Method Article

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביו, איתות חשמלי אנדוגני מתווך על ידי תעלות יונים, משאבות ממוקם על קרום התא, משחק תפקידים חשובים באיתות תהליכים של תאים עצביים ושרירי טמפרמנט של תהליכים ביולוגיים רבים אחרים, כגון עובריים המתבנת התפתחותית. עם זאת, יש צורך ויוו פעילות חשמלית מהפיקוח מופרה חוליות. ההתקדמות של מקודדים גנטית פלורסנט מחוני מתח (GEVIs) הפכו אותה ניתן לספק פתרון עבור האתגר הזה. כאן, אנו נתאר כיצד ליצור דג מחוון הטרנסגניים מתח באמצעות מחוון ויצר מתח, ASAP1 (האצת חיישן של פוטנציאל פעולה 1), כדוגמה. ערכת Tol2, מקדם דג זברה בכל מקום, ubi, נבחרו במחקר זה. נסביר גם את התהליכים של שיבוט בייעודי לאתר שער Tol2 דג זברה מבוסס-transposon transgenesis, את תהליך ההדמיה בשלב מוקדם דגים עוברי ודגים גידולים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל. באמצעות קו דגים, מצאנו כי ישנם שינויים מתח חשמלי הסלולר במהלך דג זברה מופרה והתנועה זחל דגים. יתר על כן, זה היה ציין כי כמה דג זברה ממאיר במערכת העצבים ההיקפית נדן גידולים, הגידול התאים היו בדרך כלל מקוטב בהשוואה ל נורמלי הרקמות הסובבות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביו מתייחס אנדוגני איתות חשמלי מתווך על ידי תעלות יונים ומשאבות ממוקם על קרום התא1. חילופי יוניים על פני הממברנה התאית, והשינויים בשילוב חשמל פוטנציאלית ועדכניים, חיוניים עבור איתות תהליכים של טמפרמנט תאים עצביים ושרירי. בנוסף, ביו ומעברי יון יש מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים חשובים אחרים כולל אחסון אנרגיה, ביוסינטזה של המטבוליט תחבורה. איתות הביו-חשמליות התגלה גם כרגולטור של היווצרות תבנית עובריים, כגון צירים הגוף, מחזור התא, תא בידול1. לפיכך, חיוני להבנת מחלות מולדות אנושיים רבים הנובעים התקנה שגויה של סוג זה של איתות. למרות מלחציים תיקון כבר בשימוש נרחב עבור הקלטה תאים בודדים, הוא עדיין רחוק מלהיות אידיאלי בו זמנית פי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה מוחזקים במתקן בעל חיים שאושרו על-ידי AAALAC, כל הניסויים בוצעו לפי הפרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים פרדו שימוש הוועדה (PACUC).

1. Tol2 Transposon פלסמיד לבנות הכנה

הערה: Tol2, transposon שנתגלה בשנת medaka דגים, נרחב שימש ב8,9קהילת המחקר דג זברה. כבר בהצלחה לאמץ את שער ספציפי לאתר רקומבינציה מערכת מבוססת-שיבוט, המכונה ערכת Tol210. ערכת Tol2 מאפשר דרך נוחה יותר של יצירת ביטוי אישית בונה, בעת גם להגדיל את היעילות של transgenesis. לכן היה החלטה קלה כדי לנצל את היתרון של מערכת זו, וליצור בכל מקום ASAP1 ביטוי דג זברה קו בא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזריקה מוצלחת, יותר מ 50% מוזרק דגים עוברי יציג מידה מסוימת של זריחה ירוק בתאים סומטיים ולא רובם יהיה חיובי על-ידי Tol2 transposon בלו assay (איור 2). אחרי 2-4 דורות של יותר לחצות עם דגים wildtype (עד הדג פלורסנט מגיעים 50%, היחס Mendelian הצפוי), הדג הטרנסגניים שימשו הניסוי הדמיה כדי לעקוב אחר פוטנציאל קרום התא במהלך התפתחות עובריים. ראשית, שינויי פוטנציאל ממברנה נבחנו במהלך מחזור התא בשלבים התפתחותיים עובריים מוקדם דג זברה. זה היה ציין כי התאים hyperpolariz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות הפעילות חשמל רמת הסלולר ורקמות במהלך התפתחות מחלות אנושיות התגלו לפני זמן רב, אין ויוו חשמל השינויים הדינמיים ותפקידיהם ביולוגי נותרו עדיין אינו מודע לקיומם. אחד האתגרים הגדולים הוא להמחיש ולכמת את השינויים חשמל. תיקון קלאמפ טכנולוגיה פריצת דרך עבור מעקב אחר תאים בודדים, אך את תחולת העוברים בעלי. החוליות מוגבל כי הם מורכבים של תאים רבים. צבעים מתח כימי הנוכחי הם גם לא אידיאלי שלהם רגישויות, specificities וכתוצאה רעילות. מאמצי על ההמצאה של GEVIs מספקים לנו נתיב חדש להמחיש פעילות חשמלית הסלולר ויוו .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודות המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R35GM124913 PI4D מאוניברסיטת Purdue תמריץ התוכנית, PVM פנימי תחרותי תוכנית קרנות מחקר בסיסי. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של הסוכנים מימון. אנו מודים קואיצ'י Kawakami על Tol2 הבונה, מייקל לין עבור הבונה ASAP1, ולבנות לאונרד Zon ייצוג המקדם ubi דרך Addgene.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות תרבית תאים 14 מ"לVWR60818-725תרבית E.Coli
מיכל אלקטרופורזה של אגרוזינשוף תרמו מדעיB2DNA eletrophoresis
Agarose RAAmrescoN605-500Gלהכנת ג'לי ההזרקה
Attb1-ASAP1-F פריימרIDT DNAGGGGACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		ASAP1 קידוד אזור הגברה לתת-שיבוט
Attb2-ASAP1-R פריימרIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCTC
AAGTTGTTTTTCTCTGTGAAGCCA		ASAP1 קידוד אזור הגברה לתת-שיבוט
היקף דיסקציה שדה בהירNikonSMZ 745Dechorionation, מיקרו-הזרקה, הרכבה
מצלמה צבעוניתZeissAxioCam MRcעובר דגים הקלטת תמונה
שקופית קעורהVWR48336-001להחזקת עוברי דגים במהלך תהליך הדמיה
פיפטת העברה חד פעמית 3.4 מ"לThermo Scientific13-711-9AMעוברי דגים והעברת מים
אנזים אנדונוקלאז, לא INEBR0189Lליניאריזציה של DNA פלסמיד
היקף תרכובת אפיפואורסנטZeissAxio Imager.A2דגים הדמיית עוברים
היקף דיסקציה סטריאו אפיפורסנטZeissStereo Discovery.V12הדמיית עוברי דגים
מקור אור פלואורסצנטידינמיקת לומןX-cite seris 120מקור אור למיקרוסקופים פלואורסצנטיים
מלקחיים #5WPI500342Dechorionation ושבירת מחט
Gateway BP Clonase II תערובת אנזיםThermo Scientific11789020שיבוט רקומבינציה של Gateway
BP Gateway LR Clonase II Plus אנזיםThermo Scientific12538120Gateway LR שיבוט רקומבינציה
ג'ל ערכת שחזור DNAZymo ResearchD4002טיהור ג'ל DNA
קצה טעינהEppendorf930001007להעמסת תמיסת הזרקה למחטי קפילרי
מתיל צלולוז (1600cPs)אלפא Aesar43146הרכבה של עובר דגים
מתילן כחולסיגמא-אולדריץ'M9140מדכא התפרצויות פטרייתיות בצלחות פטרי
עובש מיקרו-הזרקהכלי מדע אדפטיביTU-1להכנת מגש תבנית אגורה להחזקת עוברי דגים במהלך ההזרקה
מיקרו-מזרקWPIPneumatic Picopump PV820מזרק מיקרו-הזרקה
מיקרו-מניפולטורWPIמיקרו-מזרק MM3301Rפעולת מיקרו-הזרקה
חולץ מיקרופיפטהמכשיר סאטרP-1000להכנת מחט נימית
שמן מינרליאמרסקוJ217-500 מ"ללכיול נפח הזרקה
mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלולThermo ScientificAM1340mRNA תמלול במבחנה
מצלמת מונוקולורZeissAxioCam MRmהקלטת תמונת עובר דגים
ערכת מיני-הכנה של פלסמידZymo ResearchD4020הכן כמות קטנה של פלסמיד DNA
צלחות פטרי מפלסטיקVWR25384-088להחזקת דגים או עוברי דגים במהלך תהליך ההדמיה
RNA Clean & רכז-5Zymo ResearchR1015ניקוי mRNA לאחר שעתוק במבחנה
ספקטרופוטומטרThermo ScientificNanoDrop 2000למדידת ריכוזי DNA ו-RNA
שלב מיקרומטרAm ScopeMR100כיול נפח מיקרו-הזרקה
ThermocyclerBio-RadT100הגברת DNA לשיבוט גנים
דופן דקה נימי זכוכיתWPITW100F-4זכוכית גולמית להכנת מחט קפילרית
פריימר Tol2-exL1 IDTDNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTol2 בדיקת בלו
פריימר Tol2-exR IDTDNAACCCTCACTAAAGGAACAAAAGTol2 בדיקת בלו TOP10
מוכשר כימית E. coliThermo ScientificC404006משמש לטרנספורמציה במהלך שיבוט גנים
טריקאין מסילאטסיגמא-אולדריץ'A5040להרדמת דגים או עוברי דגים
טרנס-תאורה UV 302nmUVPM-20Vהדמיית DNA
אמבט מיםThermo Scientific2853לתהליך טרנספורמציה של שיבוט גנים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles