הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57327

⸱

25 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hunan Engineering Technology Research Center of Featured Aquatic Resources Utilization, Hunan Agriculture University, 2Texas A&M University, 3Texas A&M Institute for Genomic Medicine, 4Sun Yat-Sen Memorial Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

תקציר

חשיפה לכימיקלים סביבתיים מסוימים של האדם ובעלי חיים נמצאה לגרום נזק תאי של תאי β בלבלב אשר יוביל להתפתחות של סוכרת סוג 2 (T2DM). למרות המנגנונים על הנזק תאי β כימית-induced היה לא ברור, עשוי להיות מורכב, ממצא חוזרות אחד היא כי חומרים אלה זירוז סטרס חמצוני שמוביל הדור של מינים חמצן תגובתי מוגזמת (ROS) לגרום נזק התא β. כדי לזהות פוטנציאל diabetogenic כימיקלים סביבתיים, בודדנו תאי הלבלב איון של עכברים C57BL/6 ואיון בתרבית תאים ב 96-ובכן תא תרבות לוחות; לאחר מכן, התאים איון היו עצומות עם כימיקלים, הדור ROS אותרה על ידי 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) הפלורסנט. באמצעות שיטה זו, אנו נמצא כי ביספנול A (BPA), Benzo [א] pyrene (BaP) ולאחר polychlorinated biphenyls (PCBs), עלול לגרום לרמות גבוהות של ROS, רומז כי הם פוטנציאלי עלול לגרום נזק תאי איון. שיטה זו צריכה להיות שימושית עבור הקרנת diabetogenic ואינטראקציות. בנוסף, התאים בתרבית איון עשוי גם להיות מותאם לניתוח במבחנה רעילות כימית-induced בתאי הלבלב.

מבוא

עולה השכיחות של T2DM הפכו משבר הבריאות העולמי בשנים האחרונות פוזות איום רציני לבריאות הציבור1. גורמים רבים נמצאו להיות מקושר סיבתי הפיתוח של T2DM, ביניהם, חוזרות ממצאים מראים כי נקודה מתכנסת אחת נפוצה עבור גורמים אלה הוא אינדוקציה של סטרס חמצוני, מה שמוביל הדור של ROS מופרז2 , 3.

מגוון רחב של כימיקלים סביבתיים לרבות Pcb, דיוקסינים BaP נמצאה לזירוז סטרס חמצוני, אשר עלול לפגום את תפקוד תאי β בלבלב, להוביל תנגודת לאינסולין ו- T2DM4. למרות הרמה פיזיולוגיים של ROS ממלא תפקיד חשוב בתאיים, חשיפה ROS שחורג הקיבולת של המערכת נוגד חמצון מתבטא הנזק לרקמות/תאים ומוביל מחלות5. תאי β בלבלב אקספרס רמה נמוכה של אנזימים נוגדי חמצון, ולכן הם מטרה רגיש ביותר נזק בתיווך סטרס חמצוני6,7. חשיפה כרונית רמות גבוהות של ROS הוכח לגרום תאי הלבלב מפגינות תפקוד5 וכן לאינסולין בכבד, רקמת שומן8.

המטרה הכוללת של הפרויקט הזה היא לפתח הנועד מבוססת תא כימיקלים המסך שלהם פוטנציאל diabetogenic מבוסס על אינדוקציה שלהם של ROS בתאי הלבלב. הלבלב חסר רעלים מטבוליים, הוא מטרה רגיש הנזק הנגרמת xenobiotic6,7. לכן, על ידי מדידת ישירות את האבחון שנוצר בתאי הלבלב, וזמינותו הזה צריך לספק הערכה ישירה של הפגיעה הנגרמת כימית בלבלב. כדי לפתח שיטה זו, אנחנו מבודדים לנגרהנס עכבר תרבותי של איון מבודד בתנאי התרבות תאים עם כימיקלים, מנוצל הדור ROS כימית-induced כמו המדידה. ההליך זה פשוטה ויעילה בזיהוי בתדר ROS חומרים כימיים איון מבודדים; זה יכול להיות פיתוח נוסף לחקירה על מנגנוני רעילות ספציפיים הלבלב חוץ גופית בתוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים כל הוצאו להורג בדרישות ההנחיות הרלוונטיות כל, תקנות וגופים רגולטוריים. פרוטוקול להיות הפגינו בוצעה תחת הדרכה ואישור של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של טקסס A & M המכון ללימודי רפואה גנומית.

1. פתרון הכנה

  1. לדלל תמיסת מלח מאוזנת של האנק x 10 ל- x 1 עם כפול מזוקקים H2O, ולאחסן ב 4 º C.
  2. הכינו את הפתרון בידוד על-ידי הוספת HEPES (10 מ מ), MgCl2 (1 מ מ) וגלוקוז (5 מ מ). להתאים את ה-pH ל 7.4 ולשמור על קרח.
  3. להכין את הפתרון collagenase מן collagenase Type 4.
    הערה: באופן ספציפי, collagenase Type 4 מכיל 160 U לכל מ ג של משקל יבש. 1 גר' collagenase Type 4 הוא מדולל 5 מ"ל כפול מזוקקים H2O עם ריכוז של 200 מ"ג/מ"ל. 2 מיליליטר Collagenase מדולל מתווסף 30 מ ל הקרח בידוד קר פתרון, 6 מ של פתרון collagenase מועבר שפופרת 50 מ עבור כל עכבר.
  4. הכינו את הפתרון שטיפת על-ידי הוספת 1 מ"מ CaCl2 הפתרון בידוד.
  5. הכינו את פתרון טיהור בעזרת פתרון diatrizoate polysucrose קר/נתרן (1.1119 g/mL, 5 mL).
  6. להכין 500 מ"ל של איון תרבות בינוני על-ידי הוספת-גלוטמין (20 מ מ), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), סרום שור עוברית (FBS) (10%) לתוך RPMI בינונית.
  7. להכין את הפתרון DCFH-DA מניות על ידי המסת אבקה מים מזוקקים-200 מיקרומטר, חנות ב-20 ° C.
    הערה: האבחון מכתים הפתרון נעשה טרי על ידי דילול לפתרון מניות DCFH-DA הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר ב- RPMI. ריאגנט הזה צריך להיות מוגן מפני אור.

2. ניתוח הכנה

  1. Intraperitoneally להזריק (I.P.) עכבר עם avertin (2.5% avertin, 0.4 מ ל/20 גרם). אחרי העכבר הוא מורדם לחלוטין, כבר לא מגיב כדי הינד רגל צובט, המתת חסד בעכבר והזז מכסה המנוע ביולוגי.
  2. הנח את העכבר לאללה עם הצד הבטן פונה כלפי מעלה, לרסס את העור עם אתנול 70% עבור עיקור.
  3. פתיחת חלל הבטן עם 1 ס מ U-החתך על הבטן העליונה ומשכו את העור בכיוון rostral החזה כדי לחשוף את חלל הבטן.

3. לבלב זלוף והסרה

  1. כמופיע באיור1, למצוא את המיקום של ampulla. השתמש זוג מלקחיים מעוקל נכנעתי התריסריון קרוב המיקום של הסוגר של Oddi. להשתמש עוד זוג מלקחיים מעוקל תהדק את הקיר התריסריון כדי לחסום את המעבר מרה תריסריון.
    הערה: Ampulla לא הוכנס בשלב זה. שלב זה נועד לחסום את המעבר מרה תריסריון.
  2. למקם מחדש את העכבר עם הראש הפרוקסימלית ואת כפות הרגליים דיסטלי לגבי החוקר.
  3. למצוא את צינור המרה, לאט להזריק 3 מ"ל של collagenase פתרון בעזרת מזרק 5 מ ל ומחט 30 גרם. ודא שאת צינור המרה והלבלב הם בניפוח לאחר הזריקה.
  4. הסר את הלבלב נפוחה באמצעות מלקחיים מעוקל מספריים בסדר כדי להפרידו מן יורד קולון, המעיים, קיבה, טחול. למקם את הלבלב צינור 50-mL המכיל 3 מ"ל של פתרון collagenase ולשמור אותו בקרח.

4. לבלב עיכול

  1. מקם כל שפופרת 50-mL לתוך אמבט מים 37 º C. תקופת דגירה של 15-20 דקות (זמן משתנה עם זן, הגיל של העכברים).
  2. רטט הצינור באמצעות מערבולת.
  3. בריכה 4-5 הלבלב מתעכל במסננת גדולה כיור סטרילי והשתמש סקופ כדי להפוך הלבלב להתפרק ביסודיות. להשתמש בכוח pipette התאים מתעכל מהמסך 23 גרם 10 מ"ל ומחט המזרק המכיל שטיפת פתרון. לאסוף את הפתרון לשטוף בצינור 50-mL.
  4. Centrifuge הצינורות ב g x 97 ב 4 ° C עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע.
  5. להוסיף 25 מ של פתרון לשטיפת צינורות, מחדש להשעות את הרקמה על ידי עדין vortexing. ספין לאורך הרקמות ב g x 97 ב 4 ° C עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע. חזור על 3 פעמים. להיזהר לא להוציא את הרקמה pelleted.

5. טיהור של איים קטנים

  1. להוסיף 10 מ של פתרון טיהור בגדר רקמות שטף, resuspend בעדינות את התוכן.
  2. בעדינות כשכבת-על 5 מ של בידוד פתרון על הפתרון טיהור. הקפד לשמור על ממשק נוזלי חדה בין שני הפתרונות.
  3. Centrifuge את הצינור 560 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם האצה איטית, בלי בלמים. להוסיף את פיפטה לתוך הממשק ולאסוף את השכבה איים קטנים לתוך צינורות 50 מ ל חדש.
  4. לשטוף את איונים כפי שמתואר בשלב 3.5.

6. ציפוי וטיפול של תאי איון

  1. Resuspend ע ב 10 מ"ל של איים קטנים תרבות פתרון מערבבים היטב ובעדינות במקום 100 µL טוב עם פיפטה רב-ערוצי על צלחת 96-ובכן. במקום כ 5 איים לכל 96. טוב.
  2. מקם את הצלחת בחממה תרביות רקמה במשך 12 שעות.
  3. Centrifuge (112 x g) של צלחת 96-ובכן ולהסיר המדיום תרבות.
  4. לדלל כימיקלים סביבתיים במדיום תרבות איונים. להוסיף 100 µL של כל אחד מדלל כימי לתוך בארות נפרדים של הצלחת. Resuspend איים על כל היטב, תקופת דגירה של 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס (הריכוז משתנה לחומרים סביבתיים שונים).

7. ROS מכתים ומדידה

  1. לאחר הטיפול איונים, לשטוף עם PBS 1 x (200 µL עבור כל 96-ובכן).
    הערה: ריכוז הכימיקלים הוא כדלקמן: AFB1: 3 מיקרומטר, מסוג אטרזין: 100 מיקרומטר, BaP: 10 מיקרומטר, BPA: 100 מיקרומטר, β-אסטרוגן, PCB126: 10 מיקרומטר, Nonylphenol ו BPA: 100 מיקרומטר.
  2. השתמש N-אצטיל ציסטאין (NAC) כ נוגד חמצון כדי להרוות ROS. להוסיף 5 מ מ של NAC מדלל כימיות הנוצרות על-ידי ROS, תקופת דגירה של 12 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. Centrifuge את הצלחת 96-ובכן ב g 112 x, דגירה עם 5 מיקרומטר פתרון של בדיקה פלורסנט (H2-DCFH-DA מומס RPMI מדיה) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  4. לשטוף את התאים איון שטופלו 3 פעמים עם PBS ולמדוד את זריחה עם קורא microplate-488 ננומטר.
    הערה: ההצטברות של DCF בתאים יכול להימדד על-ידי עלייה בזריחה ב- 530 ננומטר כאשר המדגם הוא נרגש-488 ננומטר.
  5. מבצע אינסולין הגלוקוז-גירוי הפרשת (GSIS) assay9 xenobiotic בתדר ROS מטופלים איונים ושל לא מטופל כדי למדוד את ההשפעות xenobiotic על תפקיד פיזיולוגי באיי לנגרהנס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מיקרוסקופ של איון מבודד בריא מוצג באיור 2, שבה יש איים קטנים עגולים או אליפטיים צורה עם מדים יחסית לגודל (למרות אחידות הגודל יכול להשתנות זן זן). חקרנו את הפונקציות הלבלב איון assay במבחנה הבא מאת לבודד את איון והמרצת הפרשת אינסולין בלבלב ע תרבות. איור 3 מראה את ניתוח טיפוסי וזמינותו GSIS מ- C57BL/6 איונים העכבר מבודדת הנגרמת על ידי גלוקוז 3.3 מ מ ו- 16.7 מ מ9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לצבירת ראיות מציע כי החשיפה לכימיקלים סביבתיים ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות של T2DM. ROS ואינטראקציות-induced הוכר כגורם etiological פוטנציאליים, תורם להתפתחות של T2DM. בני אדם חשופים למגוון רחב של כימיקלים xenobiotic, ויש צורך גדול עבור מחקר חדשניים טכניקות לזיהוי ביעילות את הלבלב חשיפה לרעלים, לחקור את המנגנון של רעילות ספציפיים בתאי הלבלב.

במחקר זה, המבוסס על הנהלים שפורסמו14, פיתחנו פרוטוקול כדי לבודד לנגרהנס של עכבר ומסך התאים בכימיקלים xenobiotic עבור נזק חמצוני מפגינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפרויקט טייס ממרכז CREH ממומן על ידי NIEHS ועל ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31572626).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 פעמים; האנק' תמיסת מלח מאוזנת GIBCO14185-052
קולגנאז סוג 4Worthington Biochemical CorporationCLS-4
תמיסת פוליסוכרוז/נתרן דיאטריזואט Sigma10771
2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA)SigmaD6883-50MG
קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות Biotek
L-גלוטמיןSigmaG8540-25G
סטרפטומיציןGIBCO15140148
FBSGIBCO26140079
RPMI 1640GIBCO11875-085
avertinSigmaT48402-25G
אינסולין עכברוש/עכבר ערכת ELISAMilliporeEZRMI-13K
צנטריפוגהSorvalSorval RT7לצנטריפוגה צלחת 96 בארות
קורא MicroplateBiotekEpoch 2לקריאת פלואורסצנטיות

מקורות

  1. Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
  2. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
  3. Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538(2012).
  4. Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
  5. Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
  6. Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
  7. Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
  8. Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
  9. Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
  10. Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
  11. Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
  12. Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
  13. Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).
  15. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
  16. Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
  17. Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
  18. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד איים בלב অগניקיאסאיים בלב לבלב של עכברבדיקת זיהוי ROSהפרשת אינסולין מוּגברת גלוקוזסריקת כימיקלים סביבתייםעיכול באמצעות קולגנאזסריגון גרדיאנטהצבע הפלואורסצנטי DCFH-DAטיפול ב-N-Acetyl Cysteineשיטת תרבית איים
הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.