Method Article

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביו, איתות חשמלי אנדוגני מתווך על ידי תעלות יונים, משאבות ממוקם על קרום התא, משחק תפקידים חשובים באיתות תהליכים של תאים עצביים ושרירי טמפרמנט של תהליכים ביולוגיים רבים אחרים, כגון עובריים המתבנת התפתחותית. עם זאת, יש צורך ויוו פעילות חשמלית מהפיקוח מופרה חוליות. ההתקדמות של מקודדים גנטית פלורסנט מחוני מתח (GEVIs) הפכו אותה ניתן לספק פתרון עבור האתגר הזה. כאן, אנו נתאר כיצד ליצור דג מחוון הטרנסגניים מתח באמצעות מחוון ויצר מתח, ASAP1 (האצת חיישן של פוטנציאל פעולה 1), כדוגמה. ערכת Tol2, מקדם דג זברה בכל מקום, ubi, נבחרו במחקר זה. נסביר גם את התהליכים של שיבוט בייעודי לאתר שער Tol2 דג זברה מבוסס-transposon transgenesis, את תהליך ההדמיה בשלב מוקדם דגים עוברי ודגים גידולים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל. באמצעות קו דגים, מצאנו כי ישנם שינויים מתח חשמלי הסלולר במהלך דג זברה מופרה והתנועה זחל דגים. יתר על כן, זה היה ציין כי כמה דג זברה ממאיר במערכת העצבים ההיקפית נדן גידולים, הגידול התאים היו בדרך כלל מקוטב בהשוואה ל נורמלי הרקמות הסובבות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביו מתייחס אנדוגני איתות חשמלי מתווך על ידי תעלות יונים ומשאבות ממוקם על קרום התא1. חילופי יוניים על פני הממברנה התאית, והשינויים בשילוב חשמל פוטנציאלית ועדכניים, חיוניים עבור איתות תהליכים של טמפרמנט תאים עצביים ושרירי. בנוסף, ביו ומעברי יון יש מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים חשובים אחרים כולל אחסון אנרגיה, ביוסינטזה של המטבוליט תחבורה. איתות הביו-חשמליות התגלה גם כרגולטור של היווצרות תבנית עובריים, כגון צירים הגוף, מחזור התא, תא בידול1. לפיכך, חיוני להבנת מחלות מולדות אנושיים רבים הנובעים התקנה שגויה של סוג זה של איתות. למרות מלחציים תיקון כבר בשימוש נרחב עבור הקלטה תאים בודדים, הוא עדיין רחוק מלהיות אידיאלי בו זמנית פיקוח על תאים מרובים במהלך התפתחות עובריים בתוך vivo. יתר על כן, מולקולות קטנות רגיש מתח אינם גם אידיאלי עבור יישומים ויוו שלהם specificities, רגישויות וכתוצאה רעילות.

היצירה של מגוון רחב של גנטית מקודד מתח פלורסנט אינדיקטורים (GEVIs) מציע מנגנון חדש כדי להתגבר על בעיה זו, והיא מאפשרת יישום קל ללמוד התפתחות עובריים, למרות שהם נועדו במקור עבור ניטור עצבית תאים2,3. אחד GEVIs זמין כעת הוא האצת חיישן של פוטנציאל פעולה 1 (ASAP1)4. הוא מורכב ללולאה חוץ-תאי של תחום חישה מתח של מתח פוספטאז רגיש, חלבון פלואורסצנטי ירוק permuted באופן מעגלי. לכן, ASAP1 מאפשר הדמיה של שינויים סלולריים פוטנציאל חשמלי (קיטוב: ירוק בהיר; דפולריזציה: ירוק כהה). ASAP1 יש 2 מילי-שניות על לסירוגין קינטיקה, ולא ניתן לעקוב אחר שינוי פוטנציאליים subthreshold4. לכן, כלי גנטי זה מאפשר רמה חדשה של יעילות ניטור בזמן אמת הקינטיות בתאים חיים. הבנה נוספת של התפקידים של ביו בתחום הפיתוח עובריים למחלות רבות, כגון סרטן, שופכים אור חדש על המנגנון הבסיסי, אשר הוא קריטי עבור מחלת טיפול ומניעה.

דג זברה הוכחו במודל בעלי חיים רב עוצמה ללמוד ביולוגיה התפתחותית ו האדם מחלות כולל סרטן5,6. הם חולקים גנים orthologous 70% עם בני אדם, ויש להם ביולוגיה חוליות דומות7. דג זברה מספקים טיפול קל יחסית, בגודל גדול מצמד של ביצים, גנטיקה צייתן, transgenesis קל ופיתוח שקופים חיצוני עובריים, ההופכים אותם מערכת מעולה עבור ויוו הדמיה5,6. עם מקור גדול של דגים מוטנטים קווים כבר נוכח, גנום מלא ברצף, דג זברה תספק מגוון מוגבל יחסית של תגלית מדעית.

כדי לחקור את ויוו בזמן אמת הפעילות החשמלית של תאים, עלינו לנצל של דג זברה מודל המערכת ASAP1. בנייר זה, אנו מתארים כיצד לשלב את החיישן מתח פלורסנט ASAP1 הגנום דג זברה באמצעות Tol2 transposon transgenesis, ותנסו לדמיין את הפעילות החשמלית הסלולר במהלך התפתחות, תנועה זחל דגים, ובבתי גידול בשידור חי .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה מוחזקים במתקן בעל חיים שאושרו על-ידי AAALAC, כל הניסויים בוצעו לפי הפרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים פרדו שימוש הוועדה (PACUC).

1. Tol2 Transposon פלסמיד לבנות הכנה

הערה: Tol2, transposon שנתגלה בשנת medaka דגים, נרחב שימש ב8,9קהילת המחקר דג זברה. כבר בהצלחה לאמץ את שער ספציפי לאתר רקומבינציה מערכת מבוססת-שיבוט, המכונה ערכת Tol210. ערכת Tol2 מאפשר דרך נוחה יותר של יצירת ביטוי אישית בונה, בעת גם להגדיל את היעילות של transgenesis. לכן היה החלטה קלה כדי לנצל את היתרון של מערכת זו, וליצור בכל מקום ASAP1 ביטוי דג זברה קו באמצעות מקדם המאומת אוביקוויטין לנהוג ASAP111.

  1. יצירת מבנה התיכון כניסה ASAP1: pDONR221-ASAP1
    1. רוכשים הבונה חיישן ASAP1 מתח מקודדים גנטית, pcDNA3.1/פורו-חטיבתי-ASAP1 (פלסמיד #52519), מ- Addgene. כדי להגביר את האזור קידוד ASAP1, להגדיר PCR באמצעות את אישית תחל (attB1-ASAP1F ו- attB2-ASAP1R) תמר מוקף עם רצפים attB בקצה 5' של תחל (איור 1). Phusion DNA פולימראז נבחרתי שלה יעילות גבוהה, תנאי ה-PCR אופטימציה בהתבסס על פרוטוקול שפורסמו בעבר12.
    2. טען את המוצרים PCR µL 50 % 1 טה ג'ל באמצעות פיפטה רגיל עם טיפים µL 200, ולבצע אלקטרופורזה-160 V במיכל אופקי ג'ל למשך כ- 30 דקות.
    3. בדוק את הג'ל תחת transilluminator UV (353 nm), לסלק את הלהקה הרצוי באמצעות אזמל/להב תחת transilluminator UV שפורסמו בעבר13,14ו להכניס המכיל ג'ל לדנ microcentrifuge mL 1.5 נקי שפופרת.
    4. לבצע טיהור ג'ל עבור המוצרים ASAP1 PCR. לשחזר את ה-DNA הג'ל נכרת שימוש מסחרי DNA ג'ל ערכת טיהור בעקבות ההוראה של היצרן, elute את ה-DNA לתוך 20 µL של מים. קח 1 µL כמדגם, מודדים את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. זורמים ההוראות תוכנה באמצעות מים כמו בקרה הריק15.
    5. קח 100 ננוגרם של לטהר המוצר PCR ומערבבים אותו עם 150 ng של פלסמיד pDONR221 ב- 10 µL של טה מאגר (10 מ מ טריס, 1 מ מ EDTA pH 8.0)16. להוסיף 2 µL של BP Clonase השני לתוך התגובה, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    6. ביום השני, להוסיף 1 µL של proteinase K לתוך התגובה, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    7. לבצע טרנספורמציה. להעביר את התגובה ומערבבים אותו עם µL 50 של Top10 המוסמכת e. coli תאים, דגירה התאים על קרח למשך 30 דקות. אז, העברת הצינור התגובה לתוך אמבט מים 42 ° C עבור מינימלית 1 מיד להסיר את הצינור, דגירה על קרח למשך 2 דקות. בשלב הבא, לשים את הצינור לתוך מטרף 37 ° C, דגירה זה מאובטח.
    8. תוציאי את הצינור, צלחת התאים לצלחת kanamycin ליברות. בשלב הבא, דגירה את הצלחת בן לילה (16-18 h) ב 37 º C.
    9. לבחור אחת, מופרדים היטב מושבות, לחסן אותם לתוך צינורות תרבות תא 14 מ עם 3 מ ל LB בינוני. תרבות אותם בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר עם מהירות סיבוב של 250 סל"ד (סיבוב לדקה).
    10. לבצע miniprep באמצעות ערכת miniprep מסחרי בעקבות ידנית את ההוראה17.
    11. רצף פלסמידים 3-4 עם סנגר רצף לזהות pDONR221 חיובי-ASAP1 שיבוטים באמצעות תחל רצף M13F ו- M13R.
  2. יצירת הבונה Tol2 עבור microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
    1. לבחור שהרצף לאמת pDONR221-ASAP1 שיבוט ולמדוד את ריכוז הדנ א באמצעות קהל מעריצים ספקטרופוטומטרים ההוראה תוכנה באמצעות מים כפי ריק לשלוט15.
    2. קח 100 µg של pDONR221-ASAP1, ולערבב עם 100 µg של Tol2 ערכת 5-end פלסמיד (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg של p3E-תיקים עשויים (ערכת Tol2 #302) ו- 150 µg של pDestTol2pA2 (Tol2 ערכת #394). להתאים את הנפח הכולל כדי 8 µL באמצעות מאגר TE (10 מ מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) ב- microcentrifuge 1.5 מ ל צינור ומערבבים היטב על ידי מערבולת קצרה של s 2-5. לאחר מכן, להוסיף 2 µL LR Clonase השנייה פלוס, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    3. ביום השני, להוסיף 1 µL של proteinase K לתוך התגובה באמצעות פיפטה 10 µL, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. לבצע טרנספורמציה ולזהות שיבוטים חיובי כפי שתואר לעיל (צעדים 1.1.7-11).
    5. מדד ריכוז ה-DNA רצף לאמת שיבוט pDestTol2-ubi-ASAP1 (איור 1B) באמצעות ספקטרופוטומטרים15. בדרך כלל הריכוז הוא סביב 200ng/µL.

2. מכינים Tol2 Transposase mRNA והפתרון הזרקה

  1. רצף של e. coli גליצרול מלאי של פלסמיד pCS2FA-transposase (Tol2 ערכת #396) על צלחת ליברות (עם 100 אמפיצילין µg/mL) באמצעות לולאה חיסון מעוקר. דגירה בן לילה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. למחרת, לבחור שמושבה בודדת, לחסן אותו לתוך 3 מ"ל של ליברות (אמפיצילין µg 100/mL) באמצעות טיפ פיפטה של 10 µL מעוקר. תרבות זה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר עם מהירות סיבוב של 250 סל"ד.
  2. מבצע miniprep התרבות החיידק באמצעות ערכת miniprep מסחרי בעקבות ההדרכה שלה. Elute דנ א פלסמיד לתוך 30-50 µL טה מאגר על ידי צנטריפוגה דקה-14,000 סל ד, מודדים את ריכוז הדנ א שלה עם ספקטרופוטומטרים.
  3. Linearize µg 1-2 של פלסמיד עם לא אני endonuclease ולטהר ה-DNA עם ה-DNA בעקבות ההדרכה שלה אחרי לא ערכת ניקוי מערכת העיכול. Elute ה-DNA לתוך 5 µL של מים על ידי צריך שתוציאו ב 14,000 rpm במשך דקה אחת. ריכוז הצפוי הוא על 200-300 ng/µL.
  4. לבצע תמלול במבחנה עם לא אני לליניארית pCS2FA-transposase בתור תבנית ה-DNA באמצעות ערכת שעתוק SP6 מסחרי.
  5. לאחר סיום התגובה, לטהר transposase Tol2 mRNA באמצעות ניקוי RNA מסחרי קיט ההוראות של היצרן. לבסוף elute mRNA לתוך מים ללא RNAase µL 20, מודדים את ריכוז ה-RNA בספקטרופוטומטר. ריכוז הצפוי הוא על 1-3 µg / µL. דוגמאות שניתן לאחסן במקפיא-80 ° C במידת הצורך.
  6. להכין את הפתרון microinjection על ידי ערבוב 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-transposase ASAP1, Tol2 ה-mRNA (100 ng/µL) צינור microcentrifuge על ידי pipetting. כדי למנוע השפלה חומצת גרעין הנגרמת על ידי מפשיר חוזרות ונשנות, refreezing, aliquot µL 6 למחזור ואחסן אותו במקפיא-80 ° C לשימוש עתידי.

3. microinjection

  1. להגדיר 4-6 טנקים רבייה לפחות 2 זכרים ו 2 נקבות אחר הצהריים לפני ההזרקה. הדגים האלה לא חייבים להיות מוזן בשעות אחר הצהריים. שלב זה להפחית את כמות הפסולת דגים ולחסוך זמן כדי לנקות אותם בבוקר שלמחרת, תוך שהיא מסייעת גם לגרום לתגובה הרבייה.
  2. למחרת בבוקר, להסיר את הפתרון הזרקת מוכן (pDestTol2 -ubi-ASAP1 לבנות, Tol2 mRNA) מהמקפיא-80 ° C, ומניחים אותו על קרח.
  3. . עצור את המחיצות הדג גידול טנקים ולאפשר את הדגים להזדווג. באופן כללי, דג טהור מטיל ביצים בתוך 20-30 דקות לאחר הוצאת על המפריד. אם לא, להמתין עוד 1-2 שעות. דגים מסוימים יכולים לא להטיל ביצים בכלל. במקרה זה, חזור על הניסוי הזה לאוסף העובר דגים.
  4. תוך כדי המתנה, ודא כי קיימים המוכנים הקצה נשבר בזווית יצירת קצה שקוע עם מלקחיים, או על ידי שבירת על מגב המשימה העדינה מחטים.
    1. . תמשכי מחטים נימי זכוכית פולר micropipette באמצעות הפרמטרים הבאים: חום 545; משוך 60; מהירות 80; זמן 250; הלחץ 500. תשבור את המחט עם מלקחיים מתחת טווח לנתיחה (עם העין-קטע סרגל עבור הערכה קוטר) על-ידי החזקת המלקחיים על זווית כ 45 °. מחט הרצוי קטרים יכולים להיות משתנה בהתאם להגדרות microinjector, אבל קוטר קטן הוא מועדף להפחתת תמותת העובר.
  5. ברגע הדג יש הטילו ביצים, לאסוף אותם ב 10-ס מ קוטר צלחת פטרי ולהביא אותם על הטווח לנתיחה. הסר כל העוברים לא נורמלי, דגים פסולת.
  6. Pipet העוברים מופרית לתוך הזריקה מוכנה 3% agarose עובש. הסרת עודפי מים כדי לשמור על העוברים במקום.
  7. ברגע כל השורות מלאים עם עוברים קיימא, לסדר אותם כך כל התאים פונים לאותו הכיוון לעבר המחט, וזה בערך בזווית של 45° אופקית. פעולה זו תגרום הזרקת קל יותר מאוחר יותר.
  8. כשאתה לובש כפפות, להשתמש pipet 20 µL הטעינה עצה 5 µL של הבונה מוכן ולהסיר הצינורית על קרח.
  9. הכנס בקפידה את הטיפ בקצה האחורי של צינור קפילרי שבור כל הדרך עד איפה זה מתחיל כדי מוזג הברים, גם לקבל הכימית קרוב הטיפ. אם יש עדיין בועות אוויר, לנער את המחט, מקפיד לא לשבור את הטיפ.
  10. את המחט ישר לתוך למחזיק המחט microinjection והדק בזהירות עד המחט נשאר במקום. להתאים את הזווית כדי בערך 45°.
  11. ברגע המחט הוא מוכן, מצורף, הפעל למיכל לחץ מיקרוסקופ וגז. מסחרית CO2 טנקים טובים בדרך כלל למטרה זו. האחסון ההזרקה מותאם על ידי הלחץ החזקה, הוצאה: משוער psi 0.5 להחזקת ו- 30 psi לניתוק. הקפד לבדוק כי הפתרון יוצא בעת לחיצה על הדוושה.
  12. באמצעות מיקרומטר על הבמה עם טיפה של שמן מינרלי, להתאים את עוצמת הקול ואת הזרימה של הפתרון מיקרומטר ~ 150 קוטר (על 2 nL). ודא כי הלחץ גב יאפשר כמות קטנה לטפטף החוצה של המחט. אם אין לחץ מספיק אחורי, נימיות תגרום נוזל מזין את המחט ולהשמיד את ה-mRNA.
  13. ברגע שהמחט מכויל, מתחילים הזרקת הבונה לתוך התא הבודד של העוברים מופרית.
    הערה: פעולה זו מעבירה כמות גדולה של תרגול, סבלנות, עידון, עקב קרום התא קשה לחדור. חשוב להחדיר את הפתרון לתוך התא, לא החלמון, ליצירת דג זברה מהונדס. זה שונה מורפולינו הזרקה. זה לא משנה באיזה צד המחט חודרים לתא ככל הבונה נכנס לתא. Transgenesis יהיה שיעור נמוך מאוד של הצלחה אם מוזרק לתוך החלמון במקום התא. הזרקת תא בודד שלב חשוב גם, או דגים כמירה סומאטית ייווצר. פעולה זו תקטין את הסיכוי transgene נכנס אל תאי הנבט.
  14. השתמש הקצה של החריץ ג'ל כדי לספק גיבוי כל הזמן העובר במקום ומאפשרת את המחט להפעיל לחץ מבלי להזיז את העובר. לאחר קצה המחט בתא בודד, לחץ על דוושת לשחרר את הכמות הרצויה של פתרון. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים.
  15. לאחר השלמת, העברת העוברים מוזרק לתוך תבשיל שכותרתו בהדחה מתוך החריץ agarose עם מערכת מים, פיפטה העברה של mL 3.4 חד פעמיות. אחסן את העוברים חממה 28.5 ° C כדי לתת להם לפתח. בדוק שוב במהלך היום הסרת עוברי דגים מתים ולהחליף מים עם 0.1% מתילן כחול במים דגים.
  16. כ- 6-8 שעות לאחר ההזרקה, קח 10 הפרט מוזרק דגים עוברי והכן DNA גנומי אותם באמצעות שיטה קטלנית18.
  17. למחרת בבוקר, להשתמש במיקרוסקופ לנתיחה עם מקור אור זריחה למיין את העוברים מציג GFP ברקמות שאינן-חלמון. אלה העוברים דגים צריך להכיל הבונה מוזרק.
  18. לבצע Tol2 assay בלו כדי לבדוק את פעילות transposon כפי שתואר לעיל19. אם נכרת פלסמיד יכול להתגלות, לשמור את מוזרק דגים עוברי ולגדל אותם. אם אין פלסמיד נכרת יכול להתגלות, חזור על סינתזת Tol2 mRNA את תהליך microinjection עד להשגת התוצאות החיוביות של Tol2 בלו וזמינותו.

4. הקמת ASAP1 הטרנסגניים דגים, Tg (ubi: ASAP1)

  1. מגדל את הדגים מוזרק (F0 הדור) לבגרות כמתואר קודם לכן הספר של דג זברה20. זה בדרך כלל לוקח כ 4 חודשים.
  2. קח יחיד של מבוגרים F0 דגים, לחצות אותו יחיד מול מין wildtype דגים. לאסוף דגים העוברים לאחר הרבייה בהמשך היום. שמור העוברים דגים שנאספו בחממה 28.5 ° C דגים מים עם 0.1% מתילן כחול.
  3. ביום השלישי, לבדוק את העוברים דגים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה פלורסנט עם מסנן ה-GFP. למיין את עוברי דגים ירוק, אם יש כאלה, ולגדל אותם לבגרות כמו F1 ייצור הטרנסגניים דג, Tg (ubi: ASAP1).
    הערה: יחס Mendelian לא צפויה שכן רוב הדגים0 F הורים כימרות גנטית בחיידקים-קו.
  4. צלב למבוגרים-דג יחיד של F1 , עם דגים wildtype ולאסוף עוברי דגים. למיין את עוברי דגים ירוק ולגדל אותם לבגרות כמו דג דור2 F.
    הערה: עוברי דגים-ירוק וירוק צריך להיות קרוב ל- 1:1 אם יש transgene יחיד.
  5. כדי להציג שינויים פוטנציאל חשמלי בגידול כמו גידולים ממאירים במערכת העצבים ההיקפית נדן (MPNST), לחצות את הדור2 F Tg (ubi: ASAP1) דגים עם rpl35hi258/wt דגים. זה ידוע כי גלוי גידולים להתחיל למצוא בן 6-8 חודש מבוגרים21,22.

5. הדמיה

  1. תמונת דג זברה עוברי, לקחת מספר F2 הדור המייסד דגים, חוצים אותם עם דגים wildtype בזוגות בודדים. לאסוף דגים עוברי בשלבים התפתחותיים שונים הרצוי בהתאם דג זברה היערכות מדריך23.
  2. בשלבים המוקדמים של עוברי דגים, לקלף, להסיר chorions של העוברים בזהירות באמצעות זוג מלקחיים תחת טווח לנתיחה ב 10-ס מ קוטר צלחת פטרי עם דגים מערכת מים.
  3. העברת כמה עוברי דגים על זכוכית והקעורות עם 3% methylcellulose באמצעות פיפטה העברה חד פעמיות של 3.4 מ. התאם את העוברים למיקום הרצוי כדי להציג את הפעילות GFP הסלולר באמצעות מחט מתחת טווח לנתיחה פלורסנט.
  4. לשלבים נע של עוברי דגים (שגילן עולה על הבמה somite 12), להשתמש מסילייט tricaine 0.05% כדי עזים ומתנגד העוברים דגים לפני העברת שקופיות. בקצרה, עוברי דגים היו צמחו לתוך מסילייט tricaine 0.05% במים דגים עד שהפסיקו שחייה ואיזון הגוף אובדן. בנוסף, להוסיף טיפה של 0.05% מסילייט tricaine עם methylcellulose בשקופית.
  5. עבור פחות מ-12 somite שלב עוברי דגים, להשתמש במיקרוסקופ מתחם epi-זריחה עם המצלמה תואם, תוכנה עבור הדמיה. שגילן עולה על 12 somite הבמה דגים עוברי, להשתמש במיקרוסקופ לנתיחה קרינה פלואורסצנטית.
  6. תמונה מתח התא הגידול, תחילה לזהות את הדג עם גידולים MPNST. לאחר מכן, עזים ומתנגד הדג עם מסילייט tricaine 0.05%. עבור הדמיה הר שלמה, מכניסים את הדגים 10-ס מ קוטר צלחת פטרי. כדי להציג את הפעילות החשמלית של תאי הגידול, ייתכן ניסויים דגים גידולים החוצה לאחר כל הר הדמיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזריקה מוצלחת, יותר מ 50% מוזרק דגים עוברי יציג מידה מסוימת של זריחה ירוק בתאים סומטיים ולא רובם יהיה חיובי על-ידי Tol2 transposon בלו assay (איור 2). אחרי 2-4 דורות של יותר לחצות עם דגים wildtype (עד הדג פלורסנט מגיעים 50%, היחס Mendelian הצפוי), הדג הטרנסגניים שימשו הניסוי הדמיה כדי לעקוב אחר פוטנציאל קרום התא במהלך התפתחות עובריים. ראשית, שינויי פוטנציאל ממברנה נבחנו במהלך מחזור התא בשלבים התפתחותיים עובריים מוקדם דג זברה. זה היה ציין כי התאים hyperpolariz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות הפעילות חשמל רמת הסלולר ורקמות במהלך התפתחות מחלות אנושיות התגלו לפני זמן רב, אין ויוו חשמל השינויים הדינמיים ותפקידיהם ביולוגי נותרו עדיין אינו מודע לקיומם. אחד האתגרים הגדולים הוא להמחיש ולכמת את השינויים חשמל. תיקון קלאמפ טכנולוגיה פריצת דרך עבור מעקב אחר תאים בודדים, אך את תחולת העוברים בעלי. החוליות מוגבל כי הם מורכבים של תאים רבים. צבעים מתח כימי הנוכחי הם גם לא אידיאלי שלהם רגישויות, specificities וכתוצאה רעילות. מאמצי על ההמצאה של GEVIs מספקים לנו נתיב חדש להמחיש פעילות חשמלית הסלולר ויוו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודות המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R35GM124913 PI4D מאוניברסיטת Purdue תמריץ התוכנית, PVM פנימי תחרותי תוכנית קרנות מחקר בסיסי. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של הסוכנים מימון. אנו מודים קואיצ'י Kawakami על Tol2 הבונה, מייקל לין עבור הבונה ASAP1, ולבנות לאונרד Zon ייצוג המקדם ubi דרך Addgene.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות תרבית תאים 14 מ"לVWR60818-725תרבית E.Coli
מיכל אלקטרופורזה של אגרוזינשוף תרמו מדעיB2DNA eletrophoresis
Agarose RAAmrescoN605-500Gלהכנת ג'לי ההזרקה
Attb1-ASAP1-F פריימרIDT DNAGGGGACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		ASAP1 קידוד אזור הגברה לתת-שיבוט
Attb2-ASAP1-R פריימרIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCTC
AAGTTGTTTTTCTCTGTGAAGCCA		ASAP1 קידוד אזור הגברה לתת-שיבוט
היקף דיסקציה שדה בהירNikonSMZ 745Dechorionation, מיקרו-הזרקה, הרכבה
מצלמה צבעוניתZeissAxioCam MRcעובר דגים הקלטת תמונה
שקופית קעורהVWR48336-001להחזקת עוברי דגים במהלך תהליך הדמיה
פיפטת העברה חד פעמית 3.4 מ"לThermo Scientific13-711-9AMעוברי דגים והעברת מים
אנזים אנדונוקלאז, לא INEBR0189Lליניאריזציה של DNA פלסמיד
היקף תרכובת אפיפואורסנטZeissAxio Imager.A2דגים הדמיית עוברים
היקף דיסקציה סטריאו אפיפורסנטZeissStereo Discovery.V12הדמיית עוברי דגים
מקור אור פלואורסצנטידינמיקת לומןX-cite seris 120מקור אור למיקרוסקופים פלואורסצנטיים
מלקחיים #5WPI500342Dechorionation ושבירת מחט
Gateway BP Clonase II תערובת אנזיםThermo Scientific11789020שיבוט רקומבינציה של Gateway
BP Gateway LR Clonase II Plus אנזיםThermo Scientific12538120Gateway LR שיבוט רקומבינציה
ג'ל ערכת שחזור DNAZymo ResearchD4002טיהור ג'ל DNA
קצה טעינהEppendorf930001007להעמסת תמיסת הזרקה למחטי קפילרי
מתיל צלולוז (1600cPs)אלפא Aesar43146הרכבה של עובר דגים
מתילן כחולסיגמא-אולדריץ'M9140מדכא התפרצויות פטרייתיות בצלחות פטרי
עובש מיקרו-הזרקהכלי מדע אדפטיביTU-1להכנת מגש תבנית אגורה להחזקת עוברי דגים במהלך ההזרקה
מיקרו-מזרקWPIPneumatic Picopump PV820מזרק מיקרו-הזרקה
מיקרו-מניפולטורWPIמיקרו-מזרק MM3301Rפעולת מיקרו-הזרקה
חולץ מיקרופיפטהמכשיר סאטרP-1000להכנת מחט נימית
שמן מינרליאמרסקוJ217-500 מ"ללכיול נפח הזרקה
mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלולThermo ScientificAM1340mRNA תמלול במבחנה
מצלמת מונוקולורZeissAxioCam MRmהקלטת תמונת עובר דגים
ערכת מיני-הכנה של פלסמידZymo ResearchD4020הכן כמות קטנה של פלסמיד DNA
צלחות פטרי מפלסטיקVWR25384-088להחזקת דגים או עוברי דגים במהלך תהליך ההדמיה
RNA Clean & רכז-5Zymo ResearchR1015ניקוי mRNA לאחר שעתוק במבחנה
ספקטרופוטומטרThermo ScientificNanoDrop 2000למדידת ריכוזי DNA ו-RNA
שלב מיקרומטרAm ScopeMR100כיול נפח מיקרו-הזרקה
ThermocyclerBio-RadT100הגברת DNA לשיבוט גנים
דופן דקה נימי זכוכיתWPITW100F-4זכוכית גולמית להכנת מחט קפילרית
פריימר Tol2-exL1 IDTDNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 בדיקת בלו
פריימר Tol2-exR IDTDNAACCCTCACTAAAGGAACAAAAGTol2 בדיקת בלו TOP10
מוכשר כימית E. coliThermo ScientificC404006משמש לטרנספורמציה במהלך שיבוט גנים
טריקאין מסילאטסיגמא-אולדריץ'A5040להרדמת דגים או עוברי דגים
טרנס-תאורה UV 302nmUVPM-20Vהדמיית DNA
אמבט מיםThermo Scientific2853לתהליך טרנספורמציה של שיבוט גנים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles