פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

Summary

פרוטוקול מוצג עבור חילוץ מטבוליטים, חלבונים ושומנים דגימת אדמה אחד בו זמנית, המאפשר דגימת מופחתת הכנה פעמים ולאפשר מולטי-omic ניתוחים ספקטרומטר מסה של דגימות עם כמויות מוגבלות.

Abstract

ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס metaproteomic משולב, metabolomic ו- lipidomic (multi-omic) מחקרים משנים צורה של היכולת שלנו להבין ולאפיין קהילות חיידקים במערכות ביולוגיות וסביבתיות. מדידות אלה אפילו אתם מאפשרים ניתוח משופרת הקהילות מיקרוביאלית בקרקע מורכבים, אשר הם הכי מערכות מורכבות מיקרוביאלי ידוע עד כה. ניתוח רב-omic, אולם בעל מדגם הכנה אתגרים, מאז נפרד עקירות נדרשים בדרך כלל עבור כל מחקר omic, במיתון מגביר את זמן הכנה ואת משך דגימת נדרש. כדי לטפל מגבלה זו, שיטה 3 ב- 1 על החילוץ סימולטני של מטבוליטים, חלבונים ושומנים (MPLEx) מן הקרקע באותה דגימת זרע נוצר על ידי התאמת בגישה ממס מבוסס. פרוטוקול זה MPLEx הוכיחה להיות פשוטה וגם חזקים עבור סוגי דגימה רבים, גם כאשר מנוצל עבור כמויות מוגבלות של דגימות. אדמה מורכבים. שיטת MPLEx זמין במידה רבה גם את המידות מהירה multi-omic הדרושים כדי להשיג הבנה טובה יותר של חברי כל הקהילה מיקרוביאלי, תוך הערכת את השינויים המתרחשים בעת לפליטת ביולוגי וסביבתי.

Introduction

הערכת קהילות מיקרוביאלית בקרקע יש השלכות חשובות להבנת שינוי האקלים ורכיבה פחמן. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו אולם קשיים, כגון חוסר הגנום ברצף עבור microbiota בסוגים שונים של אדמה והפונקציה לא ידוע של החלבונים זוהה רבים. כתוצאה אתגרים בשל קרקע להיות הקהילה מיקרוביאלי המורכבים ביותר הידוע עד כה^1,2,3. ניתוח רב-omic, המשלבים נובע metagenomic ', ' metatranscriptomic ', ' metaproteomic ', metabolomic, lipidomic מחקרים, יושמו לאחרונה במחקרים קרקע רבים כדי להשיג הבנה טובה יותר לתוך החיידקים ההווה, תוך קבלת מידע מקיף אודות השינויים המולקולריים המתרחשים בשל הסביבה לפליטת^....

Protocol

הערה: קרקעות גשום מאוד יכול להיות lyophilized לפני מיצוי ללא לרעת ליעילותה של החילוץ. קרקע רטובה יכול לשמש גם, אבל יש לקחת בחשבון בעת הוספת ריאגנטים ספציפיים יחסי.

הערה: מומלץ להשתמש 20 גרם של משקל באדמה יבשה לכל החילוץ, אשר חייבים להתפצל בין 50 מ ל שני צינורות (מקסימום של 10 גרם אדמה למחזור 50 מ ל). עקירות וניתן לשנותם למעלה או למטה תלוי מדגם זמינים.

הערה: דגימות. אדמה יבשה יכול להיות sieved דרך מסך 3 מ מ על מנת homogenize ולהסיר את השורשים קטנים וסלעים. לא ניפוי דגימות קרקע רטובה, כמו לדוגמה יוקפא במסך.

1. אדמה פירוק תאים, הפקת מטבוליטים, חלבונים ושומנים (תזמון d ~ 1)

1. לכל 2....

Results

כאשר פרוטוקול MPLEx שימש כדי לחלץ מולקולות של קנזס ערבה יליד האדמה (קרקע Mollisol), הבדיקות triplicate מספק תוצאות עבור 3376 פפטידים, ליפידים 105 ו 102 קוטבי מטבוליטים (כל המזהים הייחודיים). בזמן פרוטוקול MPLEx הייתה ומבוססת לחילוץ כללי של ליפידים, מטבוליטים^{12,13,14,15,16,17,}

Discussion

חשוב לציין כי לא כל המעבדות יהיו זמינות ציוד אז שיטות מסוימות, לדוגמה השלב פירוק, ניתן להתאים. כאן אנו משתמשים vortexing sonicating, אולם השימוש מכה חרוז גדול 50 מ ל יעבוד. אם איזה שהוא לופילייזר עם טמפרטורת אספן מסוגל-105 מעלות צלזיוס אינה זמינה, יכולים להיות מיובש דגימות תחת זרם חנקן. גם סוגי אדמה להשתנות במידה רבה, באפשרותך לכלול חול סחופת, קליי, כבול, חמרה (וכדומה), הם גם יכול להשתנות בהתאם pH, מליחות, העושר חומר אורגני. כל אחד סטיות אלה יכולים להשפיע על הפרוטוקול, ולכן חשוב להיות גמיש וכדי לבצע התאמות בעת ה.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
כלורופורם	סיגמא-אולדריץ	' 650498	מאוחסן בטמפרטורה של -20° C ! אזהרה: לכלורופורם יש השפעות בריאותיות פוטנציאליות חריפות , גירוי בעור וכוויות כימיות אפשריות, גירוי במערכת הנשימה, עלול להשפיע על הכליות, הכבד והלב. הרכיבו משקפי מגן מתאימים, בגדים וכפפות, עבדו במכסה אדים.
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	34860	מאוחסן ב-20° C ! אזהרה: מתנול עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה, בעור ובעיניים, עלול לפגוע בעצבים, בכליות ובכבד. הרכיבו משקפי מגן מתאימים, בגדים וכפפות, עבדו במכסה אדים.
מים מטוהרים ממערכת	טיהור המים	Milli-Q
נתרן דודציל סולפט	Sigma-Aldrich	L6026	! זהירות: SDS גורם לרעילות חריפה והוא דליק. זה מגרה את העור, העיניים ודרכי הנשימה. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות.
ערכת מיצוי חלבון קרקע	MoBio, ערכת מיצוי חלבון קרקע NoviPure, Qiagen	30000-20
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
חומצה טריכלורואצטית	Sigma-Aldrich	T0699	! אזהרה: TCA הוא קאוסטי, רעיל ועלול לגרום לכוויות בעור. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות.
אצטון	סיגמא-אולדריץ		650501 מאוחסן בטמפרטורה של -20° C ! אזהרה: אצטון עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה ובעור ובעיניים. נוזל דליק ואדים. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
אוריאה	סיגמא-אולדריץ'	208884	! זהירות אוריאה מגרה את העיניים והעור, השתמש בכפפות ומשקפי בטיחות
אמוניום ביקרבונט	Fluka	09830
Trypsin	Promega	V528A	20µ g בקבוקונים
ערכת בדיקת חלבון חומצה ביסינצ'ונינית	פירס	23227
אמוניום פורמט	סיגמא-אולדריץ'	09735
אצטוניטריל	סיגמא-אולדריץ'	34998	! אזהרה: אצטוניטריל הוא גורם לגירוי בעור ובעיניים. דליק מאוד. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות. עבוד במכסה אדים.
חומצה טריפלואורואצטית	סיגמא-אולדריץ'	T6508	! זהירות TFA מסוכן ביותר במקרה של מגע בעור, קשר עין, בליעה ושאיפה. עלול לגרום לנזק לרקמות במיוחד בריריות העיניים, הפה ודרכי הנשימה. מגע עם העור עלול לגרום לכוויות. ללבוש כפפות, מעיל מעבדה, משקפי בטיחות ולעבוד במכסה אדים.
מתוקסיאמין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	226904	! אזהרה: מתוקסיאמין הידרוכלוריד גורם לכוויות קשות ולנזק חמור לעיניים, עלול לגרום לרגישות במגע עם העור. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
פירידין	סיגמא-אולדריץ'	270970	! אזהרה: פירידין עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים, לדיכוי של מערכת העצבים המרכזית. אדים עלולים לגרום לשריפת הבזק. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
N-מתיל-N-(טרימתילסיליל)טריפלואורואצטמיד עם 1% טרימתילכלורוסילן	סיגמא-אולדריץ'	69478	! זהירות MSTFA + 1% TMCS עלול לגרום לקורוזיה בעור, נזק חמור לעיניים ורעילות ספציפית של איברי מטרה. נוזל דליק ואדים. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
אשלגן כלורי	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q מערכת טיהור מים	Millipore		דגם MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
סוניקטור בדיקה	FisherBrand		דגם FB505
צנטריפוגה מקוררת	Eppendorf		דגם 5810R
צינור 50 מ"ל רוטור דלי מתנדנד	Eppendorf	A-4-44
50 מ"ל רוטור זווית קבועה	Eppendorf	FA-45-6-30
איזון	OHAUS		דגם V22PWE150IT
בקר פיפטה סרולוגי	Eppendorf	12-654-100
10 מ"ל, 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות מזכוכית	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer עם Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 מ"מ תערובת חרוזי נירוסטה	NextAdvance	SSB14B
0.15 מ"מ חרוזי נופך	MoBio	13122-500
צלחת ערבוב מגנטית	FisherBrand	11-100-16SH
מוט ערבוב מגנטי	FisherBrand	14512130
רצועות נייר pH, pH טווח 0– 14	FisherBrand	M95903
15 מ"ל, 50 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי	Genesee Scientific	21-103 21-108	כלורופורם תואם
50 מ"ל מערבולת מצורף	MoBio	13000-V1-50
דלי קרח	FisherBrand	02-591-44
בקבוקוני זכוכית 27.25x70 מ"מ	FisherBrand	03-339-22K
לנשום ממברנות צלחת קלות יותר	Midwest Scientific	BERM-2000
מגבוני אלכוהול	מגוון ביוטק	BPWP-1000
חממת שייקר חימום	מדד, Incu-Shaker מיני
מסובב צינור רוטיסרי אנלוגי	SoCal BioMed, LLC	82422001
ערכת הכנת דגימה בעזרת מסנן	FASP; Expedeon	44250
קורא מיקרופלייט	Biotek, EPOCH-20
מעלות צלזיוס מקפיא	פישר	13986149-80
מעלות צלזיוס מקפיא	סטירלינג אולטרה-קר	SU78OUE
Q-Exactive מלכודת יונים ספקטרומטר מסה	Thermo Scientific
Agilent 7890A כרומטוגרף גז יחד עם מרובע יחיד ספקטרומטר מסה 5975C	Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC מערכת	Millford, MA
250 מ"ל בקבוק מדיה	FisherBrand	1395-250
בקבוקון מים		186002805
זכוכית MS בקבוקון דגימה ומוסיף	MicroSolv	9502S-WCV, 9502S-02ND
זכוכית בקבוקון HPLC וכובעי הצמד	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96 בארות	צלחת Agilent	5042-6454
בקבוקון זכוכית גדול 27.25x70 מ"מ	FisherBrand	03-339-22K
Lyophilizer	Labconco	7934021
מרית ראש שטוח מנירוסטה מלוטשת	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
מגבוני קים	קימברלי-קלארק	34721
XBridge C18, 250x4.6 מ"מ, 5 μ M עם עמוד שמירה 4.6x20 מ"מ	Waters	186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC מערכת Agilent	Technologies	G1380-90000
1.7 מ"ל צינור צנטריפוגה	Sorenson	11700
המילטון מזרקי זכוכית, 5 מ"ל, 50 ומיקרו; L ו-250µ L	המילטון	81517, 80975, 81175
פיפטות פסטר	פישרברנד	13-678-20A
נורות פיפטה פסטר	סיגמא-אולדריץ'	Z111597
אמבטיה סוניקטור	ברנסון 1800 שואב
צנטריפוגת ואקום	Labconco Centrivap מערכת
עמודי MicroSpin, C18 סיליקה	קבוצת הקן	SEM SS18V