשת אמ מונחת שזה יהיה בדיוק מבוקר (איור 2C). עבור NS-TEM, הרשת מדגם מוכן יכול פשוט להיות הוסר מן הבמה קר ואז להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר. עם זאת, ההשפעות קפה-טבעת כביכול שיכול לגרום ואז צריך להימנע עבור TEM כמותי שבו נספרות חלבון "חלקיקים". כדי לעשות זאת, רשתות עוברות ייבוש לאט על הבמה-DP באמצעות הדרגתי טמפרטורת הגוברת בהדרגה כדי להאט אידוי נוזלים. עבור הקפאה-EM, הטמפרטורה של הרשת נשמרת בקרבת נקודת הטל; נבחר של היסט חיובי של 8 ° C, המאפשר אידוי מבוקר של דגימת נוזל מייצב סרט דק, דליל, אשר יהיה פיקוח על ידי החיישן במידת הצורך²⁶. לאחר שנבחר הפעם דליל, מופעל מנגנון פיק-ומים עמוקים, לדוגמה הוא vitrified (איור 2C). שימו לב כי מנגנון הטבעה. זה אינה דרושה עבור רשתות NS-EM, אשר מאוחסנים בטמפרטורת החדר.

איור 2: סקירה של ההתקנה cryoWriter. A) סקירה של ההתקנה cryoWriter רכוב על הפוך אור-מיקרוסקופ (1). B) שיבוץ של אזור מסומן בצד שמאל בלוח א תא culturing תא (2), microcapillary (3) עבור מדגם מניפולציה ותא פירוק ממוקמת מעל צלחת תרבות ולמחקר תא מבוסס PDMS (4). C) שיבוץ של אזור המצוין בצד ימין במנגנון לוח א 'פיק-ומים עמוקים". רשת EM הסרט חור פחמן (5) רכוב בין קצות פינצטה (6), מוצבים באופן אופקי במגע ישיר עם השלב מבוקרי טמפרטורה (7), כאל השלב נקודת הטל (DP-שלב) לטקסט הראשי. הטמפרטורה הבמה מפוקחת באמצעות בקר PID לבין רכיב Peltier water-cooled, שמירתה או קרוב הטמפרטורה נקודת הטל, בהתאם לסביבת אמביינט. DP-הבמה (7) נטענה על ציר xy ממונע כדי להזיז את הרשת ביחס microcapillary. Microcapillary עצמו הוא רכוב על z-במה, יכול להיות הנמיך עד שזה מאוד קרוב לפני השטח של רשת אמ, נהגה לוותר על אמצעי אחסון בגודל של nanoliter על התמיכה דגימת מכסה את זה (רציף פחמן דק שכבה NS-EM או סרט פחמן חור עבור cr יו-EM). שימו לב כי ספיגת נוזלים, מחלק מתבצע באמצעות מערכת משאבת דיוק גבוהה (8). הנוזל dispensed יכול להיות מופץ על ידי הזזת את הרשת ביחס microcapillary בדפוס ספירלה. להכנה הקפאה-EM, מנגנון הקפאה פיק-ומים עמוקים (9) מעביר במהירות לרשת טעונים דוגמת לתוך נוזל אתאן (10) עבור מדגם ויטריפיקציה וקירור מהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 מראה תוצאות נציג השיג עבור רשתות NS-EM שהוכנו באמצעות הגדרת cryoWriter. קצה microcapillary היה טעון עם 5 nL דוגמה פתרון מניות ו טבל לתוך מאגר של פתרון NS (2% מתילאמין tungstate) למשך מספר דקות כדי לאפשר חילופי המפזרת NS ו יונים מלח (לדיון תיאורטי ראו ארנולד, et al. ²⁴). לאחר מכן, המדגם ממוזגים ויתרו על גבי הסרט פחמן דק של רשת NS-EM ומייבשים. איור 3 א מציג את השימוש ברשת חריץ באותה דרך להמחיש את ה-droplet מלאה, כנדרש עבור TEM כמותית. כדי למנוע את האפקט טבעת קפה, הרשת משוחררים טריים זוהר היה בתחילה שנערך בטמפרטורה נקודת הטל (אין אידוי מים), ואז לאט לאט להתחמם על הבמה-DP. שימו לב, כי עבור מרבית היישומים (למשל, בקרת איכות של הדגימה או ניתוח מבנה) תהליך ייבוש איטי זה לא נחוצה. באיכות גבוהה NS-ההכנות מתקבלים בלי זה, כפי שמוצג באיור 3B, C. מיזוג פעמים למאגרי מלח נמוכה ללא פוספט הם בסביבות 3 דק ', למשל, עם מלח נמוכה טריס-buffer (pH 20 מ מ טריס-HCl 7.4 עם 50 מ"מ NaCl), כפי שמוצג באיור 3B באמצעות נגיף פסיפס הטבק (TMV) כדוגמה. איור 3 ג מציג את התרחיש הגרוע ביותר כמו TMV היה במאגר PBS (2.7 מ"מ אשלגן כלורי,₂PO 1.5 מ מ ח'₄, 136.9 מ מ NaCl, 8.9 מ מ נה₂HPO₄·7H2O, pH 7.4). פוספט יונים בצורת גבישים ארעית עם היונים מטאל של NS (ראה איור 5C), הארכת הזמן מיזוג הנדרש (7 דקות). אחרים מלחי מתכות כבדות יכול לשמש גם עם מודול הכנת רשת, למשל, molybdate vanadate או אמוניום מתילאמין 2% (ראה גם ארנולד, et al. ²⁴). עם זאת, אצטט uranyl אינה מתאימה; השפעת crosslinking הכתם הזה מוביל אגרגטים אם המדגם חלבון מותנה בפתרון, לפני ספיחה לפחמן הסרט (ראה איור 5E)²³.

איור 3: תוצאות טיפוסיות לרשתות NS שהוכנו באמצעות הגדרת cryoWriter כמצוין איור 1C. A) סקירה על התמונה של droplet nL 3 ויתרו על רשת חריץ לאחר מיזוג עם 2% מתילאמין tungstate. B) TMV במאגר טריס 20 מ מ. שיבוץ מראה של 3 x הגדלה של האזור המסומן. מ ארנולד, et al.²⁴ (הרשאות נוספות הקשורות לחומר ראו צריך להיות מופנה כלפי ACS). C) נגיף פסיפס הטבק (TMV) במאגר PBS. שיבוץ מראה של 3 x הגדלה של האזור המסומן. מ ארנולד, et al.²⁴ (הרשאות נוספות הקשורות לחומר ראו צריך להיות מופנה כלפי ACS). גודל ברים: A, 100 מיקרומטר; B, 50 ננומטר; C, 80 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טיפוסי התוצאות המתקבלות עבור רשתות הקפאה-EM שהוכנו באמצעות הגדרת cryoWriter מתוארים באיור4. לוח 4A מראה של רשת אטלס של האזור מכוסה על ידי מדגם vitrified. 4B החלונית מציגה אחידות הקרח בזגוגית חריץ הרשת הנבחר. בשני המקרים, המדגם היה 25 מ מ HEPES-KOH pH 7.5, 50 מ מ NaCl מאגר המכיל 0.05% 14 פוס דטרגנט. מאגרי ודוגמאות רבות נבדקו, קרח בזגוגית באיכות גבוהה דומה היה מתקבל, אבל התנאים הנדרשים הם מאגר התלויים (ראה גם הדיון איור 5). לוח 4C מראה apoferritin חלקיקים של bacteriophage במאגר טריס-HCl (20 מ מ טריס-HCl, 50 מ מ NaCl; pH 7.4) עם תמונה-defocus בשכבות גבוהות כדי להגדיל את החדות. החלונית ' 4D מציגה חלבון ממברנה 200 kDa מיוצב על ידי amphipoles.

איור 4: תוצאות טיפוסיות לרשתות הקפאה-EM שהוכנו באמצעות הגדרת cryoWriter כמצוין ב- איור 1ד. הדגימות ואת המאגרים להשתנות הדוגמאות המוצגות. כל הדגימות היו טעון על הבנת פחמן סרטים. A) קולאז של תמונות סקירה ("רשת אטלס") של מדגם המכיל חלבון ממברנה 150 kDa, הפריפריה של הקרח בזגוגית מזוהה באמצעות החצים הלבנים. B) מוגדל חריץ רשת של רשת המוכנים המאגר אותו, מציג הסרט פחמן חור בקרח בזגוגית. כמה בורות מלאים דוגמת המאגר לא כפי שצוין על ידי החצים הלבנים. C) פחמן חור עם דגימת vitrified המכיל apoferritin חלבון מתחמי bacteriophages. שיבוץ: הגדלת כפולה מציג את הזנב של bacteriophage. הכוכבית לבן מציין הסרט פחמן. שימו לב כי התמונה הוקלט עם defocus בשכבות גבוהות כדי להגדיל את החדות. D) A 200 kDa חלבון ממברנלי מחדש amphipols. שיבוץ: 2 x הגדלה של האזור המסומן מוצג עם ניגודיות מוגברת. גודל ברים: A, 100 מיקרומטר; B, 10 מיקרומטר; C ו- D, 80 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגדרת cryoWriter מאפשר שיטתית הקרנת תנאים אופטימליים EM-grid הכנה; לדוגמה מוצג באיור 5א (apoferritin ב- 25 מ מ HEPES-KOH pH 7.5, 50 מ מ NaCl, 0.05% פוס 14). בניסוי זה, הקרח בזגוגית "דילול" טמפרטורה היו מגוונים, אבל הפעם דליל (קרי, של פער הזמן בין יישום דגימת מים עמוקים הקפאה) נשאר קבוע (1 s). בטמפרטורות נמוכות היסט (למשל, 8 K), השכבה המדגם היה עבה מדי. בטמפרטורות גבוהות יותר היסט, הקרח בזגוגית החורים היה רזה (10 K, 12 K), עד בשלב מסוים (מעל 18 קראט) הרשת הפך לגמרי יבש (לא ראה). בתוצאות המובאים כאן, היסט של 12 K להוביל הנקברים הומוגנית של קרח בזגוגית כפי שמציין החץ השחור. בניסויים כאלה עושים אופטימיזציה יכול להתבצע עם המאגר של המדגם היעד באמצעות "מבחן" חלבונים (כגון apoferritin). התנאים הטובים ביותר נמצאו יוחלו על המדגם היעד. יתר על כן, רשתות עם פרמטרים רחוק מלהיות אופטימלי ניתן לזהות לעתים קרובות במהלך ההליך הכנה, לא צריך להיות מוקרן במיקרוסקופ אלקטרונים, חיסכון משמעותי בזמן. איור 5 מציג גם גלריה של הקפאה טיפוסי-EM (לוח ב') וממצאים NS-EM (לוחות C ל- E) ספיציפית הגדרת cryoWriter. הרשת הקפאה-EM המוצגים בלוח 5B עם TMV ב- PBS המכיל 0.1% decyl-β-D-maltopyranoside (2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 1.5 מ מ ח'₂PO₄מ מ 136.9 NaCl, מ מ 8.9 נה₂HPO₄·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM) הייתה מוגזמת מדולל. הרקע של התמונה הוא מטושטש כי ריכוזי המלח נעשה גבוה מדי. באופן כללי, לא נראה המראה החזותי של מדגם להיות פונקציה ליניארית של ריכוז מלח; גרגרים לפתע הופך בולט כאשר ריכוז סף מתמלאת במהלך תהליך דליל. שימו לב כי ניתן להסיר חומרים לא רצויים על-ידי צעד מיזוג לפני הכנת רשת, כפי שמתואר עבור NS-EM פרוטוקול סעיף 1.6. NS יכול לגרום חפצים אחרים. בדוגמה המוצגת בלוח 5C, מאגר PBS (2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 1.5 מ מ ח'₂PO₄, מ מ 136.9 NaCl, 8.9 מ מ נה₂HPO₄·7H2O, pH 7.4) ללא דגימה היה מותנה ב- 2% מתילאמין tungstate עבור פוחת משקעים מינימלית 3, גבישים הם ניכר ולעשות מאמץ נרחב כוחות על פני השטח פחמן שמוביל סדקים. הצורה היחידה פוחת משקעים ב ריכוז מסוים PBS ו NS טווח ולא ניתן להימנע על ידי מיזוג המדגם להשוואה יותר ( איור 3ג'). לוח 5D מראה הפריפריה של droplet מדגם NS dispensed מפגין טבעת"קפה". זה כן ניתוח כמותי, הכולל דוגמה, ניתן להימנע על ידי מאט את תהליך הייבוש, קרי, על-ידי שמירה על הרשת EM בטמפרטורה נקודת הטל במהלך היישום מדגם ולאחר מכן והגדילו בהדרגה את הטמפרטורה כדי לייבש אותו ( ראה איור 3א). לוח 5E (apoferritin 20 מ מ HEPES, pH 7.0, ממוזגים 3 דקות) מציג את הפעילות crosslinking של הכתם אצטט uranyl 2%, אשר לא יכול לשמש דגימות חלבון תנאי לפני שהם נמצאים הספוחה כדי פחמן סרט תומך.

איור 5: שינויים שיטתיים וחפצים נצפו כאשר שימש את קביעת cryoWriter להכין רשתות עבור NS - ו הקפאה-EM. A) קרח בזגוגית שיטתית עובי וריאציה; אופטימיזציה של הרשת לקראת הקפאה-EM. הטמפרטורה ההיסט של DP-הבמה היתה מגוונת (8 K עד 12 K) לשמור את קבוע הזמן דליל (1 s). החצים מצביעים על הפריפריה של השכבה הדגימה. B) מלח תופעות; כלומר, הצעד דליל מדי המרוכזת, היה ארוך מדי שיבוץ מתארת 2 x הגדלה של האזור המסומן. C) מלח פוחת משקעים שהוקמה על ידי PBS מאגר בנוכחות מלחי מתכות כבדות. דוגמאות המכיל מאגר PBS חייב להיות מותנה יותר דגימות במאגרי אחרים. כאן, PBS מאגר ללא דגימה היה ממוזג ב 2% tungstate מתילאמין למשך 3 דקות, זמן אופייני למאגרי מדגם אחר. הערה הסדק בסרט פחמן ככל הנראה בשל כוחות חזקה מן פוחת משקעים מתנהג על התמיכה דק במהלך תהליך הייבוש. D) אפקט "טבעת קפה". E) Apoferritin ממוזגים ב 2% uranyl אצטט עבור 3 מינימלית Uranyl יונים התערוכה crosslinking משמעותי פעילות של apoferritin את אשכולות אגרגטים גדולים טופס. גודל ברים: A, מיקרומטר 80; B, C 80 ננומטר, 12 מיקרומטר; D, מיקרומטר 80; E, 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כמות קטנה של אמצעי האחסון הנדרש להכנה רשת EM באמצעות הגדרת cryoWriter מאפשר סוגים חדשים של ניסויים. לדוגמה, תוכן הכולל של תא בודד ניתן לאסוף ולהשתמש שהוכנו עבור NS - ו הקפאה-EM. ההליך מסומן ב- איור 6א. תא חסיד, האיקריוטים (HEK 293) הוא lysed אלקטרופורציה בו זמנית, הדגימה השאיפה (לוח 6A)²⁵. הנפח הכולל של 3 nL aspirated, אשר מכילה את התא lysate, נשמר ב- microcapillary עיבוד נוסף. עבור NS-EM המוצגים בלוח 6B, המדיום culturing תא היה להחליף עם מאגר PBS (2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 1.5 מ מ ח'₂PO₄, 136.9 מ מ NaCl, 8.9 מ מ נה₂HPO₄·7H2O, pH 7.4) לפני פירוק התא. תוכן התא היו aspirated 3 nL המאגר, ממוזגים מאגר של NS כפי שמצוין איור 1C עבור 10 דקות לאחר מכן, אמצעי אחסון nL 5 היה ויתרו על גבי הסרט פחמן רציפה של רשת NS-EM. ניתן לזהות חלבונים בודדים, למשל, אקטין filamentous וממברנה תיקונים עם חלבונים המחוברים בתמונה. עבור הקפאה-EM, המוצגת באיור6 ג, נפח של 3 nL היה ויתרו על רשת חור פחמן EM ללא שאיפה מחדש כדי להסיר את הנוזל. הסרט עבה יחסית מדגם שנוצר היה מדולל בהרחבה לפני ויטריפיקציה. כדי לעשות זאת, הטמפרטורה DP-שלב היה בהדרגה, החל מ- הטמפרטורה נקודת הטל. תהליך דליל נוטרה על ידי מערכת חיישן בזמן אמת עד סף שנקבעו מראש התמלאה מפעילה את מנגנון 'פיק-ומים עמוקים' ואת מדגם ויטריפיקציה (עבור פרטים ראה ארנולד, et al. ²⁶). ניתן לזהות מבנים ממברנה וחלבונים בתמונה.

איור 6: יחיד תא פרוטאומיקס חזותי באמצעות את קביעת cryoWriter. A) פירוק של תא בודד האיקריוטים חסיד. התא הוא גדל (1, ירוק) functionalized, איטו מצופה (אדום) זכוכית-שקופית (2) ב קימור קטן-פטרי (3)²⁵. השכבה איטו חשמלית הקרקע. התא ניגשה על ידי microcapillary (4), אשר מצופה פלטינה. מכת אוסמוטי הראשוני (לא מסומן) ניתנת כדי להקל על פירוק, אשר מבוצעת על ידי סדרה של פולסים חשמליים על ידי כוחות גזירה המופעל בזמן השאיפה של התא lysate. ניתן לנטר את התהליך על ידי מיקרוסקופ אור; המטרה עדשת המיקרוסקופ היא המצוין (5). לקבלת פרטים, עיין שלנו^24,הקודם עבודה²⁵. B) התמונה NS-EM של lysate מן התא HEK 293 בודדים. אקטין filamentous טלאים קרום עם חלבונים המחוברים גלויים. לוח משנת ארנולד, et al.²⁴ (הרשאות נוספות הקשורות לחומר ראו צריך להיות מופנה כלפי ACS). C) הקפאה-EM התמונה של lysate מן התא HEK 293 בודדים. שיבוץ מראה של 2 x הגדלה של האזור המסומן שבו קרום טיפוסי מבנים עם חלבונים הקשורים גלויים. לוח ג מקורי ארנולד, et al. ²⁶ סרגלי קנה מידה: B, 50 ננומטר; C, 80 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הכלי 'cryoWriter' ואת הפרוטוקולים נדרש להכין רשתות דוגמת עבור NS - ו הקפאה-EM מאמצעי אחסון המדגם nL בגודל ולהימנע לחלוטין את הצעד נייר סופג קלאסית מוצגים. עקרונות Microfluidic ומערכת micromechanical משולבים ב cryoWriter כדי שזה אפשרי.

הניסיון שלנו מראה כי כאשר משתמשים בשיטות ולמחקר שהוצגו בכתב היד, המרחב פרמטר להכנה EM-רשת גדולה יותר עבור שיטות קלאסיות, ותחת בקרת משתמש הדוק יותר. חשוב, הפארמצבטית מוגברת מושגת מאפשר למיין מראש עם מערכת מאגר לדוגמה, השלים עם חלבון הבדיקה זמינים, כדי לקבוע את הפרמטרים אופטימלי לפני הניסוי בפועל מתבצע. זה שומר הצריכה של המדגם של ריבית המינימום המוחלט, מומלץ בחום. צעדים קריטיים להכנה רשת שני NS - ו הקפאה-EM: (i) הטרמה של מערכת המשאבה; sub-nanoliter נפח dispensing, הנוזל מערכת (מים) חייב להיות degassed, בועה ללא תשלום. (ii) שליטה מדויקת של זוהר פריקה או פלזמה ניקוי שלב; מאפייני הרשת EM משטח מכריעים לתוצאות לשחזור. (iii) דוגמת מיזוג; הזמן הנדרש עבור מיזוג, למשל, עם NS, תלוי סוג המאגר, תוכן מלח וריכוז (איור 3), כמו גם על הצורה הגאומטרית זרבובית של microcapillary²⁴. (iv) אידוי המחירים עבור NS-EM ההכנות EM כמותיים; האפקט קפה-טבעת יכול לאסור ניתוח כמותי של ההכנות NS-EM, בטח להיחסם על ידי אידוי איטי תעריפים בשליטת DP-הבמה.

היבטים שונים של שיטות הכנה רשת שהוצגו יכול להיות בחופשיות משולב המאפשר הפיתוח של פרוטוקולים רב-תכליתי עבור דוגמאות ספציפיות. דוגמאות טיפוסיות יהיה הסרת חומר המונע ברזולוציה גבוהה אם, לדוגמה, גליצרול, על ידי צעד מיזוג לפני הרשת לקראת הקפאה-EM; המבוא של מולקולות המתווך, כגון ליגנדים, על-ידי מיזוג לפני הרשתות מוכנות; או הבחינה של תא בודד lysate על ידי NS - או הקפאה-EM (איור 6).

השימוש מיקרופלואידיקה וכמויות מדגם מינימלי בשיטות הציג מסיר לחלוטין את הצורך צעדים נייר סופג. זה יתרון גדול, כי נייר סופג הוא טיפול אכזרי חלבונים, פוטנציאל זיהום הדגימה עם יונים לא רצויים, מטבעו מוביל לירידה מדגם מסיבית. מצד שני, אפקטים פוטנציאל הנגרמת על ידי ממשק מים אוויר של הסרט דק מדגם שנוצר כאשר דגימות הקפאה-EM הינן מוכנות באופן קלאסי נחסכים לא כאשר cryoWriter. רשתות מתאים הקפאה-EM ניתן להכין עם זמן המתנה פחות מ 0.2 s בין יישום מדגם ויטריפיקציה (נתונים לא מוצג). עם זאת, חלבונים נוסעים כמה עשיריות ננומטר ב מבצע איתחול באמצעות דיפוזיה, יש עדיין מספיק זמן בשבילם להתנגש עם ממשק מים אוויר של סרט עבה מדגם 100 ננומטר מספר פעמים. עם זאת, כמות חלבונים נדבקות הממשק מים אוויר יכול להיות מופחת באופן משמעותי על ידי פערים אלה זמן קצר, עשויה למנוע דנטורציה של חלבונים או מוגבלת כיוון חלקיקים. גישה מבטיחה אחרת עשויה להגן על חלבונים רגיש מממשק מים אוויר היא לכסות את הסרט מדגם על ידי חומרים surface-active נמוך משקל מולקולרי. תרכובות אלו יכול להיות מוצג במהירות על ידי צעד מיזוג cryoWriter לפני ההכנה רשת. היחס השטח לבנפח גבוה של מערכות microfluidic היא מגבלה נוספת של cryoWriter, כמו לדוגמה יכול פוטנציאלית להיות איבד ידי ספיחה לא ספציפי השטח microcapillary ולנער ניתוח כמותי על ידי ספירת חלקיקים. שהבעיה תטופל בשתי דרכים: ראשית, המדגם לא לנסוע מרחקים ארוכים בתוך microcapillary. אכן, האחסון מדגם nanoliter נשאר בקצה צינור קפילר במהלך העיבוד. שנית, פני השטח יחס נפח תקטן עוד יותר באמצעות microcapillaries עם קטרים הפנימי גדול יחסית, למשל, 180 מיקרומטר. שלישית, המשטחים של microcapillaries יכול להיות בקלות passivated במידת הצורך, למשל, אם תתייחס אליהם עם polylysine זמינים מסחרית אתנול glycols (PLL-PEG).

ניתוח ברזולוציה גבוהה של חלבונים על ידי חלקיק יחיד לגישת ב EM דורש רק 100,000 לתמונות מיליון כמה חלקיקי חלבונים בודדים. משמעות הדבר היא כי טכניקות microfluidic יכול לספק מתחמי מספיק חלבון בשביל החקירה מבנית. שיטה חיסונית מיניאטורי-משקעים הבידוד מהירה של חלבון מתחמי (כשעה) מן התא מינימלי כמויות (כ – 40,000 תאים) פותחה קודמות²⁸. שיטה זו עכשיו תקושר ישירות לשלב הכנת המדגם ולמחקר של cryoWriter. המטרה הסופית היא לפתח של צינור microfluidic משולב להכנה חלבון אולטרה מהיר בידוד, הקפאה-EM רשת שדורש פחות משעתיים בכל. יתר על כן, כפי שמתואר באיור 6לכמות מזערית של אמצעי אחסון של חומר לצורך הכנת הדוגמא ואת מיזוג כמעט ללא אובדן נתונים הליך הכנת רשת מושגת באמצעות את cryoWriter, מאפשרים ללמוד החלבון קומפלקסים של תאים בודדים. יחד, השיטה חיסונית מיניאטורי-משקעים, את cryoWriter להניח את היסודות של שיטה פרוטאומיקס חדשה הנקראת "תא בודד פרוטאומיקס חזותי", כפי לאחרונה להדגים עבור ניסויים חום-הלם²⁴. כיום נבדקות באלגוריתמים לניתוח נתונים המיועדים לניתוח של תמונות "פרוטאומיקס חזותי".

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<טיפול חזק>נוזלי
קצה מיקרו-נימי	מטרה חדשה	FS360-100-30-N-20	SilicaTips 30 ומיקרו; מזהה קצה m, 100 ומיקרו; m ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	SilicaTips 30 ומיקרו; מזהה קצה m, 150 ומיקרו; m ID , pk. 20
שרוול מוליך	מטרה חדשה	CONGAS-1	אלסטומר מוליך למגע HV, באורך 12 אינץ'
צינורות סיליקה התמזגו	BGB-Analytik	TSP-150375	כפית צינורות FS סטנדרטיים, 150 ומיקרו; m ID, 363 ומיקרו; m OD, מחבר
PressFit	BGB-Analytik	2525LD	Deact. מחבר PressFit 0.25 עד 0.25 מ"מ קוטר פנימי, pk. 25
מזרק 10 ומיקרו; l	BGB-Analytik	HA-80001	המילטון 1701 LT - קצה לואר (מחט לא כלולה)
בקר משאבת מזרק	Cetoni	A3921000093	ובקר MESYS
יחידת מינון משאבת מזרק	Cetoni	A3921000095	ויחידת מינון MESYS
<חזק>בקרת טמפרטורה נקודת טל חזק>
	Meltec	UFT75-AT	חיישן לחות/טמפרטורה, חישוב נקודת טל, USB וטמפרטורת DLL משובצת
חיישן	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	חיישן טמפרטורה הניתן להרכבה על פני השטח בקר Pt1000
Peltier	Cooltronic	TC2812	בקר טמפרטורה PID עבור הפעלת מערכות מונעות Peltier עם יציאת מתח קבוע
אלמנט פלטייר	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 מ"מ
בלוק קירור מים	-		בלוק קירור מים לאלמנט פלטייר 40x40 מ"מ, משאבת מים על בסיס נחושת
	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 משאבת מאגר כפולה 5.25 מפרץ שחור V4
בלוק מחליף חום מים	-	בלוק	מחליף חום מים עם 2 מאווררים לקירור מים במחזור
מצנני מים קטנים	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram מהדורת נחושת 2 יח'
אלמנטים קטנים פלטייר	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 מ"מ 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 ° C, 2 יח
<חזק>מכניקה
ליניארי ציר z	Dyneos AG	M-404.2PD	שלב תרגום דיוק בעומס גבוה, טווח נסיעה של 50 מ"מ, בקר שלב מנוע DC
	Dyneos AG	C-863	בקר סרוו כספית
מיקרוסקופ שלב ציר xy שלב	H117EIL5 מדעי קודם		ממונע עבור Zeiss Axiovert 200 מיקרוסקופ הפוך
מגנטים קבועים קטנים	Supermagnete	S-05-08-N	מגנט מוט ואוסלאש; 5 מ"מ, גובה 8.47 מ"מ, ניאודימיום, N45, מצופה ניקל, pk. 10
אלקטרומגנט קטן	Schramme	EG1025A02/110	אלקטרומגנט 24V 220 N 150 N 2,5 W
בקר אלקטרומגנט	Conrad.ch	MST-1630.001 7	לוח PCB בקרת אלקטרומגנט
רכזת	סולנואידDistrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	רכזת סולניד 30 מ"מ 16 N 2 N 16 W
מיני פינצטה	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, טיפים דקים במיוחד
חלקים אופטומכניים שונים	Thorlabs	-
חלקים מכניים שונים	סדנת Biozentrum, אוניברסיטת באזל	-	לוחות מתאם בעיצוב אישי, מחזיקים וכו '. ראה קבצי CAD מצורפים
<חזקה>אופטיקה
דיודת לייזר	Thorlabs	CPS780S	מודול דיודת לייזר 780 ננומטר 2.5 mW
גלאי צילום	Thorlabs	PDA100A-EC	Si גלאי רווח להחלפה, 320-1100 ננומטר, 2.4 מגה-הרץ BW, 100 מ"מ
2<חזק>רשתות EM
DURASIN סרט TEM		emsdiasum.comDTF-03523	30 ננומטר DuraSiN™ ממברנות סיליקון ניטריד ל-TEM, חבילה של 5
Quantifoil Cu 200 רשת R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. כתם
PBS	Sigma	D8537  סיגמא	דולבקו s פוספט חוצץ מלח
NanoVan 2%	nanoprobes.com		כתם שלילי מבוסס ונדיום
NanoW 2%	nanoprobes.com		כתם שלילי מבוסס טונגסטן
Software
openBEB			מסגרת openBEB 2 זמינה על פי בקשה, גרסה 3 תהיה ניתנת להורדה
בקרת CryoWriter תוכנה (תוסף openBEB)		זמין לפי בקשה, ייתכן שיחולו חיובים נוספים עבור תוכנת מנהל התקן של צד שלישי.