מאמר שיטה

פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

DOI:

10.3791/57343

⸱

30 במאי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מוצג עבור חילוץ מטבוליטים, חלבונים ושומנים דגימת אדמה אחד בו זמנית, המאפשר דגימת מופחתת הכנה פעמים ולאפשר מולטי-omic ניתוחים ספקטרומטר מסה של דגימות עם כמויות מוגבלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס metaproteomic משולב, metabolomic ו- lipidomic (multi-omic) מחקרים משנים צורה של היכולת שלנו להבין ולאפיין קהילות חיידקים במערכות ביולוגיות וסביבתיות. מדידות אלה אפילו אתם מאפשרים ניתוח משופרת הקהילות מיקרוביאלית בקרקע מורכבים, אשר הם הכי מערכות מורכבות מיקרוביאלי ידוע עד כה. ניתוח רב-omic, אולם בעל מדגם הכנה אתגרים, מאז נפרד עקירות נדרשים בדרך כלל עבור כל מחקר omic, במיתון מגביר את זמן הכנה ואת משך דגימת נדרש. כדי לטפל מגבלה זו, שיטה 3 ב- 1 על החילוץ סימולטני של מטבוליטים, חלבונים ושומנים (MPLEx) מן הקרקע באותה דגימת זרע נוצר על ידי התאמת בגישה ממס מבוסס. פרוטוקול זה MPLEx הוכיחה להיות פשוטה וגם חזקים עבור סוגי דגימה רבים, גם כאשר מנוצל עבור כמויות מוגבלות של דגימות. אדמה מורכבים. שיטת MPLEx זמין במידה רבה גם את המידות מהירה multi-omic הדרושים כדי להשיג הבנה טובה יותר של חברי כל הקהילה מיקרוביאלי, תוך הערכת את השינויים המתרחשים בעת לפליטת ביולוגי וסביבתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת קהילות מיקרוביאלית בקרקע יש השלכות חשובות להבנת שינוי האקלים ורכיבה פחמן. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו אולם קשיים, כגון חוסר הגנום ברצף עבור microbiota בסוגים שונים של אדמה והפונקציה לא ידוע של החלבונים זוהה רבים. כתוצאה אתגרים בשל קרקע להיות הקהילה מיקרוביאלי המורכבים ביותר הידוע עד כה1,2,3. ניתוח רב-omic, המשלבים נובע metagenomic ', ' metatranscriptomic ', ' metaproteomic ', metabolomic, lipidomic מחקרים, יושמו לאחרונה במחקרים קרקע רבים כדי להשיג הבנה טובה יותר לתוך החיידקים ההווה, תוך קבלת מידע מקיף אודות השינויים המולקולריים המתרחשים בשל הסביבה לפליטת1,4,5. אתגר אחד עם מחקרים מולטי-omic זה ספקטרומטר מסה (MS)-לפי מידות metaproteomic, metabolomic ו- lipidomic מצריכים בדרך כלל תהליך החילוץ ספציפיים עבור כל omic להיות MS התואם6,7 , 8 , 9. אלה נהלים מדויקים להפוך ביישום שלהם מאוד קשה או בלתי אפשרי כאשר רק כמות מוגבלת של המדגם הינו זמין. האתגרים הללו עוררו אותנו לחקור בו זמנית מטבוליט, חלבונים, שומנים בדם החילוץ (MPLEx) שיטה מסוגלת באמצעות אמצעי אחסון מדגם קטן או גושים, שיפור דיוק, מתן דגימת מהר יותר, ההכנות כל שלושה ניתוחים 10. נכון להיום, ישנם הליכים החילוץ אין קרקע חלופית להשגת כל המטרות הללו.

כדי לאפשר ריבוי העולמית-omic ניתוחים של דגימת אדמה יחיד, פרוטוקול החילוץ בממיסים אורגניים המבוססים על כלורופורם, מתנול, הפרדות צבע המים היה שימוש10. שיטה זו פותחה במקור עבור סך השומנים עקירות9,11 , ולאחרונה תוקן על החילוץ סימולטני של מטבוליטים, חלבונים, שומנים מדגם יחיד12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, שמאפשר הכמות המדגם פחות, השתנות ניסיוני10. פרוטוקול MPLEx, כלורופורם אינה miscible עם מים, אשר מספק את הבסיס עבור triphasic כימי ההפרדה של מדגם המרכיבים לתוך שברים נפרדים. פזה מימית בראש מכיל ולכן מטבוליטים הידרופיליות, ואחריו דיסק חלבון, ואז שכבה השומנים בשלב כלורופורם התחתון (איור 1). MPLEx מוחל על רוב קרקעות, חלקיקי הלכלוך מצטבר בתחתית מאוד של הצינורות דגימה, יכול להיות מושלך לאחר שנאספו כל השכבות. כל סוג הקרקע עשויות להיות שונות, עם זאת, ובשנת אדמה מאוד אורגני כגון כבול, שפכי אדמה נשאר השכבה האמצעית לא נופל לתחתית הצינור הדגימה. MPLEx מספקת מספר יתרונות כאשר בידוד המולקולה מספר סוגי מדגם זהה כגון כמויות מדגם קטן 1) יכול לשמש עבור ניתוחים רב-omic, 2) מולטי-omic ושילוב הירידה מדגם זהה השתנות ניסיוני הכולל, ואת 3) ניתן להכין במספרים גדולים של דגימות מהר יותר תפוקה גבוהה יותר מחקרים10. יחד יתרונות אלה הם חיוני למתן יותר יכולות מדידה להערכת דגימות. אדמה וקהילות מיקרוביאלי מורכבים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: קרקעות גשום מאוד יכול להיות lyophilized לפני מיצוי ללא לרעת ליעילותה של החילוץ. קרקע רטובה יכול לשמש גם, אבל יש לקחת בחשבון בעת הוספת ריאגנטים ספציפיים יחסי.

הערה: מומלץ להשתמש 20 גרם של משקל באדמה יבשה לכל החילוץ, אשר חייבים להתפצל בין 50 מ ל שני צינורות (מקסימום של 10 גרם אדמה למחזור 50 מ ל). עקירות וניתן לשנותם למעלה או למטה תלוי מדגם זמינים.

הערה: דגימות. אדמה יבשה יכול להיות sieved דרך מסך 3 מ מ על מנת homogenize ולהסיר את השורשים קטנים וסלעים. לא ניפוי דגימות קרקע רטובה, כמו לדוגמה יוקפא במסך.

1. אדמה פירוק תאים, הפקת מטבוליטים, חלבונים ושומנים (תזמון d ~ 1)

  1. לכל 20 גרם דגימת האדמה, שוקלת 10 גרם לתוך שני צינורות נפרדת 50 מ ל כי הם מתנול/כלורופורם תואם. להיות זהיר מאוד עם הצינורות שבחרת, כפי כלורופורם ליץ רוב פלסטיק, מזהם את הדגימות. להשתמש זכוכית בכל עת צינורות אפשרי או פלסטיק העשויים פוליפרופילן או טפלון (PTFE).
    הערה: לשמור את האדמה על קרח, מגניב ככל האפשר במהלך השלבים הראשונים שקילה, המגון.
  2. להוסיף 10 מ של פלדת אל-חלד מסוידים כלורופורם וחרוזים גארנט כל שפופרת. על קרח, להוסיף 4 מ"ל של קור הנדסה גנטית למים (ראה טבלה של חומרים עבור מערכת טיהור) כל שפופרת (דוגמא אחת פיצול בין שני צינורות) ולהעביר את הדגימות ב דלי קרח לתוך ברדס fume.
  3. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית 25 מ ל, להוסיף במהירות 20 מ של 2:1 קרה כקרח כלורופורם: מתנול (v/v).
    התראה: כלורופורם: מתנול יש השפעות בריאותיות אפשריות חריפה: העור גירוי, כוויות כימיות אפשרי, גירוי במערכת הנשימה. זה עשוי להשפיע על הכליות, הכבד, הלב. ללבוש משקפי מגן מתאימים, ביגוד, כפפות, תמיד עובד עם ברדס fume.
  4. להדק את העפעפיים ואת מערבולת בתוך תמיסת. 2:1 choloroform:methanol מסייע לשבור קיר תאים אאוקריוטים, גם חלבונית פעילויות אנזימטיות.
  5. לצרף הצינורות 50 מ ל צינור מערבולת מצורפים ואופקית מערבולת 10 דקות ב 4 ° C בתוך מקרר במידת האפשר. אז, במקום את הדגימות בתוך מקפיא-80 ° C ~ 15 דקות על מנת לקרר אותם לחלוטין.
  6. באמצעות sonicator של המכשיר בתוך ברדס fume, sonicate כל מדגם גשש 6 מ"מ (" 1/4) של משרעת 60% ל 30 s על קרח.
    התראה: מומלץ להשתמש צליל שוככת מארז והגנה על האוזן בזמן sonicating... מתח גבוה קיים אספקת החשמל וכבל בתדירות גבוהה. להימנע מלגעת למטה או צידי הספינה מדגם עם בדיקה פעיל; ייתכן סדק או להמיס את הפלסטיק.
  7. מקם את הדגימות במקפיא-80 ° C ~ 15 דק ', כפי sonicating ניתן להפיק הרבה חום.
  8. חזור על שלבים 1.5-1.7.
    הערה: ודא כי הדגימות נשארים קרים לאורך כל הליך פירוק.
  9. Centrifuge את הדגימות-g 4,000 x עבור 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בשלב זה, הדוגמה תחולקו השכבה העליונה מטבוליט, interlayer הטובה של חלבון, לשכבה תחתונה השומנים (ואת צניפה פסולת הנותרים). ראה איור 1.
  10. מניחים את הדוגמאות על הקרח דלי קרח, בתוך ברדס fume, באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית 10 מ ל, להסיר את השכבות העליונות מטבוליט של הצינורות 50 מ ל שני לתוך בקבוקון זכוכית גדול אחד.
    הערה: להימנע כ רפה בעברית מכל השכבה החלבון לתוך פיפטה; להשאיר שכבה קטנה של המטבוליט במידת הצורך.
  11. מעט להטות את הצינור 50 מ ל כדי לשחרר את interlayer הטובה של חלבון כך שהוא צף חינם על הרובד הנמוך יותר של שומנים בדם. בעזרת מרית שטוח-ראש המעבדה נקיים נירוסטה, בזהירות סקופ שניהם החלבון interlayers, למקם אותם יחד לתוך שפופרת אחת 50 מ ל חדש.
  12. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית 25 מ ל, להסיר את שכבות השומנים התחתון לתוך בקבוקון זכוכית גדול אחד.
    הערה: נסה להימנע השואף חלקיקי הקרקע; עם זאת, כמה שפכי אדמה וחלקיקים שאף יחד עם ליפידים יוסרו במועד מאוחר יותר.
  13. מקום לנשימה ממברנות מעל מטבוליט של השומנים זכוכית בקבוקונים ויבשה ברכז ואקום עד יובש (שומנים לילה מטבוליטים. ה ~ 4-5).
  14. הצינור מדגם חלבון, הצינורות צניפה פסולת הנותרת, להוסיף 20 מ של מתנול כקרח לכל ו מערבולת. זה נעשה כדי כדורי פסולת לשטיפה כלורופורם לפני שתנסה solubilize כל חלבון הנותרים אפשרי מתוך ההריסות לפני לזרוק לנו אותה.
  15. צנטריפוגה כדורי פסולת, חלבון interlayer ב g x 4,000 למשך 5 דקות, 4 ° C, ואז decant את מתנול לתוך מכולה לפסולת בתוך ברדס fume.
  16. להקפיא את כדורי חלבון ופסולת של חנקן נוזלי ויבשה, איזה שהוא לופילייזר (עם טמפרטורת אספן מסוגל-105 מעלות בשל מתנול שיש נקודת קיפאון נמוכה מאוד-98 מעלות צלזיוס) ~ 2 שעות.
    הערה: לא יתר לייבש את כדורי, מאחר והם יהיו יותר קשה solubilize.
  17. להוסיף 10 מ ל מאגר solubilization חלבון (4% מרחביות, 100 מ מ DTT (DL-dithiothreitol) במאגר טריס 50 מ מ, pH 8.0; ראה הגדרת ריאגנט משלים) צינור interlayer חלבון ו- 20 מ ל כל אחד של כדורי פסולת.
    התראה: מרחביות גורם רעילות אקוטית, הוא דליק. זה עור, עיניים, דרכי הנשימה מגרה. ללבוש כפפות ומשקפיים בטיחות.
  18. בשכונה fume, בדיקה sonicate את הדגימות-משרעת 20% עבור 30 s כדי להכניס להם פתרון. מערבולת למשך 2 דקות.
  19. למקם את הדגימה interlayer של חלבון מסובב צינור במעבדה למשך 30 דקות ב- 300 סל ד, 50 ° C, כדי solubilize החלבון.
  20. אופקית מערבולת הדגימות פסולת 10 דקות נוספות lyse תאים שלמים הנותרים, ואז לסובב עם הדגימות interlayer חלבונים הנותרים כעשרים דקות.
  21. Centrifuge כל הדגימות ב g 4,500 x למשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר (RT), ולאסוף את תגובת שיקוע מהצינור כל לדגימה לתוך שני צינורות 50 מ.
  22. להוסיף 10 מ של solubilization מאגר כדי בגדר interlayer חלבון, אז sonicate ו מערבולת בחזרה לתוך צנטריפוגה פתרון כמו קודם.
  23. לשלב את supernatants לתוך הצינורות 50 מ ל שני באותה מידה, צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס, רוטור דלי זווית קבועה.
    הערה: צנטריפוגה הסופי יש צורך להסיר את עודף חומרים רקבובי משחיתה.
  24. Decant את supernatants לתוך שני צינורות 50 מ ל, שהוא 30 מ ל כל אחת. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית 10 מ ל, להוסיף 7.5 mL של TCA (חומצת חומץ טריכלור) כל שפופרת. מערבולת בתוך תמיסת. זה גורם 20% TCA בכל מדגם 30 מ ל (משתנות בהתאם).
    זהירות: TCA היא העוקצני, רעילים ו- may לגרום לכוויות בעור. ללבוש כפפות ומשקפיים בטיחות.
  25. מקם את הדגימות במקפיא-20 ° C עבור 2 h ללון.
    הערה: חלבונים לזרז בדרך כלל בתוך 1 h אבל יכול להיות שמאל למשך הלילה (עד 18 שעות).
    הערה: אל תתנו החילוץ TCA ללכת יותר מ 18 h עקב אפשרי חומצה הידרוליזה של החלבון. אם המדגם הוא קפוא, להפשיר את זה על הקרח; אל תתנו את הדגימה לחמם אחרי ההפשרה.
  26. כדי הצניפה החלבון precipitated, centrifuge את הדגימה ב 4,500 g x 10 דקות, 4 ° C, decant את תגובת שיקוע לתוך. פסולת.
  27. להוסיף 10 מ של אצטון כקרח 100% כל חלבון צניפה, מערבולת, לשלב כמו כדורי לתוך שפופרת אחת.
  28. Centrifuge את הצינור המכיל את גלולה משולבת (באמצעות איזון) ולאחר מכן decant את תגובת שיקוע לתוך. פסולת.
    התראה: אצטון עלול לגרום בדרכי הנשימה וגירוי העור, העיניים, הוא נוזל דליק, אדי. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים, חלוק מעבדה, לעבוד בשכונה fume.
  29. לשטוף את גלולה פעמיים באמצעות 1.5 מ של אצטון, בסופו של דבר העברת צינור 2 מ"ל של המהדורה הסופית ב g x 10,000 למשך 5 דקות.
  30. Decant את תגובת שיקוע לתוך. פסולת ולאפשר בגדר לייבש הפוך על מגבון נייר בשכונה fume ~ 20 דקות או תחת זרם חנקן עד בגדר מעט מתחילה להיסדק.
  31. להוסיף 100-200 µL של המאגר solubilization חלבון, בהתאם לגודל בגדר.
    הערה: ודא שהעוצמה של מאגר solubilization הוסיף את הדגימה נמוך ככל האפשר. לאחר מכן מסנן סייעו מדגם הכנה (FASP) להשתמש רק עד 50 μL מדגם solubilized בכל עמודה; כל עוד חייב להיות לפצל FASP עמודות מרובות.
  32. Sonicate ו מערבולת בגדר לתוך פתרון. שים לב שייתכן צמיגה עקב רקבובי חומרים מאיצים יחד עם החלבון, אשר יוסרו עם צנטריפוגה עוקבות על המדגם.
  33. לנער את הדגימה ב חממה/שייקר למשך 30 דקות ב- 300 סל ד, 40 ° C, solubilize החלבון לתוך פתרון ולהמשיך כדי עיכול חלבונים.
  34. הצמד להקפיא את הדגימה חנקן נוזלי, חנות במקפיא-80 ° C עד מוכן לעיכול חלבון.

2. השומנים הכנה (עיתוי ~ 20 דקות)

  1. לאחר הדגימות השומנים יבש, להוסיף 200 μL של 2:1 כלורופורם: מתנול למבחנה, מערבולת בתוך תמיסת והעברת לתוך צינור פוליפרופילן 1.5 mL, להוסיף μL 200 נוספים של הזכוכית בקבוקון, מערבולת, pipette ליפידים הנותרים ולהעביר הצינור.
  2. Centrifuge ההריסות המדגם-g x 12,000 עבור 5 דקות ב 4 º C.
  3. להעביר את תגובת שיקוע לתוך בקבוקון זכוכית השומנים החנות ב-20 ° C עד LC-MS/MS ניתוח (פרטים נוספים עבור LC-MS/MS בשיטות משלים).
  4. אם לא יכול להיות מנותח הדגימות מיד לאחר ההכנה, ליפידים צריך להיות מאוחסן הממס ב-20 ° C כדי למנוע חמצון והשפלה.

3. מטבוליט והכנה Derivatization (עיתוי ~ 5 h)

  1. ביום לאחר החילוץ, להסיר את הדגימות מטבוליט Vac מהירות ולאחסן יבש ב-20 ° C עד מוכן derivatization וניתוח ב- GC. אם לא פועל המטבוליטים GC, ואז מכינים אותם באמצעות פרוטוקול המתאים עבור הכלי.
  2. מיד לפני derivatizing המטבוליטים לניתוח ב- GC, מעבירות אותן ממקום הבקבוקונים זכוכית גדול על-ידי הוספת μL 200 של מתנול, vortexing, הוספת צינור פוליפרופילן 1.5 מ. חזור על פעם אחת.
  3. Centrifuge את הצינור ב g x 12,000 למשך 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע לתוך מבחנות זכוכית קטנים יותר, להוסיף לנשימה קרום למעלה, ולא יבש לחלוטין ב- Vac מהירות.
  4. Derivatize המטבוליטים על-ידי הוספת 20 µL של פתרון methoxyamine הדגימה בקבוקון ואת מערבולת ב-30 s ב- vortexer במהירות בינונית.
    התראה: Methoxyamine הידרוכלוריד גורם לכוויות קשות ונזק חמור לעיניים, עלול לגרום רגישות עולה על ידי מגע עם העור. ללבוש בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, ועובדים עם ברדס fume.
  5. השתמש sonicator אמבטיה כדי להבטיח שהדגימה היא התפרקה לחלוטין.
  6. דגירה המדגם באינקובטור עם מכסה למניעת עיבוי שמרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע וחצי שעות עם 1,000 סל ד רועד.
  7. היפוך המבחנה פעם אחת לערבב את הדגימות עם טיפות מרוכז על פני השטח את הכובע. ספין המדגם למטה-1000 g x עבור 1 דקות, RT.
  8. לבצע silylation על-ידי הוספת µL 80 (באמצעות מזרק) של N-מתיל - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide עם trimethylchlorosilane 1%. מערבולת של עשיריות.
    התראה: MSTFA + 1% TMCS יכול לגרום קורוזיה עור עיניים חמורות נזק, רעילות איברים ביעד מסוים, הוא נוזל דליק, אדי. ללבוש בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, ועובדים עם ברדס fume.
  9. דגירה המדגם באינקובטור עם מכסה למניעת עיבוי שמרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם 1,000 סל ד רועד.
  10. היפוך המבחנה פעם אחת לערבב את הדגימות עם טיפות מרוכז על פני השטח את הכובע.
  11. ספין המדגם למטה במשך 5 דקות ב 2,000 x g, RT.
  12. להעביר את הפתרון יפעלו ויגיבו לתוך מבחנות המתאים לניתוח GC-MS.

4. חלבון עיכול (עיתוי d ~ 1)

  1. Centrifuge הדגימה ב 15,000 g x במשך 5 דקות, RT, כדי הצניפה נפולת.
  2. לבצע סינון-בעזרת--הכנת הדוגמא (FASP) עבור ערכות העיכול באמצעות FASP (ראה טבלה של חומרים) הבאה ששינה31,הוראות היצרן32:
    1. להוסיף 400 μL של המאגר אוריאה שמונה מ' לתוך עמודה FASP (500 μL 30K MWCO ספין מסנן).
    2. ברגע המדגם סיים צריך שתוציאו, פיפטה הנחה תגובת שיקוע (ביטול בגדר) ולהוסיף μL עד 50 המדגם μL 400 של 8 מ' אוריאה בעמודה.
      הערה: להוסיף רק עד 50 μL מדגם בכל עמודה. אם יש יותר מ-50 μL מדגם, השתמש בטורים מרובים ולשלב את פפטידים לאחר עיכול. עדיף לעזוב את אמצעי אחסון זה נמוך ככל האפשר (30 µL הוא אידיאלי) על מנת להבטיח את FASP עמודה תביא להסרת כל זמנים תוססים אשר עלולים להפריע באופן דרמטי ניתוח המוני מפרטים טכניים.
    3. למקם את העמודה לתוך הצינור mL 1.5 כלולים, centrifuge את הדגימה ב g x 14,000 למשך 30 דקות, RT.
    4. הסר את הזרימה דרך לתוך. פסולת להוסיף 400 μL של שמונה מ' אוריאה לעמודה, צנטריפוגה שוב.
    5. חזור על שלב הקודם פעם נוספת בסך 3 שטיפות אוריאה.
      הערה: ודא המדגם נמשך קרוב יובש העמודה, אם יש יותר מ ~ 30 µL שנותרו על המסנן לאחר ספין אחד, להמשיך צריך שתוציאו.
    6. הוסף μL 400 של 50 מ מ NH4HCO3 ו צנטריפוגה ב g x 14,000 כעשרים דקות, להשליך את הפסולת, פעם אחת.
    7. להעביר את העמודות שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 נקי.
    8. הוסף μL 75 טריפסין עיכול מאגר לעמודות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות בתוך אינקובטור עם מכסה למניעת עיבוי-750 סל ד.
    9. להוסיף 40 µL של 50 מ מ NH4HCO3 העמודות.
    10. Centrifuge הדגימה ב g 14,000 x למשך 15 דקות. לאסוף את פפטידים לתוך הצינור תוך שמירה על מזהמים משקל מולקולרי גבוה יוליאנוס.
    11. הוסף μL 40 של 50 מ מ NH4HCO3 טורים, צנטריפוגה שוב.
  3. למחוק את העמודה, יבש למטה פפטידים בצינור ב- Vac מהירות µL ~ 30, ואת וזמינותו BCA (Bicinchoninic אסיד חלבון assay קיט; ראה טבלה של חומרים) של פפטידים.
  4. לחלופין, לבצע צעד לנקות אם מרחביות זיהום חשוד (בועות גלוי)33. מיצוי מעבדתי חייב להיעשות לאחר מכן אם בוחרים באפשרות זו. מידע מפורט אודות שיטה זו לנקות זמין שיטות משלים.
  5. לדלל את הדגימה לבדיקה MS או לחילופין להמשיך HPLC fractionation (הבא שני צעדים).
  6. כדי fractionate, לדלל דוגמאות לאמצעי אחסון של 400 µL עם 10 מ מ אמוניום formate מאגר (pH 10.0).
  7. לפתור על עמודת סי18 (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הפרדת ב- 0.5 מ ל/דקה באמצעות מערכת HPLC עם שלבים ניידים (א) 10 מ מ אמוניום formate, pH 10.0 (B) 10 מ מ אמוניום formate, pH 10.0/acetonitrile (10:90).
    1. להתאים את המילוי ההדרגתי של 100% א ל 95% A מעל 10 דקות הראשונות, 95% A עד 65% A מעל מינימום 10 עד 70, 65% א א 30% מעל מינימום 70 ל- 85, שתשמור על 30% A מעל מינימום 85 עד 95.
    2. Equilibrate מחדש עם 100% A מעל מינימום 95 עד 105 והחזק ב- 100% של עד 120 דקות.
    3. לאסוף שברים בכל מין 1.25 (96 שברים מעל המילוי ההדרגתי כולו), סוף סוף לשלב בכל שורה עבור סכום כולל של 12 דוגמאות או כל שורה שנייה עבור דגימות 24 (כל אחד עם n = 8 או n = 4 שברים איחדו).
  8. יבש שברים כל תחת ואקום ולהוסיף µL 15 של הנדסה גנטית מים לכל לאחסון ב-20 ° C עד ניתוח LC-MS/MS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר פרוטוקול MPLEx שימש כדי לחלץ מולקולות של קנזס ערבה יליד האדמה (קרקע Mollisol), הבדיקות triplicate מספק תוצאות עבור 3376 פפטידים, ליפידים 105 ו 102 קוטבי מטבוליטים (כל המזהים הייחודיים). בזמן פרוטוקול MPLEx הייתה ומבוססת לחילוץ כללי של ליפידים, מטבוליטים12,13,14,15,16,17,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חשוב לציין כי לא כל המעבדות יהיו זמינות ציוד אז שיטות מסוימות, לדוגמה השלב פירוק, ניתן להתאים. כאן אנו משתמשים vortexing sonicating, אולם השימוש מכה חרוז גדול 50 מ ל יעבוד. אם איזה שהוא לופילייזר עם טמפרטורת אספן מסוגל-105 מעלות צלזיוס אינה זמינה, יכולים להיות מיובש דגימות תחת זרם חנקן. גם סוגי אדמה להשתנות במידה רבה, באפשרותך לכלול חול סחופת, קליי, כבול, חמרה (וכדומה), הם גם יכול להשתנות בהתאם pH, מליחות, העושר חומר אורגני. כל אחד סטיות אלה יכולים להשפיע על הפרוטוקול, ולכן חשוב להיות גמיש וכדי לבצע התאמות בעת ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות נתן ג'ונסון על סיועו בהכנת הדמויות. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית פאן-טכנולוגיות אשר ממומן על ידי של משרד האנרגיה האמריקני של Office הביולוגיים ומחקר סביבתי (תכנית גנומית של המדע), Microbiomes המעבר (מנטה) מעבדה מכוונות פיתוח מחקר היזמה המעבדה הלאומית הפסיפי, כמו גם את נבחרת מוסדות של הבריאות הלאומי מכון בריאות למדעי הסביבה (R01 ES022190) ו- NIH (P42 ES027704). KEBJ הייתי רוצה להודות R21 HD084788 עבור תמיכה כספית לפתח ולאמת טכניקות החילוץ רומן רב-omic. עבודה זו בוצעה ב W. R. ויילי סביבתיים מולקולרית מדעי מעבדה (EMSL), מתקן משתמש המדעי לאומי DOE-הפסיפי הלאומי מעבדה (PNNL). PNNL הוא מעבדה לאומית רב התוכנית המופעלת ע י Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC06-76RL01830.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלורופורםסיגמא-אולדריץ' 650498מאוחסן בטמפרטורה של -20° C ! אזהרה: לכלורופורם יש השפעות בריאותיות פוטנציאליות חריפות , גירוי בעור וכוויות כימיות אפשריות, גירוי במערכת הנשימה, עלול להשפיע על הכליות, הכבד והלב. הרכיבו משקפי מגן מתאימים, בגדים וכפפות, עבדו במכסה אדים.
מתנולסיגמא-אולדריץ'34860מאוחסן ב-20° C ! אזהרה: מתנול עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה, בעור ובעיניים, עלול לפגוע בעצבים, בכליות ובכבד. הרכיבו משקפי מגן מתאימים, בגדים וכפפות, עבדו במכסה אדים.
מים מטוהרים ממערכתטיהור המיםMilli-Q
נתרן דודציל סולפטSigma-AldrichL6026! זהירות: SDS גורם לרעילות חריפה והוא דליק. זה מגרה את העור, העיניים ודרכי הנשימה. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות.
ערכת מיצוי חלבון קרקעMoBio, ערכת מיצוי חלבון קרקע NoviPure, Qiagen30000-20
DL-dithiothreitolSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
חומצה טריכלורואצטיתSigma-AldrichT0699! אזהרה: TCA הוא קאוסטי, רעיל ועלול לגרום לכוויות בעור. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות.
אצטוןסיגמא-אולדריץ650501 מאוחסן בטמפרטורה של -20° C ! אזהרה: אצטון עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה ובעור ובעיניים. נוזל דליק ואדים. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
אוריאהסיגמא-אולדריץ'208884! זהירות אוריאה מגרה את העיניים והעור, השתמש בכפפות ומשקפי בטיחות
אמוניום ביקרבונטFluka09830
TrypsinPromegaV528A20µ g בקבוקונים
ערכת בדיקת חלבון חומצה ביסינצ'וניניתפירס23227
אמוניום פורמטסיגמא-אולדריץ'09735
אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ'34998! אזהרה: אצטוניטריל הוא גורם לגירוי בעור ובעיניים. דליק מאוד. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות. עבוד במכסה אדים.
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא-אולדריץ'T6508! זהירות TFA מסוכן ביותר במקרה של מגע בעור, קשר עין, בליעה ושאיפה. עלול לגרום לנזק לרקמות במיוחד בריריות העיניים, הפה ודרכי הנשימה. מגע עם העור עלול לגרום לכוויות. ללבוש כפפות, מעיל מעבדה, משקפי בטיחות ולעבוד במכסה אדים.
מתוקסיאמין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'226904! אזהרה: מתוקסיאמין הידרוכלוריד גורם לכוויות קשות ולנזק חמור לעיניים, עלול לגרום לרגישות במגע עם העור. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
פירידיןסיגמא-אולדריץ'270970! אזהרה: פירידין עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים, לדיכוי של מערכת העצבים המרכזית. אדים עלולים לגרום לשריפת הבזק. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
N-מתיל-N-(טרימתילסיליל)טריפלואורואצטמיד עם 1% טרימתילכלורוסילןסיגמא-אולדריץ'69478! זהירות MSTFA + 1% TMCS עלול לגרום לקורוזיה בעור, נזק חמור לעיניים ורעילות ספציפית של איברי מטרה. נוזל דליק ואדים. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.
אשלגן כלוריSigma-AldrichP9541
Milli-Q מערכת טיהור מיםMilliporeדגם MPGP04001
VortexScientific IndustriesSI-0236Vortex Genie 2
סוניקטור בדיקהFisherBrandדגם FB505
צנטריפוגה מקוררתEppendorfדגם 5810R
צינור 50 מ"ל רוטור דלי מתנדנדEppendorfA-4-44
50 מ"ל רוטור זווית קבועהEppendorfFA-45-6-30
איזוןOHAUSדגם V22PWE150IT
בקר פיפטה סרולוגיEppendorf12-654-100
10 מ"ל, 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות מזכוכיתFisherBrand13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer עם ThermotopEppendorf5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 מ"מ תערובת חרוזי נירוסטהNextAdvanceSSB14B
0.15 מ"מ חרוזי נופךMoBio13122-500
צלחת ערבוב מגנטיתFisherBrand11-100-16SH
מוט ערבוב מגנטיFisherBrand14512130
רצועות נייר pH, pH טווח 0– 14FisherBrandM95903
15 מ"ל, 50 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטיGenesee Scientific21-103 21-108כלורופורם תואם
50 מ"ל מערבולת מצורףMoBio13000-V1-50
דלי קרחFisherBrand02-591-44
בקבוקוני זכוכית 27.25x70 מ"מFisherBrand03-339-22K
לנשום ממברנות צלחת קלות יותרMidwest ScientificBERM-2000
מגבוני אלכוהולמגוון ביוטקBPWP-1000
חממת שייקר חימוםמדד, Incu-Shaker מיני
מסובב צינור רוטיסרי אנלוגיSoCal BioMed, LLC82422001
ערכת הכנת דגימה בעזרת מסנןFASP; Expedeon44250
קורא מיקרופלייטBiotek, EPOCH-20
מעלות צלזיוס מקפיאפישר13986149-80
מעלות צלזיוס מקפיאסטירלינג אולטרה-קרSU78OUE
Q-Exactive מלכודת יונים ספקטרומטר מסהThermo Scientific
Agilent 7890A כרומטוגרף גז יחד עם מרובע יחיד ספקטרומטר מסה 5975CAgilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap VeloThermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC מערכתMillford, MA
250 מ"ל בקבוק מדיהFisherBrand1395-250
בקבוקון מים186002805
זכוכית MS בקבוקון דגימה ומוסיףMicroSolv9502S-WCV, 9502S-02ND
זכוכית בקבוקון HPLC וכובעי הצמדMicroSolv9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96 בארותצלחת Agilent5042-6454
בקבוקון זכוכית גדול 27.25x70 מ"מFisherBrand03-339-22K
LyophilizerLabconco7934021
מרית ראש שטוח מנירוסטה מלוטשתSpoonula; FisherBrand14-375-10
מגבוני קיםקימברלי-קלארק34721
XBridge C18, 250x4.6 מ"מ, 5 μ M עם עמוד שמירה 4.6x20 מ"מWaters186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC מערכת AgilentTechnologiesG1380-90000
1.7 מ"ל צינור צנטריפוגהSorenson11700
המילטון מזרקי זכוכית, 5 מ"ל, 50 ומיקרו; L ו-250µ Lהמילטון81517, 80975, 81175
פיפטות פסטרפישרברנד13-678-20A
נורות פיפטה פסטרסיגמא-אולדריץ'Z111597
אמבטיה סוניקטורברנסון 1800 שואב
צנטריפוגת ואקוםLabconco Centrivap מערכת
עמודי MicroSpin, C18 סיליקהקבוצת הקןSEM SS18V
Millipore .' , אולטרסאונדריכוז עמידה לחומצה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
  3. White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
  4. Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
  5. Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
  7. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
  8. Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
  10. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
  11. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  12. Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138(2016).
  13. Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
  14. Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
  15. Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
  16. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209(2015).
  17. Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188(2015).
  18. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
  19. Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155(2013).
  20. Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
  21. Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
  22. Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558(2012).
  23. Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
  24. Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584(2012).
  25. Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
  26. Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
  27. Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719(2010).
  28. Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
  29. Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
  30. Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
  31. Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
  32. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
  33. Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
  34. Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
  35. Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
  36. Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
  37. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277(2014).
  38. Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
  39. Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Probe Sonication

מאמרים קשורים