הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

12.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57346

⸱

12 בספטמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

במאמר זה

סיכום

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

תקציר

הבנת מחסום הדם - מוח הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological הוא קריטי עבור הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות להחזיק את ההבטחה לשיפור משלוח סמים המוח, לשפר את המוח הגנה, מתייחסים המוח הפרעות. עם זאת, לומד את הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח הוא מאתגר. לפיכך, יש צורך קריטי עבור מודלים המתאימים. בהקשר זה, נימים המוח מבודדים מרקמות המוח האנושי מייצגים כלי ייחודי כדי ללמוד מכשול לתפקד קרוב המצב האנושי ויוו ככל האפשר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד נימים מרקמות המוח האנושי-תשואה גבוהה ועם איכות עקבית וטוהר. נימים מבודדים מרקמות המוח האנושי טריים באמצעות המגון מכני, צפיפות-הדרגה צנטריפוגה סינון. לאחר הבידוד הנימים המוח האנושי יכול לשמש ליישומים שונים כולל מבחני דליפה, הדמיה תא חי המבוסס על החיסון מבחני ללמוד ביטוי חלבון, פונקציה, פעילות אנזים או איתות תאיים. המוח האנושי מבודד נימים הם מודל ייחודי התירי ברגולציה של הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח. מודל זה יכול לספק תובנות לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) פתוגנזה, אשר יסייע לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית.

מבוא

מחסום הדם - מוח הוא ממשק פיקוח הדוק בין הדם לבין המוח שקובע מה נכנס ומה יצא המוח. מבחינה אנטומית, תאי אנדותל להלחין את מחסום הדם - מוח וצורות מורכבות, רציף לרשת הנימים. מבחינה פיזיולוגית, רשת נימי זו מספקת את המוח עם חמצן וחומרים מזינים בזמן בו זמנית חיסולו של פחמן דו-חמצני, חומרי פסולת מטבולית. חשוב לציין, ראיה תומכת כי השינויים המכשול לתרום פתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, שבץ מוחי1,2,3,4,5 , 6 , 7. המוח תאי אנדותל גם לשמש מחסום לטיפול על ידי חסימת ספיגת התרופה לתוך המוח, למשל., כימותרפיה של גליובלסטומה בעקבות הגידול כריתה8,9, 10. בהקשר זה, המוח האנושי מבודד נימים מייצגים ייחודי שמחוץ מחסום הדם - מוח מודל הדומה מכשול מאפיינים ויוו, מה שמאפשר עבור המחקר של המכשול ותפקוד לקוי בבריאות ומחלות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול לבודד נימים המוח של המוח האנושי באיכות נימי בעקביות גבוהה, תשואה ללמוד את מחסום הדם - מוח.

בשנת 1969, Siakotos et al. 11 היו הראשונים לדווח את ניתוקה של נימי הדם במוח של רקמת המוח שור ואנושי שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה וזכוכית חרוז עמודה ההפרדה. גולדשטיין. מאוחר יותר, et al. 12 חל שיפור בשיטה זו על-ידי הוספת שלבים מרובים סינון כדי להקטין את כמות רקמת צריך ללמוד נימים המוח מבודד חולדות, תוך שמירה על פעילות חילוף החומרים של הגלוקוז תחבורה. מאז, חוקרים אופטימיזציה ההליך בידוד נימי פעמים רבות, שיפור המודל נימי שיטת והמוח עם כל איטרציה13,14,15. לדוגמה, Pardridge et al. 16 מבודד שור נימים באמצעות עיכול אנזימטי במקום מכני המגון ולאחר מכן עברה השעיה נימי דרך מסנן רשת מיקרומטר 210 ו עמודה חרוז זכוכית. לבצע שינויים אלה משופרת הכתם הדרה trypan blue של נימי הדם במוח מבודד, לפיכך, גדלה הכדאיות תא אנדותל. בתחילת שנות התשעים, Dallaire et al. 17 מבודדים נימים שור, חולדה היו ברורות של זיהום עצביים ומתוחזק פעילות חילוף החומרים של γ-glutamyl transpeptidase (וγ-GTase), אלקליין פוספטאז. בשנת 2000, מילר ואח. 18, המשמש עכברוש מבודד, המוח חזירי נימים בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית להראות ההצטברות של סובסטרטים תחבורה לתוך לומן של נימים. לאחר מכן, המעבדה שלנו ממשיכה לייעל את ההליך בידוד נימי המוח, הקמנו מבחני תחבורה כדי לקבוע P-גליקופרוטאין (P-gp)19,20,21, סרטן השד ההתנגדות חלבון (BCRP)22,23, ו רב תרופתיים חלבון 2 (Mrp2) פעילות תחבורה24 . בשנת 2004, פרסמו שני דוחות כאן היינו מבודדים עכברוש המוח נימים לחקור איתות המסלולים השונים. ב- Hartz ואח. 21, מצאנו כי ה-פפטיד endothelin-1 במהירות, הפיכה צמצם P-gp תחבורה פונקצית נימים המוח על ידי משחק דרך endothelin קולטן B (ETB) קולטן, תחמוצת החנקן סינתאז (NOS), חלבון קינאז C (PKC). ב. באוור et al. 19, להדגים ביטוי של הקולטן pregnane X קולטן גרעיניים (PXR), הראה PXR-אפנון של P-gp הביטוי ואמצעי התחבורה פונקציה של נימי הדם במוח. בניסויים עם העכברים הטרנסגניים PXR humanized, אנחנו הרחיבה את הקו הזה של מחקר והראו ויוו הידוק של המכשול באמצעות upregulating קולטני P-gp באמצעות הפעלת hPXR25. בשנת 2010 Hartz ואח. 26 להשתמש בגישה זו לשחזר P-gp חלבון ביטוי ולהעביר פעילות בעכברים חלבון (מא) הטרנסגניים קודמן עמילואיד אנושי זה overexpress בשמחה. יתר על כן, שחזור P-gp ב מא עכברים הקטינה באופן משמעותי עמילואיד ביתא (Aβ)40ו- Aβ42המוח רמות.

בנוסף למדתי איתות המסלולים, נימים המוח מבודדים ניתן לקבוע שינויים בחדירות נימי אשר אנו מתייחסים כאל זליגת נימי. בפרט, וזמינותו זליגת טקסס האדום משמש כדי להעריך את דליפת הפלורסנט טקסס האדום של לומן נימי לאורך זמן נתונים אלה משמשות לאחר מכן לנתח את זליגת המחירים. המחירים זליגת נימי מוגברת בהשוואה לאלו של שליטה נימים מצביעים על שינויים שלמות פיזית מחסום הדם - מוח2. זה חשוב כי יש מצבי מחלה רבים הקשורים עם מחסום הפרעה, למשל., אפילפסיה, טרשת נפוצה, אלצהיימר, מוח טראומטית פציעה27,28,29, 30. קבוצות אחרות גם נעזרו נימים מבודד להבחין איתות המסלולים המווסתים ביטוי חלבון ופעילות התחבורה של חלבונים31,32,33,34, 35,36,37. בסופו של דבר, המשכנו למטב את שיטה זו עבור בידודו של המוח האנושי נימים ו, לאחרונה, הראנו ביטוי מוגבר של P-gp-האדם מחסום הדם - מוח בחולים עם אפילפסיה בהשוואה לאנשים ללא פרכוס שליטה38 . התפתחויות אלה יחדיו, מדגימים כי המוח מבודדים נימים יכול לשמש מודל רב תכליתי ללמוד מכשול פונקציה.

שונים ויוו, ex-vivo, ומודלים במבחנה מחסום הדם - מוח שימשו מחקר בסיסי, תעשייתי והתרופות הקרנה, בעיקר עם המטרה של בדיקת משלוח הסמים המוח39,40,41 ,42,43,44. בנוסף מבודד שמחוץ נימים המוח, המודלים הנוכחיים של מחסום הדם - מוח כוללים סיליקו מודלים, במבחנה תרבית תאים של תאי אנדותל נימי המוח מבודדים או שורות תאים מונצחים מ שונים מינים, in vitro לקשרי תרבות של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) כי להבדיל לתוך תאי אנדותל נימי המוח, ומודלים microfluidic על שבב.

אין סיליקו מודלים משמשים בדרך כלל פיתוח תרופות לבחירת המועמדים סמים המבוסס על הקליטה החזוי, הפצה, חילוף החומרים ומאפיינים הפרשה (גלית נחמני). שיטות כגון מבנה כמותית-מאפיין יחסים (QSPR) מודלים ודגמים היחסים (QSAR) מבנה כמותית-פעילות הן השיטות הפופולריות בשימוש תפוקה גבוהה ההקרנה של ספריות לחזות המוח חדירה של מועמדים סמים 45 , 46. מודלים אלה שימושיים מסך מולקולות למאפייני חדירה מכשול.

Betz. et al. 47 נוסדה monolayers של תאי אנדותל נימי המוח מתורבתות כמו מערכת מודל מחסום הדם - מוח במבחנה . במבחנה תא תרבות מודלים באמצעות רקמות טריים או קווים מונצחים תא אנדותל כגון תאי אנדותל microvessel במוח האנושי (hCMECs) יכול להיות עוד כלי ההקרנה תפוקה גבוהה עבור המוח חדירה או מחקרים מכניסטית. עם זאת, של התרבות תאי אנדותל נימי מוח חסר גזירה הפיזיולוגיות של זרימת הדם בתוך נימי לומן מוגבלים בסיבוכיות הכולל וחיסונים, עוברים שינויים בביטוי, לוקליזציה של רכיבים חשובים מכשול כגון חלבונים צומת חזק, קולטנים משטח, שנאים, אנזימים, יון ערוצי48,49,50. לעומת זאת, monolayers אנדותל נגזר hPSCs, יש חדירות נמוכה סוכרוז לעומת תרבויות hCMEC/D3, מכילים את הביטוי מקוטב של מובילי מחסום הדם - מוח מסוימים, מולקולות אדהזיה צמתי צר51, 52. עם זאת, תאים אלה קיימת גם שינוי מאפיינים בתרבות, המערכת יש לאמת עבור שלה רפריזה ויוו מכשול מאפיינים52.

מגמות חדשות בחקר מחסום הדם - מוח כוללים ניצול מערכות תרביות רקמה תלת-ממד כדי ליצור נימים מלאכותי, באמצעות הטכנולוגיה איברים על שבב לייצר מכשירים microfluidic, או ניצול הטכנולוגיה הולופייבר53, 54 , 55. נימים מלאכותיים, עם זאת, יש קטרים גדולים משמעותית (200-100 מיקרומטר) מאשר המוח נימים (3-7 מיקרומטר). לפיכך, ההטיה כוחות במבחנה לא לגמרי דומים המצב ויוו . זה נשלח בהתקנים microfluidic "blood-brain-barrier-on-a-chip", שבו שאוב ממברנות מלאכותיות טופס "דם", "המוח" תאים ונוזלים דרך התקנים אלה לייצר כוחות גזירה microfluidic. באופן דומה, תרבויות המשנה של תאי אנדותל בשילובים שונים עם האסטרוציטים ותאים השריר החלק בכלי הדם היו בשימוש גם עם הטכנולוגיה הולופייבר ליצור מחדש נוכח תחת ויוו תנאים56 rheological פרמטרים , 57 , 58. עם זאת, לא ברור עד כמה המודל הזה משקף מאפיינים נוספים של מחסום הדם - מוח כגון תחבורה, חילוף החומרים, איתות, ואחרים. מודלים מלאכותיים אלה נים ו- chip מתאימים להקרנה תפוקה גבוהה של סמים, אבל התאים המשמש ליצירת מודלים אלה הם גם עשויים להשתנות במהלך תרבות.

פרוסות המוח מוקפאים ולא קבוע או מוח ראשוניים תא אנדותל נימי שהתרבויות דגמים נוספים יכול לשמש כדילחקור את microvasculature האנושית5,59,60,61. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה של רקמת המוח קבוע משמש לקביעת חלבון לוקליזציה, ביטוי בריא לעומת רקמות חולות.

בנוסף רקמת פרוסות הדגמים במבחנה המוח תוארו לעיל, טרי מבודד נימים יכול להיות מנוצל כדי לחקור פונקציה מחסום הדם - מוח. מגבלות של מודל נימי מבודד זה כוללים את הקושי להשיג רקמת המוח האנושי טריים, היעדר האסטרוציטים הנוירונים ואת תהליך בידוד יחסית זמן רב. יתרון של המודל נימי המוח מבודדים היא כי מודל זה הדומה המצב ויוו , לפיכך, יכול לשמש כדי לאפיין את מחסום ותפקוד לקוי. חשוב, זה יכול לשמש גם להבחין מנגנוני איתות באמצעות שפע של מבחני ו טכניקות מולקולריות3,19,62,63.

המעבדה שלנו יש גישה אל רקמת המוח האנושי טריים וקפואים שני דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ')64. בהקשר זה, בצע נתיחות שלאחר המוות פרוטוקול תקני, המוח מתקבלים ב < 4 שעות ולאחר כל ההליכים לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. בהתחשב גישה ייחודית זו רקמת המוח האנושי, אנו נוסדה, אופטימיזציה פרוטוקול לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי שתוצאתו תשואה גבוהה של נימי הדם במוח האדם ללא פגע, מעשית. שתי נקודות הקצה נפוץ עניין הן לקבוע את ביטוי חלבון ופעילות. בהקשר זה, אנו ואחרים הקימו מבחני שונות, יכול לשמש עם נימים המוח מבודדים ללמוד ביטוי חלבון ו רמות הפעילות. מבחני אלה כוללים סופג המערבי, מערביים פשוטים assay, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), zymography, מבחני פעילות תחבורה, ו מבחני זליגת נימי. מבחני אלה לאפשר לחוקרים ללמוד שינויים בתפקוד מכשול בתנאים פיפטות האדם לקבוע מסלולים המפקחים על ביטוי חלבון ופעילות, לזיהוי מטרות תרופתי לטיפול של מחסום הדם - מוח הקשורים מחלות.

נלקח יחד, טרי המוח מבודדים נימים יכולים לשמש כמודל לשחזור ועמיד של מחסום הדם - מוח. במיוחד, מודל זה יכול להיות משולב עם מבחני שונות רבות כדי לקבוע מגוון רחב של נקודות קצה ללמוד מכשול פונקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המידע שלהלן מבוסס על תקני הרגולציה ב אוניברסיטת קנטאקי, בלקסינגטון, KY, ארה ב ובטיחות הנוכחי. כאמצעי בטיחות, עיין תוכנית בטיחות ביולוגית של המוסד ועל תקנות העדכני ביותר ואת המלצות לפני שעבדה עם רקמה אנושית.

התראה: רקמה אנושית יכולה להיות מקור של נישא בדם פתוגנים, כולל וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (בזכות) ואחרים. עבודה עם רקמה אנושית מהווה את הסיכון של הידבקות נישא בדם פתוגנים. לכן, שיקולים מסוימים התקינה והבטיחות הם הכרחי בעת עבודה עם רקמה אנושית כדי להגן על עובדי מעבדה. עבודה עם רקמה אנושית בארה ב דורשת מעבדה רמה 2 אבטחה, כמו גם אמצעי זהירות והדרכה בהתאם NIH חלק IV-B-7, OSHA מעשה 1970 הסעיף 5(a)(1) ותוכנית בטיחות ביולוגית מוסדיים של המשתמש. באופן כללי, יש להשיג אישור ועדת אבטחה מוסדיים ו/או מוסדיים המנהלים לפני כל מחקר מעורבים חומרים אנושיים (רקמות, נוזלי גוף). ההכשרה נדרשת עבור כל העובדים לעבוד עם חומרים אנושיים וכולל הדרכות בנושאי בטיחות מעבדה בסיסית, למשל, היגיינה כימי בטיחות מעבדה, וכן הכשרה ספציפית על בטיחות ביולוגית, פסולת מסוכנת, אדם נישא בדם פתוגנים. כל אנשי הצוות עובד עם חומרים אנושיים מומלץ מאוד לקבל חיסונים הפטיטיס B, עובדים עם חומרים אנושיים. אנשי נדרשות ללבוש ציוד מגן אישי ספציפי תוך כדי עבודה עם חומרים אנושיים, למשל., חלוק מעבדה קשורים באזיקים ופנים מגן, ללבוש כפפות בכל עת. כל העבודה מתבצעת ב- cabinet אבטחה (שיעור 2). כל הציוד מגיע מגע עם חומרים אנושיים, יותר פסולת מחומרים האדם מטופל כראוי כדי למנוע זיהום ו/או זיהום של כוח אדם. כל ציוד ומשטחים מנוקים עם 10% מלבין ו- 75% אתנול בעקבות כל הליך מעורבים חומרים אנושיים. נזילה עם חומרים אנושיים יש לנקות מיד. כלי זכוכית היא בלוק אחרי כל שימוש. פסולת, כולל רקמה אנושית מבולבל, הוא נאסף בתוך שק פסולת חומרים מסוכנים שכותרתו בלוק. שרפ נאספים במיכל פנצ'רים - והוא עמיד בפני נזילה שכותרתו כמו ותברואה. כל פסולת מחומרים האנושי מושלך על פי תקנות הבטיחות הביולוגי של המוסד.

הערה: המעבדה שלנו משיג החזיתית טריים דוגמאות מאנשים המנוח דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ'). קריטריוני ההכללה הם: הרשמה במחקר עוקבה הנתיחה האורך של בריטניה-ADC ו ≤4 פוסט-מורטם מרווח (PMI) של h64. נתיחות שלאחר המוות בצע פרוטוקול תקני, כל הפרוצדורות לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. PMI קצרה של פחות מ- 4 h יש חשיבות הגבוהה ביותר כדי להבטיח הכדאיות נימי לאחר בידוד. ניתן להשתמש רקמות טריים וקפואים. אם הקפאה זה נחוץ, רקמת המוח האנושי טרי צריך להיות הלם-קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. רקמות טריים או המופשרים צריך להיות מאוחסן במאגר בידוד (ראה להלן), לעבד במהירות. אנו מוצאים את 10 גרם של רקמה אנושית טריים התשואות בערך 100 מ ג של נימי הדם במוח (משקל רטוב).

1. הגדרת

  1. הכנת מאגר
    הערה: הנפח של מאגר הדרושים תלוי כמות הרקמה. כל אמצעי האחסון מאגר בפרוטוקול הבאים מבוססים על 10 גרם של רקמת קליפת המוח האנושי.
    1. L מאגר בידוד: להשתמש 1.5 ליטר תמיסת מלח של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS; מ מ 2.7 אשלגן כלורי, מ"מ 1.47 אינץ ח'2PO4, 136.9 מ מ NaCl, 8.1 מ"מ נה2HPO4, 0.9 מ"מ CaCl2, 0.49 מ מ MgCl2) והשלמה עם 5 מ מ D-גלוקוז (1.35 g ) ו פירובט נתרן 1 מ מ (0.165 g). לאחר הוספת הסוכר ו פירובט, להתאים את ה-pH 7.4 עם נתרן הידרוקסידי. מגניב ולאחסן את המאגר כדי 4 ° C לפני השימוש.
    2. אלבומין שור (BSA): להוסיף 10 גרם של אבקת BSA 1 ליטר בידוד המאגר כדי ריכוז BSA הסופי של 1%. מערבבים לאט כדי להימנע בועות, להתאים את ה-pH 7.4 לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מיד לפני השימוש, מערבבים בעדינות; הימנע ויוצרים בועות כדי למנוע דנטורציה אלבומין.
    3. צפיפות בינונית הדרגתיות: שוקל 18 גרם צפיפות בינונית הדרגתיות לתוך בקבוק זכוכית, להוסיף פס מגנטי מערבבים. להוסיף 60 מ של בידוד מאגר ומנערים נמרצות במשך 5 דקות עד כל אבקת מושהה. חנות בן לילה ב 4 ° C כדי לאפשר המדיום הדרגתיות צפיפות להתמוסס. מערבבים במשך 10 דקות לפני השימוש.
    4. לאחסן כל מאגרי ב 4 ° C; שמור כל מאגרי בקרח וכלים במהלך ההליך כולו בידוד. מוסיפים את כל מאגרי לפני השימוש.
  2. הגדרת הניסוי
    1. לטעון את שהעקב של מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem על גבי קדירות תקורה אלקטרונית. המקום פוטר-Elvehjem רקמות מטחנות, את מהמגן דאונס עם המרוסקים על קרח מתחת למכסה המנוע. הכנת רשת סינון מיקרומטר 300 (5 x 5 ס מ2), קפלו אותו לחצי קונוס, ולא להוסיף ולחבר אותו 50 מ ל בז צינור עם קלטת (איור 1 א').
    2. המקום מחברים הטבעות וסלולרי המתח מסננים (גודל הנקבוביות: 30 מיקרומטר) על צינורות בז 50 מ ל. להכין שקיות פסולת ותברואה. הכנס כל נדרש ציוד אבטחה ארון (ראה טבלה של חומרים).

2. המוח הכנת הדוגמא

הערה: איור 1A מציג את התרשים זרימת עבודה הליך הבידוד כולה המתוארים להלן. רקמת המוח האנושי יכולה לנבוע מכל חלק של קליפת המוח, והוא יכול לשמש טרי או קפוא. יכול להיות הקרת רקמת מוח קפוא בטמפרטורת החדר (אין מאגר; ~ 30 דקות עבור 10 גרם). כדי להשיג תוצאות דומות, רקמת המוח צריכה להתקבל מאזור המוח זהה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה ממוטבת עבורו טריים (PMI < 4 h) קליפת אדם זה לא מוקפא.

  1. הכנה של רקמת המוח האנושי: לתעד את המשקל של רקמת המוח. כל המספרים בפרוטוקול הבא מתאימים עבור 10 גרם של רקמת המוח האנושי טריים. מקם את רקמת המוח 100 מ מ פטרי. הסר בזהירות את כל קרומי המוח עם מלקחיים. השתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן.
  2. הא של רקמת המוח האנושי: בזהירות לחתוך את רקמת המוח, מינצ זה עם אזמל. האוהב למשך בערך 5 דקות (מ מ 2-3 חתיכות). להעביר את רקמת המוח מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem. להוסיף 30 מ של מאגר בידוד.
    הערה: חתיכות רקמה טחון קשים מאז רקמת המוח הופך לדייסה בתהליך mincing.

3. המגון

  1. מטחנות רקמות פוטר-Elvehjem (סיווג: 150-230 מיקרומטר): Homogenize כל מדגם במשיחות 100 במהירות מהמגן של 50 סל ד. המסמך הזמן כל 25 ומילוי הזמן הכולל הדרוש עבור 100 קווים. ראה טבלה 1 עבור פרוטוקול המגון המוצע; הזמן הכולל עבור homogenizing 10 גרם של קליפת האדם הוא כ- 22 דקות. לא לעורר באוויר כדי למנוע בועות.
  2. מהמגן דאונס (סיווג: 80-130 מיקרומטר): להעביר את homogenate מהמגן דאונס על קרח. Homogenize התליה במשיחות 20 (~ 6 s/קו, סך ~ 2 דקות). להימנע בועות.

4. צנטריפוגה

  1. להפיץ את homogenate המוח באופן שווה לתוך ארבעה צינורות צנטריפוגה 50 מ ל, המסמך הנפח הכולל של homogenate. להפיץ 50 מ של מאגר הדרגתיות צפיפות לתוך הצינורות צנטריפוגה (מ"ל למחזור). השתמש 10 מ"ל של בידוד מאגר לשטוף את שהעקב ואת מהמגן, ולהפיץ לתוך צנטריפוגה ארבעה הצינורות (~2.5 mL למחזור).
  2. סגור בחוזקה את צינורות צנטריפוגה עם כמוסות. מערבבים את homogenate צפיפות בינונית הדרגתיות, מאגר ע י ניעור נמרצות הצינורות. צנטריפוגה ב x 5,800 g למשך 15 דקות ב 4 ° C (זווית קבועה רוטור); בחר מהירות בינונית ההאטה לשמור בגדר לחבר את הצינור. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב 2 מ של 1% BSA.

5. סינון

הערה: כדי להפריד בין הנימים לבין תאי דם אדומים ופסולת תאים אחרים, מספר פעולות סינון נחוצים.

  1. רשת מיקרומטר 300: לאחר מחדש השעיית בגדר, לסנן את המתלים מבעד לרשת מיקרומטר 300. נימים מסוננים דרך הרשת, ואילו כלי גדול ופסולת המוח גדולים יותר להישאר על רשת השינוי. לשטוף היטב את רשת השינוי עם עד 50 מ של 1% BSA. למחוק את רשת השינוי.
    הערה: שלב סינון זה מנקה את המתלה נימי מכל כלי גדול יותר או נתחי המוח פסולת.
  2. מסנן מתח התא 30 מיקרומטר
    הערה: שלב סינון זה מפריד נימים של כדוריות דם אדומות ושרידים נוספים במוח.
    1. להפיץ את פילטרט של נימי מהשלב 6.1 על המסננים זן תא חמש 30 מיקרומטר (בערך 10 מ"ל של פילטרט של נימי לכל תא המתח מסנן). נימים מתקיימים בחזרה על ידי מסנן זה, בעוד תאי דם אדומים, אחרים תאים בודדים, ופסולת מוח קטן לעבור דרך המסנן ולאחר שנאספו ב פילטרט.
    2. לשטוף כל מסנן עם 25 מ של 1% BSA. לאחר מכן שופכים filtrates כל המסנן השישי כדי להגדיל את התשואה. לשטוף כל מסנן עם 50 מ של BSA 1%; לשמור התא המתח מסננים עם המכיל הנימים וזורקים את פילטרט.

6. אוסף נימי

  1. הפוך את המסננים ולשטוף את נימי הדם עם 50 מ של BSA 1% עבור כל מסנן לתוך צינורות 50 מ. בעדינות הפעילו לחץ עם קצה pipet pipettor מ ל ולהעביר אותה על פני המסנן כדי לשטוף את נימי הדם במוח.
  2. ודא לשטוף את כל הנימים המוח, במיוחד מן השפה של המסנן. להימנע בועות מאז זה מקשה תהליך הסינון, מגדילה את הסיכוי לאובדן נימי.

7. כביסה

  1. לאחר איסוף הנימים, centrifuge כל דוגמאות ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C (מנופף דלי רוטור). הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות את צניפה כ 3 מ"ל של מאגר בידוד. לשלב את כל כדורי resuspended מהדגימה אחד צינור חרוטי 15 מ"ל ולמלא אותו מאגר בידוד. צנטריפוגה שוב ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C, לשטוף פעמיים נוספות.
  2. המסמך טוהר נימי עם מיקרוסקופ (100 X הגדלה), המצלמה (איור 1B).
    הערה: המוח התשואה נימי מ- 10 גרם של רקמת המוח האנושי הוא בדרך כלל כ- 100 מ ג. הנימים המוח מבודדים יכול כעת לשמש לניסויים, מעובד (למשל., lysate, בידוד קרום), או להיות קפואה, המאוחסנת ב- 80 ° C ב- cryotubes למשך תקופה מינימלית של 6 – 12 חודשים (למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ומשום מרקמות המוח האנושי תשואות השעיה מועשר בתמציות המוח האנושי נימים (איור 1B) עם כמויות קטנות של כלי שיט גדולים יותר, תאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת תאים מסוימים. כמה נימים מסתעפות, ו, בחלק, תאי הדם האדומים הם לכודים בתוך נימי לומן. נימי טיפוסי יש קוטר מיקרומטר 3 – 7 והוא כ 100-200 מיקרומטר הרבה זמן עם לומן פתוח; רוב קצוות נימי מכווצות. המוח האנושי מבודד נימים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, לחשוף מבנה צינורי, שלם עם מורפולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של נימי הדם במוח האדם ללא שינוי בר -קיימא מרקמות טריים. בסעיף זה, נדון בפירוט את הפעולות הבאות: 1) שינויים בפרוטוקול, 2) פתרון בעיות של שגיאות נפוצות, 3) מגבלות של הטכניקה, 4) המשמעות של המודל ביחס הקיימת לבין מודלים חלופיים שיטת, ו- 5). יישומים אפשריים עבור המוח האנושי מבודד נימים.

הפרוטוקול המתואר כאן ממוטב 10 גרם של רקמת טריים החזיתית אנושי. עם זאת, היא פשוטה יחסית לשנות הליך זה: 1) פחות או יותר מ- 10 גרם של רקמת, רקמת המוח 2) קפוא או רקמת המוח 3) מאזור המוח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

ואנו מכירים ד ר פיטר נלסון, סוניה אנדרסון מהבנק רקמת המוח בבריטניה-ADC למתן כל המוח האנושי דגימות רקמה (NIH להעניק מספר: P30 AG028383 מן המכון הלאומי לזיקנה). אנו מודים האזרד מאט, טום דולאן, שירותי טכנולוגיית מידע, טכנולוגיה אקדמי, סגל האירוסין, אוניברסיטת קנטאקי לסיוע גרפי. פרויקט זה נתמך על ידי מענק 1R01NS079507 מספר מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו (כדי B.B.) ועל ידי גרנט 1R01AG039621 מספר מן המכון הלאומי לזיקנה (כדי A.M.S.H.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמי של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו או המכון הלאומי על הזדקנות. המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד מגן אישי (PPE)
אחיזת יהלום בתוספת כפפות לטקס, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636PPE
מעילי מעבדה מגן חד פעמייםVWR, Radnor, PA, ארה"ב470146-214PPE; בשל אופיו של חומר המקור האנושי, מומלץ להשתמש במעיל מעבדה חד פעמי
מגן פנים, חד פעמיThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב19460102PPE; בשל אופיו של חומר המקור האנושי, מומלץ להשתמש במגן פנים חד פעמי
בטיחות
Clavies שקיות חיטוי בטמפרטורה גבוהה 8 x 12Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב01-815-6
נייר ספסל יבש Versi 18 אינץ' x 20 אינץ'Thermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב14-206-32לכיסוי אזורי עבודה
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב75800-272לאזמל משומש
אקונומיקה 8.2% קוטל חיידקים קלורוקס 64 אונקיות.מרכז האספקה הבריטי, לקסינגטון, קנטקי, ארה"ב323775
C מקררתרמו פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב13-986-148
Accume BASIC AB15 מד pHתרמו פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"בAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, ארה"ב501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR צנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב75004521
Leica L2 Dissecting MicroscopeLeica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, ארה"במשמש להסרת קרומי המוח
POLYTRON PT2500 HomogenizerKinematica AG, לוצרן, שוויץ9158168
קנה מידה P-403Denver Instrument, בוהמיה, ניו יורק, ארה"ב0191392
מיני StirThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב1151050
Thermo-Flasks חנקן נוזלי DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Cהמשמש להקפאת הרקמה?
וויאג'ר פרו איזון אנליטיOHAUS, פרסיפני, ניו ג'רזי, ארה"בVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, ארה"במשמש לבדיקת נימים מבודדים
<כלים חזקים>כלים וכלי זכוכית
Finnpipette II פיפטה 1-5 מ"לThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב21377823T1לשטוף נימים פילטר
Finnpipette II פיפטה 100-1,000 ומיקרו; LThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"21377821T1להשעות גלולה ב- BSA
Pipet BoyIntegra, הדסון, NH, ארה"ב739658
50 מ"ל צינורות פלקון 25 / מתלה - 500 / csVWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב21008-951
להבי אזמל EISCOThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"S95938Cלטחון רקמת מוח
PARAFILMVWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב52858-000לכיסוי ובקבוק נפחי
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 מ"לThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב21-377-304לשטיפת נימים ממסנן
מזרק 60 מ"ל עם Luer-LokThermo Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"בBD309653בשימוש עם טבעת מחבר לסינון נימים
ידית אזמל #4כלי מדע עדין, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב10060-13המשמש לטחינת
מלקחיים של דומונט #5כלי מדע עדין, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב11251-10המשמש להסרת קרומי המוח
מטחנת רקמות Potter-Elvehjemתומאס סיינטיפיק, סוודסבורו, ניו ג'רזי, ארה"ב3431E25נפח 50 מ"ל, חיסול: 150-230 μ m
Dounce הומוגנייזרVWR, Radnor PA ארה"ב62400-642נפח 15 מ"ל, מרווח: 80-130 μ m
מסננים ארוגים ספקטרה/רשת (300 ומיקרו; m)מעבדות ספקטרום, רנצ'ו דומינגז, קליפורניה, ארה"ב146424משמש לסינון מתלים נימיים להסרת כל קרומי המוח שעלולים להישאר
פלורימסננים (גודל נקבוביות: 30 ומיקרו; m)pluriSelect Life Science, לייפציג, גרמניה43-50030-03
טבעת מחברpluriSelect Life Science, לייפציג, גרמניה41-50000-03שימוש חוזר רב פעמי
1 ליטר בקבוקלהכנת חוצץ בידוד
1 ליטר
מוטערבוב 1% BSAלהכנת 1% BSA ו-Ficoll® בקבוק
Schott (60 מ"ל)להכנת Ficoll® דלי < / sup>
קרחכדי לשמור על הכל קר
לואי, מיזורי, ארה"A9647-500 גרםמכינים ב-DPBS עם Ca2+ & Mg2+ יום קודם. הימנע מבועות במהלך ההכנה. מאחסנים במקרר. יש לערבב לאט במשך 10 דקות לפני השימוש.
DPBS עם Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - חלק ממאגר הבידוד
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"בF4375מדידה מדויקת חשובה כאן. שקלו בבקבוק עם מוט ערבוב. יש לנער במרץ לאחר הוספת DPBS. שומרים במקרר O/N. יהיה בהיר בבוקר. יש לערבב בעדינות במשך 10-15 דקות לפני השימוש. יש לשמור על קרח עד לשימוש.
גלוקוז (D-(+) דקסטרוז)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בG7528גלוקוז (D-(+) דקסטרוז) ריכוז: 5 מ"מ
נתרן הידרוקסיד תמיסה סטנדרטיתסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב71474להתאמת ה-pH של DPBS
נתרן פירובטסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בP2256ריכוז: 1 מ"מ
חומרי <חזק>ציוד4 °;ב ב נפחי להכנת צלחת פטרי 100 מ"מ לטחינת רקמת המוח מגרד תאים תרבית רקמות VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב 89260-222 להסרת סופרנטנט לאחר צנטריפוגה <חזק>כימיקלים < / חזק >BSA Fraction V, A-9647 סיגמא-אולדריץ', St.ב

מקורות

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805(2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40(2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149(2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18(2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709(2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד רקמת מוחסנטריפוגציה במדרג צפיפותהומוגניזציה מכניתבדיקות סינוןמחסום דם-מוחנימי מוח אנושייםניתוח טוהר נימיםבדיקות דליפהדימיון תאים חיים
בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.