מאמר שיטה

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

148.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57324

⸱

9 בפברואר 2018

 ,  ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה diacylphospholipids המכיל בשל התכונות הכימיות ייחודי של חומרים פעילי שטח שרשרת אחת. כאן נתאר טכניקות עבור הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של אלה חומרים פעילי שטח.

תקציר

ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה המכילים diacylphospholipids בשל התכונות הכימיות ייחודי של אלה חומרים פעילי שטח. בפרט, חומצת שומן ליפוזומים לשפר את אופי דינמי, בשל המסיסות גבוה יחסית של חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת. באופן דומה, ליפוזומים המכיל חומצות שומן בחינם רגישים יותר קטיונים כלט ומלח, בשל האינטראקציות חזק בין קבוצות ראש חומצה קרבוקסילית יונים מתכתיים. כאן אנו ממחישים שיטות הכנה, טיהור של השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של חומרים פעילי שטח רשת יחיד (למשל, חומצות אולאית).

מבוא

ליפוזומים, או שלפוחית – תאים ותחום על-ידי ממברנות bilayer מורכבת amphiphilic שומנים - מצאו שימוש ביישומים ביו רבים כמו רכבי ההעברה עבור תרופות, מודלים של קרום התא, ועבור התפתחות סינתטיים תאים. אנחנו ואחרים גם המועסקים ליפוזומים כמודלים של קרום התא פרימיטיבי בחיים מוקדם. 1 , 2 , 3 , 4 . בדרך כלל, במערכות כאלה, אנו מעסיקים יחיד-שרשרת חומרים פעילי שטח המכיל הזנב פחמימן השומנים אחד בלבד (למשל, חומצה אולאית), כמו אלה מולקולות פשוטות יותר לסנתז ללא הסיוע של אנזימים מקודד חלבון תאי מודרני להעסיק.

ליפוזומים המורכבת של שומנים חד-שרשרת דומים לאלה של diacylphospholipids (למשל, 1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine, או POPC) כי הגבול הוא מורכב bilayer ממברנות. ליפוזומים נוצר גם מחלקה של ליפידים יכול לשמור תוכן מנה של מומס, יכול להיות לקצץ, מטוהרת על-ידי טכניקות שונות. מספר הבדלים חשובים כתוצאה כימי המאפיינים הייחודיים של שומנים חד-שרשרת. שלפוחית הנוצרת על-ידי פוספוליפידים יציבים על טווח pH רחבה, ואילו חומצת שומן שלפוחית יציבים רק ב- pH נייטרלי לבסיסי בלשון המעטה (ca. 7-9), המחייב מסוימים מאגר pH להכנה שלפוחית. רוב הזמן, מאגר זה עשויים להכיל מולקולות ספציפיות מסיסים שלפוחית כימוס, אשר יכול להיות גם חומרים פונקציונליים (למשל, ה-RNA) ממודר תגובות ביוכימיות או צבעי פלורסנט פשוטה (למשל, calcein ) עבור שלפוחית אפיון.

הנוכחות של רק שרשרת פחמימן יחיד מייצרת קרום זה הן יותר חדיר כדי מומסים בגבול, כמו גם דינמיות יותר. בנוסף, חומצה קרבוקסילית ראש הקבוצה נוכח תוצאות חומצות שומן שלפוחית כי הם יותר רגישים לנוכחות של קטיונים כלט ומלח (למשל, Mg2 +). מגנזיום הוא אחד קטיונים כלט החשוב ביותר עבור ותזרז בתגובות ביוכימיות protocells ללימודי מקור החיים. בחיים מוקדם, לפני האבולוציה של אנזימים חלבונים מתוחכמים, RNA ייתכן היה הפולימר דומיננטי, בשל יכולתה כפול לשכפל את עצמי ולבצע זרז. נציג דוגמה RNA הדורשים מגנזיום הקשורים התגובה היא RNA אנזימטי העתקה, שהראו שנות ה-60. 5 כאשר נוקלאוטידים הרנ"א כימית מופעל (כלומר 2-methylimidazolide נוקלאוטידים) לאגד מתחם פריימר-תבנית שישנו, קבוצת 3'-הידרוקסיל תחל התקפות של 5'-פוספט של מונומר מופעל סמוכים לעקור עזיבת קבוצה (קרי 2-methylimidazole) וטפסים חדש פוספודיאסטרי. כימיה העתקה זו RNA דורש ריכוז גבוה של Mg2 +, אשר צריך להיות chelated כדי להיות תואם עם חומצת שומן protocells. 6 מ ג עוד2 +-התגובה תלויה זה מזורז על ידי ריבוזים האמרהאד, וזה אולי הרנ א קטליטי מאופיין ביותר. ריבוזים הזה, אשר יכול להיות מחדש של שתי oligonucleotides קצר, מבצע תגובה עצמית-המחשוף נוח לפקח על-ידי שינוי ג'ל. ככזה, זה הוא לעתים קרובות מועסק בתור ריבוזים מודל במחקרים מקור החיים. 7 עקב דרישה מאת הזה ריבוזים עבור unliganded מגנזיום, ליפוזומים בדרך כלל נבנות על ידי תערובת של חומצות שומן אסטרים גליצרול חומצת שומן, אשר הם יציבים יותר כדי מגנזיום. 8 , 9 . פרוטוקול זה, אנו מציגים טכניקות פיתחו הכנה, מניפולציה, אפיון של שלפוחית הללו ואנו להדגים יישום של שלפוחית האלה כמו protocells על המארח-אנזימטי RNA העתקה של דג-פטיש ריבוזים זרז.

פרוטוקול

1. שלפוחית הכנה

  1. הכנת סרטים רזה
    1. להשתמש גז חזק מזרקים להעביר כמות מסוימת של ליפידים כמתואר ב- 1.1 טבלה כדי כלורופורם בקבוקון זכוכית.
    2. הפתרון שיתקבל תחת זרם של חנקן או ארגון בשכונה fume להתנדף.
    3. נושא הסרט דק שנוצר ואקום הבית כבר לפחות שעתיים להסיר שאריות כלורופורם. השומנים יכול להיות שמאל תחת ואקום במשך הלילה בשלב זה.
  2. התייבשות של שלפוחית
    1. הכן 10 מ ל 5 מ מ calcein 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0 הידרציה מאגר על ידי המסת 31 מ ג של אבקת calcein 2.5 מ ל 1 מ' טריס-HCl pH 8.0 מאגר והוספת עוד 7.5 מ ל מים (DI) יונים.
    2. פיפטה 250 µL של מעל מאגר הידרציה לתוך שפופרת ריק ולהוסיף 1.875 µL של NaOH M 10 עבור הסופי 75 מ מ הבסיס (½ המקביל של סה כ חומצות שומן). להעביר את הפתרון הסרט דק יבש השומנים על טופס שלפוחית עם ריכוז השומנים הכולל. 0.15 מ'.
    3. שימוש במהירות גבוהה (> 3000 סל ד) vortexer אל מערבולת התערובת המתקבלת עבור 4-5 s.
    4. להשאיר את התערובת השומנים-buffer מטרף מסתובב במהירות נמוכה (ca. סל ד 30) לשתות הרבה, לפחות ללילה.
  3. שינוי גודל של שלפוחית (אופציונלי)
    1. באמצעות פינצטה, להחיל תמיכה מסנן אחד על כל השטח הפנימי של הנמלים מזרק של המתקן.
    2. רטוב כל תמיכה מסנן עם 250 מ מ טריס-HCl, pH 8.
    3. באמצעות פינצטה, החל אחד נחרטו מסלול 100 ננומטר פוליקרבונט ממברנה לאחד. המתקן, טבעות O, לסנן תומך. מטפל כדי לא לקרוע או לנקב את הקרום, בעדינות לדחוף את הקרום o-ring כדי ליצור קשר טוב בין שני משטחים.
    4. להרכיב את. המתקן, מטפל לא לעקור את הקרום ותומך מסנן.
    5. מלאי את המזרק extruder עם ca. 0.5 מ של 250 מ מ טריס-HCl, pH 8. הכנס המזרק הזה צד אחד של המתקן.
    6. הכנס של מזרק ריק בצד השני של המתקן.
    7. בעבודת יד, דוחף את הבוכנה של המזרק המכיל מאגר לאט (≤ 50 µL/s), וודא כי ההתנגדות היא חשה, המציין שקרום נחרטו המסלול הוא במקום וללא פגע. זה עוזר לתרגל את שלב זה ללא קרום במקום על מנת לאמוד את רמת ההתנגדות הצפויה.
    8. הסר ולרוקן את שני מזרקים. . זה לא הכרחי כדי לנקות את שני מזרקים בשלב זה משום שהם מכילים מאגר של הרכב זהה כדי הכנת ליפוזום
    9. לטעון ההכנה ליפוזום לאחד שני מזרקים.
    10. להרכיב מחדש את extruder עם המזרק המכיל מדגם שלפוחית על צד שמאל, מזרק ריק בצד ימין.
    11. בעבודת יד, לחצו הבוכנה של המזרק המכיל שלפוחית מדגם לאט מאוד (10-25 µL/s).
    12. התבונן בקפידה את המזרק בצד ימין של המתקן; ברור מאגר בתחילה יזין את הצד הימני של המתקן (ca. 50 µL, זה נובע לנפח מת הפנימי של המתקן), ואחריו פלומה קטנה של הבלטת ליפוזומים. מיד להפסיק ללחוץ בנקודה זו, הסר את המזרק בצד ימין של המתקן, וזורקים על פתרון זה.
    13. להחליף את המזרק בצד ימין של המתקן, הבלטת עד המזרק השמאלית ריקה.
    14. להפוך את הכיוון של המתקן, חזור על שלב 13. המשך עבור המספר הרצוי של מחזורי (בדרך כלל 7, 9 או 11); מספר אי-זוגי משמש תמיד לוודא ליפוזומים מעוקם האו ם אינם נאספים מן המזרק בתחילה המכיל ההכנה ליפוזום צמצומים מראש.
    15. בעדינות לוותר על התוכן של המזרק ימינה לתוך שפופרת גלאים ומניחים את הצינורית על מטרף מסתובב במהירות נמוכה (ca. סל ד 30) עבור סביב 0.5 h.
    16. להמשיך עם שלפוחית-טיהור, כמתואר בסעיף 2. שלפוחית מעוקם צריכה להיות בשימוש בתוך 24 שעות או extruded מחדש לפני השימוש בפעם הבאה.

2. שלפוחית טיהור

  1. הכנת שלב ניידים לטיהור שלפוחית
    1. להכין 5 מ של 250 מ מ טריס-HCl pH 8 הידרציה מאגר על-ידי הוספת 1.25 מ ל 1 מ' טריס-HCl pH 8 מאגר, 3.75 מ ל מים DI 15 מ ל בז שפופרת. לאחר מכן להוסיף µL 37.5 של 10 M NaOH (½ המקביל של בסיס יחסית חומצת שומן unesterified) אל המאגר לחות. פיפטה µL 235 של חומצה אולאית טהורה ישירות לתוך הצינור בז וכתוצאה מכך פתרון שלפוחית עם שומנים הכולל. 0.15 מ'.
    2. שימוש במהירות גבוהה (> 3000 סל ד) vortexer אל מערבולת התערובת במשך 4-5 s, ואז נפילה על מהירות נמוכה סיבוב שאכר כבר לפחות שעתיים. הכנת השומנים ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה על ניעור מסתובב בנקודה זו. לסנן השלב ניידים באמצעות יחידת מסנן מזרק μm 0.22 לפני השימוש כדי להסיר כל אגרגטים פוטנציאליים.
  2. טיהור של שלפוחית על Sepharose
    1. הסר ca. מ של ethanolic Sepharose 4B slurry הבקבוק באמצעות פיפטה. להחיל את זה על עמודה כרומטוגרפיה חד פעמית 10 מ"ל.
    2. מאפשרים את slurry להתיישב אתנול זרימה דרך עד אתנול מתקרב העליון של המיטה שרף.
    3. החל מ של מים יונים לחלק העליון של שרף, תן זרימה דרך כדי לשטוף את שאריות אתנול.
    4. החל מ מ 250 טריס-HCl, pH 8 חלקים 1-2 מ"ל לחלק העליון של השרף, החלת חלק חדש בכל פעם רמת הנוזל מתקרב העליון של המיטה שרף. חזור על הפעולה 3 - 5 פעמים.
    5. תהדק את העמודה לדוכן אביק, ולאחר מכן חבר את קצה עמודה עם צימוד מחבר, אבובים האספן שבר. הוסף בחלק אחר של המאגר כדי לשטוף את הצנרור, לסגור את צימוד כאשר רמת הנוזל בעמודה מתקרב העליון של שרף.
    6. להחיל השלפוחיות המוגלתיות עם הבלטה של סעיף 1 לחלק העליון של שרף משתמש של pipettor 200 µL, מטפל כדי להחיל ההכנה שלפוחית אחיד ככל האפשר כדי השרף בלי לגעת הקיר המיטה או עמודה שרף.
    7. פתח את צימוד כדי להתחיל את זרימת ולהתחיל לאסוף את השברים לתוך צלחת 96-ובכן. החלת שלפוחית טיהור שלב ניידים לחלק העליון של המיטה שרף ב 0.5-1 מ ל חלקים כמו המאגר מכלה, דואגת שלא להתיר את המיטה שרף להתייבש. לאסוף חמש-שחרור שברים, איסוף לפחות 36 וולס (שלוש שורות של צלחת 96-ובכן).
  3. קרינה פלואורסצנטית אפיון של טיהור שברים
    1. לוקח את הצלחת 96-ובכן מהסעיף הקודם וקרא אותו על קורא צלחת (λex= 485 ננומטר, λem= 515 ננומטר).
    2. להתוות את הנתונים המתקבלים פלורסצנטיות כמו זריחה לעומת מספר שברים. שלפוחית elute ראשון, ואחריו השבר unencapsulated (איור 1).
  4. Repurification של שלפוחית לפקח שלפוחית דליפה
    1. חזור על השלבים טיהור ואפיון ב סעיפים 2.2 ו- 2.3. שלפוחית ששמרו את תוכנם תערוכת אין שיא של unencapsulated ממס (או אחד קטן מאוד של ca. 5-10% של עוצמת השיא שלפוחית).

3. השימוש שלפוחית בנוכחות מגנזיום

  1. השימוש unliganded מגנזיום
    1. להכין ולטהר שלפוחית כמתואר בסעיפים 1, 2.1 ו- 2.2.
    2. להכין 1 מ"ל של 50 מ מ MgCl פתרון2 במאגר pH 8.0 טריס-HCl 250 מ מ על-ידי הוספת µL 250 מ' 1 טריס-HCl pH 8.0 מאגר µL 50 מ' 1 MgCl2 µL 700 של די מים. מערבולת לערבב היטב.
    3. כדי לתת את הריכוז מגנזיום הרצוי של 5 מ מ, לערבב 0.9 מ של שלפוחית מטוהרים µL 100 של מגנזיום פתרון ומערבבים במהירות כדי למזער שיבושים שלפוחית על ידי חשיפה ארעית של שלפוחית ריכוז מקומי גבוה של מגנזיום.
      הערה: ערבוב מהיר של פתרון מגנזיום חיוני שלפוחית יציבות. אם מגנזיום ושלפוחיות לא במהירות מעורבבים מאת vortexing מיידית, יהיו חשופים שלפוחית יש ריכוז גבוה של מגנזיום, וכתוצאה מכך תוצאות לא עקביות מדגם מדגם.
    4. להשאיר את הדגימה שלפוחית לוליין במשך לפחות 30 דקות לפני repurification כמתואר ב- 2.4 כדי לבדוק דליפת התוכן. להוסיף ריכוז המגנזיום כמו שלפוחית מדגם באותו השלב נייד repurification.
  2. השימוש של מגנזיום liganded
    1. להכין ולטהר שלפוחית כמתואר בסעיפים 1, 2.1 ו- 2.2.
      הערה: השתמש ½ קו מקביל במקום NaOH כדי חומצות שומן deprotonate; זה נמצא כי זה מייצרת ליפוזומים יציבים יותר במערכות2 chelated MgCl.
    2. להכין 2 מ' אשלגן ציטרט פתרון ולהתאים את ה-pH ל 8.0 עם קו.
    3. Premix MgCl2 ואשלגן ציטרט ביחס שצוין (ca. 1:4 על שלפוחית יציבה חומצה אולאית) במאגר pH 8.0 טריס-HCl 250 מ מ.
    4. להוסיף מעורבבים מראש מגנזיום ציטראט פתרון המדגם שלפוחית, בקצרה מערבולת.
      הערה: תמיד premix פתרון מגנזיום וליגנד. אף פעם לא לחשוף שלפוחית לפתרון מגנזיום unchelated לבד.
    5. להשאיר את הדגימה שלפוחית לוליין במשך לפחות 30 דקות לפני repurification כמתואר ב- 2.4. להוסיף ריכוז זהה של מגנזיום וחומצה ציטרית כמו הדוגמה שלפוחית השלב נייד repurification.

4. הלא-אנזימטי RNA העתקה של שלפוחית

  1. הכנת monodisperse RNA אנקפסולציה שלפוחית
    1. הכינו סרט יבש חומצה אולאית כמתואר בסעיף 1.1.
    2. להכין מאגר התייבשות שלפוחית עם 50 מיקרומטר פלורסנט שכותרתו תחל RNA, תבנית הרנ א מיקרומטר 150 ו- 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0 המכילה קו מקביל ½ ביחס חומצה אולאית.
    3. להוסיף µL 250 התייבשות מאגר הסרט השומנים ופעל שלב 1.2.2 ו- 1.2.3 כדי לגרום שלפוחית עם ריכוז מוחלט של השומנים 0.15 מ'.
    4. על מנת להפוך unilamellar קטן monodisperse שלפוחית, בצע סעיף 1.3 לשחול שלפוחית.
  2. תוספת מגנזיום ציטראט וטיהור שלפוחית
    1. Premix מניות מגנזיום ציטראט, ואז מערבבים את זה עם שלפוחית לדוגמה כדי ריכוז השומנים הסופי של 0.1 M.
    2. לטהר שלפוחית על Sepharose 4B גודל אי-הכללה של עמודות, עם 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0, ליפידים 0.1 M ונתן מגנזיום וחומצה ציטרית כשלב ניידים.
    3. לאסוף שלפוחית שברים על ידי הבאים בסעיף 2.3.
  3. התגובה הארכת תחל
    1. להכין 200 מ"מ 2-MeImpG (guanosine 5'-monophosphate 2-methylimidazolide) פתרון מניות עם 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0. (הערה: עקוב אחר הקודם פורסם פרוטוקול10 עבור סינתזה 2-MeImpG.)
    2. ליזום פריימר סיומת התגובה, להעביר µL 150 של פתרון מניות 2-MeImpG µL 450 שלפוחית הדגימה להגיע ריכוז סופי של השומנים 75 מ מ ו- 50 מ מ מופעל מונומר. התחל הטיימר ולשמור התגובה לטעום נופל כל הזמן.
    3. (אופציונלי) מונומר טריים רציפה האכלה, להעביר 300 µL של התגובה פתרון לתא אחד dialyzer בנפח מצומצם ליפוזום מעבדה נבנה11 , לשים 300 µL האכלה פתרון בחדר השני. הפתרון האכלה צריך להכיל את כל המרכיבים-ריכוז זהה כמו הפתרון התגובה, למעט החלפת RNA המכיל שלפוחית עם שלפוחית ריקה. כל סיבוב של דיאליזה לוקח 1-24 h, בהתאם analyte ממברנה בשימוש.
    4. ללימודים קינטי, קח µL 100 aliquot בכל נקודה בזמן, repurify את aliquot דרך 4B Sepharose גודל אי-הכללה של העמודה עם 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0 כמו השלב ניידים.
    5. לאסוף את השברים שלפוחית בשפופרת ריפרבאן מ"ל 1.5.
    6. פיפטה טריטון כדי שברים שלפוחית כדי מבחן סופי בסביבות 0.1% v/v.
    7. להוסיף 0.5 מ"ל אתנול קר אל הצינור, דגירה ב-20 ° C כבר לפחות שעתיים.
    8. Centrifuge כל הדגימות ב- 16.1 × 1000 rcf (16.1 × g) במשך 10 דקות ובעדינות פיפטה החוצה הנוזלים. לשטוף הרנ א. גללים עם אתנול 70% קר, צנטריפוגה שוב עבור 5 דק למחוק את הנוזל ולשים את הצינור עם כדורי RNA בבלוק בחום 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות מתמוססות אתנול שיורית. להמיס את כדורי µL 50 של אוריאה 8 מ' עם 1xTBE טעינת מאגר.
  4. דף ניתוח
    1. להכין 20% ג'ל דף על ידי ערבוב 200 מ של מערכת UreaGel התרכז, 25 מ של מערכת UreaGel diluent, 25 מ של מאגר 10xTBE, µL 80 של TEMED ו- 250 מ"ג של קירור. שופכים את התערובת ג'ל בין לוחות בחוזקה ג'ל (35 ס"מ × 45 ס"מ) ובמהירות להוסיף את המסרק. המתן לפחות 30 דקות עד הפילמור מלאה.
    2. להרכיב את הצלחת ג'ל על גבי המעמד ג'ל ולמלא את תיבות ג'ל עם ג'ל 1xTBE הפעלת מאגר. קח את המסרק, לשטוף את הבארות עם מזרק. מראש להפעיל את הג'ל עם 60 W למשך 30 דקות.
    3. מחממים את הדגימות בבלוק חום 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות וטען 5 µL של כל מדגם לכל טוב.
    4. הפעל את ארון החשמל ג'ל ולהגדיר ג'ל רץ עם קבוע וואט 60 W עבור 2.5 h.
    5. לפרק את הצלחת ג'ל מדוכן ג'ל, תנקה את הזכוכית ולשים את כל הצלחת ג'ל סורק כדי להתחיל סריקה ג'ל.
    6. לכמת את הג'ל עם ImageQuant TL 1 י ניתוח. להתוות את הלוגריתם הטבעי של היחס בין כמות פריימר שנותרו בנקודת זמן נתון לסכום הראשוני של פריימר לעומת זמן מתאים לקו, לחשב את קצב התגובה הראשונה מדומים סדר (איור 2).

5. דג-פטיש המחשוף RNA עצמית בתוך שלפוחית

  1. הכנה ולטיהור ריבוזים במארז שלפוחית
    1. הכינו סרט דק השומנים (OA: GMO = 9:1) כמו בסעיף 1.1 עם רכיבים כמו טבלה 1.2. הערה: GMO חמים עד לפחות 60 ° C התכה מלאה לפני השימוש.
    2. להכין מאגר התייבשות שלפוחית עם 5 מיקרומטר של כל דג-פטיש ריבוזים סטרנד ו- 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0.
    3. להוסיף µL 250 התייבשות מאגר הסרט השומנים, בצע את שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3 כדי לגרום שלפוחית עם 0.15 מ' סה כ שומנים בדם ריכוז.
    4. על מנת להפוך unilamellar קטן monodisperse שלפוחית, בצע סעיף 1.3 לשחול שלפוחית.
    5. לטהר שלפוחית על Sepharose 4B גודל אי-הכללה של עמודה, עם 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 0.15 מ' מעורב ליפידים כשלב ניידים.
  2. האמרהאד ריבוזים העצמי-המחשוף התגובה
    1. להכין פתרון מגנזיום ומערבבים עם שלפוחית מטוהרים כמתואר בסעיף 3.1 ליזום את התגובה העצמי-המחשוף.
    2. ללימודים קינטי, קח 100 µL של התערובת בכל נקודה בזמן, ישירות repurify הזה aliquot דרך 4B Sepharose גודל אי-הכללה של העמודה עם 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0 כשלב ניידים. לאסוף את השבר שלפוחית.
  3. דף ניתוח
    1. בצע את שלבים 4.3.6 ללא כדי 4.3.8 להכין RNA טעינה הדגימה.
    2. מקום מסחרית casted 15% ג'ל TBE-אוריאה לתוך תיבת ג'ל, למלא את התיבה ג'ל עם ג'ל 1xTBE הפעלת מאגר.
    3. מחממים את הדגימות בבלוק חום 80 ° C עבור 1 דקות וטען 5 µL של כל מדגם לכל טוב.
    4. הפעל את הג'ל עם 200 קבוע V עבור בסביבות 1 h.
    5. סרוק את הג'ל.
    6. לכמת את הג'ל עם תוכנה לניתוח, כמו ImageQuant TL 1 י, כדי למדוד את היקף המחשוף על-ידי השוואת האינטנסיביות של הנותרים המצע הלהקה RNA ו- RNA cleaved קטע הלהקה (איור 3).

6. ענק חומצת שומן שלפוחית על מיקרוסקופ

  1. הכנה של חומצת שומן ענק שלפוחית
    1. בצע בסעיף 1.1 ו- 1.3 טבלה כדי להכין סרט דק חומצה אולאית 0.2% מול השומנים fluorescently שכותרתו להשגחה ממברנה טוב יותר.
    2. נתרענן השומנים סרט עם 500 µL 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0 כדי להפוך ליפידים 10 מ מ מדגם שלפוחית בסך הכל. המאגר עשוי להכיל צבעי פלורסנט או מולקולות RNA במידת הצורך. השאר שלפוחית דגימת נוזלים בין לילה.
    3. הכן 150 מ ל חומצה שומן טהור מאגר דיאליזה עם 10 מ מ סה כ שומנים על ידי ערבוב µL 470 של חומצה אולאית, 150 מ ל 250 מ מ טריס-HCl pH 8.0 המכיל ½ NaOH שוות ערך.
    4. הבלטת המדגם שלפוחית דרך קרום פוליקרבונט 10 מיקרומטר להוציא אגרגטים גדולים.
    5. להעביר את הדגימה שלפוחית קלטת דיאליזה נקבוביות גדולות 1 מיקרומטר, כפי שצוין בעבר תיאר. 12
    6. מקם את הקלטת דיאליזה לתוך גביע 100-mL המכיל מאגר דיאליזה 30 מ. להתסיס את הספל בעדינות על שולחני מטרף-80-100 סל"ד.
    7. לשנות את המאגר דיאליזה כל 30 דקות במשך 5 פעמים להסיר צבע חינם או RNA ושלפוחיות קטן.
    8. בזהירות להסיר את הדגימה שלפוחית בקלטת דיאליזה עם מזרק ואת העברת צניעותו גלאים.
  2. התבוננות מיקרוסקופית
    1. פיפטה 10 µL של שלפוחית לשקופית מיקרוסקופ רגיל נקי, הצב תגית כיסוי זכוכית על המדגם. חותם מכסה זכוכית עם לק שקוף.
    2. להתבונן השלפוחיות המוגלתיות עם 60 X פיזור שמן או מטרה דומה על ידי קונפוקלית באמצעות מקור לייזר מתאים עבור fluorescently-ידי ממברנה, RNA או שעברו אנקפסולציה צבען (איור 4).

תוצאות

אנחנו בדרך כלל לבצע ליפוזום purifications על גודל-אי-הכללה של עמודות. ההכנות ליפוזום טיפוסי מכיל של fluorophore מסוג כלשהו. כאשר ליפוזומים שנוצרה, extruded, המין כימוס נמצאים בתוך ומחוץ ליפוזומים. וטיהור ליפוזומים על גודל-הדרה שרף (Sepharose 4B), מומסים בגבול unencapsulated נשמרים בתוך הנקבוביות של השרף, בזמן ליפוזומים גדולים אינם, elute הראשון (איור 1 א'). איסוף שברים של התוויית פלורסצנטיות לעומת שבר מספר (איור 1B) בדרך כלל מניבה עקבות 2-שיא, עם שברים מוקדם eluting המקביל ליפוזומים, אשר לאחר מכן נאספים וכוח ביישומים הבאים.

אנו בוחנים לעתים קרובות nonenzymatic תחל סיומת תגובות, אשר היו אמצעי סביר שכפול RNA לפני ייסודה של ריבוזים ו polymerases RNA חלבון מבוססת. תגובות אלו בדרך כלל מעסיקים פריימר fluorescently שכותרתו (איור 2 א), אשר נמתח מונומרים מופעל. תגובות אלו ניתן יהיה פיקוח על ידי אלקטרופורזה בג'ל (איור 2B), electropherograms שנוצר משולב כדי לקבל קצב קבועים עבור תנאי התגובה הנתונה (איור 2C).

כדי להדגים כי RNA יכול לתפקד בתוך protocells, אנו מעסיקים האמרהאד ריבוזים העצמי-המחשוף (איור 3 א) כתגובה דגם RNA קטליטי. התגובה הזו דורשת חינם מ ג2 + כדי לסייע זרז, לכן השתמשנו OA/GMO שלפוחית מאז הם יציבים בנוכחות 5 מ מ ג2 +. בדומה פריימר סיומת תגובות, התגובה העצמי-המחשוף של ריבוזים האמרהאד ניתן גם פיקוח על ידי אלקטרופורזה בג'ל (איור 3B) וניתח מאוחר יותר כדי לרכוש את קצב קבוע תחת תנאים מסוימים (איור 3C).

אנחנו תמונה ליפוזומים העסקת שני פלורסצנטיות, מועבר האור. ליפוזומים ניתן לסמן באמצעות שומנים פלורסנט, אשר לתת תווית ממברנה (איור 4A), או באמצעות של ממס פלורסנט בתוך שלהם לומן (איור 4B). אור המשודרת יכול לשמש גם כדי לצפות שלפוחית (גם שמוצג באיור 4B).

טבלה 1.1 חומצה אולאית טהורה ב כלורופורם
רכיבמניותכמות
חומצה אולאית> 99%11.7 ΜL
כלורופורם1 מ"ל
שולחן 1.2 חומצה אולאית, גליצרול monooleate (9:1) ב כלורופורם
רכיבמניותכמות
חומצה אולאית> 99%10.5 ΜL
גליצרול monooleate> 99%1.4 ΜL
כלורופורם1 מ"ל
חומצה אולאית 1.3 טבלה עם 0.2mol% Rhodamine-PE ב כלורופורם
רכיבמניותכמות
חומצה אולאית> 99%1.6 ΜL
Rhodamine-PE של כלורופורם10 מ מ20 ΜL
כלורופורם1 מ"ל

טבלה 1. חומצת שומן כלורופורם פתרונות.

תהליך כרומטוגרפיה של שלפוחית קלצין; תרשים וגרף פלואורסצנטי המציגים תוצאות הפרדה.
איור 1. שלפוחית אפיון פלורסצנטיות וטיהור של טיהור שבר. א הפרדה בין שלפוחית המכילה calcein מ- calcein חינם על עמודה 4B Sepharose. B. שלפוחית וזיהוי calcein חינם שיא ידי קרינה פלואורסצנטית היטב כל אחד לעומת מספר טוב אחרי שבר אוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תרשים תהליך הרחבת DNA, תוצאות אלקטרופורזה של ג'ל וגרף ניתוח קינטי.
באיור 2. שכפול RNA Non-אנזימטי בתוך שלפוחית OA. א ערכה של הארכת תחל RNA-אנזימטי. תמונת דף ב' לתגובה הרחבה תחל בתוך שלפוחית חומצה אולאית טהורה, עם תנאים כמו סעיף 4. ג לינארית מתאים של הלוגריתם הטבעי של היחס בין כמות פריימר שנותרו בהתחשב נקודת זמן לכמות פריימר לעומת זמן מעל 30 ה קצב התגובה הראשונית, שמחושבים השיפוע של ln (P/P0) לעומת הזמן, 0.058 h-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיאגרמת מחשוף RNA, אלקטרופורזה של ג'ל, תרשים ניתוח קינטי; תהליך מצע עם תווית Cy3.
איור 3. האמרהאד המחשוף ריבוזים ב- OA/GMO שלפוחית. א ערכה של דג-פטיש ריבוזים המחשוף של המצע שכותרתו fluorescently סטרנד (למעלה). ב' דף תמונה של ראש פטיש המחשוף ריבוזים בתוך שלפוחית OA/GMO עם 5 מ מ ג2 +. ג. פעילות ריבוזים בתוך שלפוחית. התאמה לינארית של הלוגריתם הטבעי של היחס בין כמות המצע שנותרו בהתחשב נקודת זמן על כמות המצע לעומת בתקופה הראשונה 4 h התגובה הראשונית קצב, שמחושבים השיפוע של ln (S/S0) לעומת הזמן, הוא 0.36 ה-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תמונות מיקרוסקופיה כפולה של שלפוחיות שומנים, הדמיה פלואורסצנטית וניגודיות פאזה.
באיור 4. חומצת שומן ענק שלפוחית על מיקרוסקופ. א קונפוקלית דימוי PE Rhodamine הנקרא חומצה אולאית שלפוחית, סולם בר 10 μm. B. מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונה של חומצה אולאית שלפוחית המכילה Alexa488 תוויות RNA עם ממברנה שמוצג בערוץ משודרים גלאי (TD), סולם בר 5 μm.

דיון

ליפוזומים של חומצות שומן שהוצעו על ידי רבים דגמים פוטנציאליים עבור תאים פרימיטיביים בשל שלהם חדירות גבוהה ואת מאפייני דינמי. קבוצת ראש קרבוקסילית של חומצות שומן שרשרת אחת בלבד מאפשר הרכבה עצמית תוך ממברנות בטווח מוגבל pH, בקרום וכתוצאה מכך די רגישים לנוכחות של מלחי. כתוצאה מכך, חומצת שומן שלפוחית דורשים הכנה שונה וטיפול בשיטות לעומת פוספוליפיד שלפוחית.

ב פרוטוקול זה, שלמרות שאנו משתמשים חומצה אולאית כדוגמה עבור ליפוזום היווצרות, השני שרשרת חומצות שומן בלתי רוויות (C14) ונגזרותיהם (ca. חומצה myristoleic, חומצה palmitoleic, כהלים התואם את גליצרול אסטרים) גם טופס שלפוחית בעקבות השיטה התייבשות סרט דק כל עוד ריכוז סה כ שומנים בדם הוא מעל cmc את ה-pH מאגר הידרציה קרובה pKa של חומצת השומן בתוך הקרום. מלבד טריס-HCl מאגר בשימוש פרוטוקול זה, מערכות אחרות-מאגר (ca. bicine, פוספט, בוראט) דווחו לתמוך היווצרות שלפוחית חומצת שומן, למרות שלפוחית נוצר מאגר פוספט או בוראט הם בדרך כלל די דולפים13. השלפוחיות המוגלתיות חומצת שומן שנוצר לאחר התייבשות הם polydisperse ו multilamellar, אבל בקלות מומרים קטנות monodisperse unilamellar שלפוחית על ידי ההבלטה כמתואר. לעומת sonication כאמצעי חלופי עבור יצירת שלפוחית קטנה, שחול מספק אפשרויות נוספות עבור הפקד של שלפוחית גודל על-ידי החלת ממברנות גודל הנקבוביות שונים. על ידי הגדלת מספר מחזורים שחול, ניתן להשיג שלפוחית עם התפלגות גודל לצר יותר, גודל ממוצע של קרוב גודל הנקבוביות קרום שלפוחית לאחר שחול בדרך כלל מעט יותר גדול מאשר גודל הנקבוביות ממברנה.

כדי לסנתז protocells תפקודית, חומצת שומן שלפוחית צריך מארח תגובות ביוכימיים ספציפיים הנובע ומגעים RNA או אבני הבניין השני. השיטה התייבשות סרט דק מספק דרך קלה כדי שלפוחית טופס המכיל חומרים שעברו אנקפסולציה הרצוי. עם זאת, היעילות כימוס נמוכה יחסית, חלק גדול של חומרים יקרים כגון RNA יאבדו בדרך כלל במהלך תהליך טיהור. במקרים מסוימים היעילות כימוס ניתן לשפר בצניעות לפי מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-להפשיר לפני ההבלטה. Microfluidic שיטות להכנת תשואה גבוהה פוספוליפיד ליפוזומים מאפשר כמעט 100% כימוס יעילות, אולם מקבילה לא ובכל זאת פותחו שיטות עבור שלפוחית חומצת שומן.

כאשר טיפול protocells עם chelated או חינם מ ג2 +, טיהור אחרי תוספת פתרון מגנזיום ו repurification לפני כל נקודת זמן מבטיחה סילוק דלף אנקפסולציה חומר אשר עלול להשפיע על הדיוק של קצב התגובה מדידות בתוך שלפוחית. מאז כל אחד לטיהור לוקח לפחות 10 דקות כדי להשיג הפרדה טובה וכדי לאסוף את השברים שלפוחית, הניתוח של התגובות מהיר הוא קשה, חייבים לעצור את התגובה לפני עמודה repurification.

פרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא גם מתאים לבנייה של חומצת שומן ליפוזומים לארח תגובות מחקה אלה שעלולים להתרחש בתאים פרימיטיבי. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים גם יישומים פוטנציאליים בפיתוח של מערכות משלוח ביו ריאקטורים לתגובות ביוכימיים אחרים.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

J.W.S. הוא חוקר במכון רפואי הווארד יוז. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק (290363) של הקרן סימונס J.W.S. הן A.E.E. והן K.P.A. מכיר בכך תמיכה מקרנות הפעלה אוניברסיטת מינסוטה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
SEPHOROSE 4BSIGMA-ALDRICH INC4B200
calceinSIGMA-ALDRICH INCC0875-10G
tris-HCl pH8.0 1MLIFE TECHNOLOGIES CORPAM9851
חומצת לימוןSIGMA-ALDRICH INC251275-500G
נתרן הידרוקסידSIGMA-ALDRICH INC71690-250G
אשלגן הידרוקסידSigma30614
חומצה אולאיתNu-ChekU-46-A
גליצרול מונואולאטNu-ChekM-239
Liss Rhodamine-PELIFE TECHNOLOGIES CORPL1392
מגנזיום כלורידFisher/Thermo Fisher ScientificAM9530G
תרכיז סקווג'לDiagnosticsEC-830
sequagel מדללNational DiagnosticsEC-840
15% TBE-UREAGEL תרמו פישר EC68852BOX
מדעי אוריאהסיגמא אולדריץ'U6504-500G
טיטון-100xסיגמא-אולדריץ' בע"מT9284-100 מ"ל
פריימר RNAIDT5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA תבניתIDT5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
גדיל מצע ראש פטישIDT5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
גדיל ריבוזיים ראש פטישIDT5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG
סט מכבש שלפוחיתAVANTI POLAR LIPIDS610000
אספן שבריםGilson, Inc.
צלחות 96 בארותפישרNC9995941/675
קורא צלחותמכשירים מולקולרייםSpectraMax i3
מיקרוסקופ קונפוקליNikon NikonA1R MP
GE HealthcareLife Sciences טייפון 9410 סורק
National 171041 סורק ג'ל קונפוקלי

מקורות

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009(2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ליפוזומים של חומצות שומןהכנת ליפוזומיםטיהור ליפוזומיםאקסטרוזיה של ליפוזומיםעמודת Sepharose 4Bהפרדת שלילים לפי גודלשלילים של חומצה אולאיתבופר Tris-HClשייקר במהירות נמוכהוורטקס במהירות גבוהה
הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.