Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

פעילות. עצבית ביונקים מתואמת על ידי תנודות רשת, אשר מסייעים להעברת מידע בתוך ובין המוח אזורים^1,2,3,4. מחזורי גלי המוח כוללות תנודות החל איטי מאוד (< 0.8 Hz) עד מרביים תדרים (> 200 Hz). גוף גדול של הראיות תומכת במעורבות ברשת תנודות בפונקציות המוח מגוונים, כולל הכרה^5,6,7,8,9,10 , התנהגויות מולדת^11,12 , כמו גם מנוטלי הפרעות כמו מחלת פרקינסון, אפילפסיה^13,14,15. שיטות סלקטיבי ומדויק חנותם מניפולציה ניסויית התנודות הרשת ולכן הם חיוניים עבור פיתוח מודלים מתקבל על הדעת מבחינה פיזיולוגית של סינכרון, הקמת קשר סיבתי עם התנהגות.

סינכרון לרשת מתווך על ידי מצעים מגוון ביולוגי ותהליכים, החל הזהות מולקולרית של תעלות יונים וקינטיקה שלהם neuromodulation דעתנית, קישוריות רשת. העיצוב הביולוגי של קצב גנרטורים¹⁶ כבר חשף עבור רבים המוח מקצבים, היבטים ברורים של אשר (למשל, תדר, משרעת) לעיתים הביא על ידי דינמיקה של סוגי תאים שונים ורשתות. למשל, interneurons מעכבות מיקוד את somata של התאים העיקריים הם השחקנים החשובים ביותר בכל תדר להקות ואת המוח אזורים^17,18, כולל^19,תטא²⁰, גמא^{20 , 21}, אדווה (140-200 Hz)²² תנודות. בתורו, שלב סינכרון של תאים מרוחקים מובטחת על ידי חזקים הזנה-קדימה איתות של תאים כפירמידה, המגדיר בירי של interneurons. פרמטר קריטי של תנודות, גודל האוכלוסייה עצביים מסונכרן, קשורה קשר הדוק משרעת של תנודה LFP נמדד ו, לפחות עבור תנודות מהר, תלוי הכונן סינאפסות אל interneurons². לעומת זאת, תנודות איטית יותר, כמו דלתא ומקצבים תטא, מופקים על ידי לולאות reentrant ארוכי טווח, שהוקמה על ידי דפנות התלמוס cortico^23,24 תחזיות במחיצה הבין-פרוזדורית בהיפוקמפוס המדיאלי^{25, 26,27}, בהתאמה. תנודות של מעגלים כאלה הם הביא על ידי אינטראקציות של האות הפצת עיכובים, טמפרמנט תגובות שלהם להעדיף תדירות המשתתפים תאים^{28,29,30, 31 , 32}. תחזיות המעכבת של GABAergic parvalbumin (PV)-חיוביים הם תאים של מחצה המדיאלי (MS) כדי interneurons ההיפוקמפוס^25,33, אזורים parahippocampal, קליפת entorhinal²⁶ חיוני עבור הדור התנודות תטא באונה הרקתית המדיאלי. לפיכך, המנגנונים הפיזיולוגיים של רשת תנודות וסינכרון עצביים ניתן לטפל באמצעות optogenetics עם דיוק בזמן אמת.

תא optogenetic ייחודיים לסוג מניפולציות הוחלו ללימודים של תנודות בהיפוקמפוס ואת קורטיקלית במבחנה^{34,35,36,37,38} , אין ויוו^{30,39,40,41,42,43,44,45}, כולל תפקודי חקירות של גמא^{5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52} ואדווה תנודות^40,53,54 ולישון הצירים^55,56. לאחרונה אנחנו הביע וירוס ChR2 תלויי-Cre ב- MS, אזור מפתח לדור של הקצב תטא בהיפוקמפוס, של עכברים PV-Cre. שימוש בתכשיר, תכונות של תנודות תטא בהיפוקמפוס (תדירות ויציבות טמפורלית) היו בשליטת גירוי optogenetic של הקרנות המעכבת של MS ההיפוקמפוס¹¹. יתר על כן, בתדר תטא גירוי optogenetic של הקרנות septo-בהיפוקמפוס מעכבות עורר תטא קצב במהלך נייחות ער. Optogenetically entrained קצב תטא מוצגים מאפייני התנודות תטא ספונטנית העכבר LFP ואת רמות פעילות. עצבית.

תכונות עיקריות של פרוטוקול זה: (1) ניצול מסלול מעכבות שהוא קריטי מבחינה פיזיולוגית על תנודות תטא ספונטנית תוך הימנעות השפעות לא ספציפי על דעתנית בהיפוקמפוס; (2) עצב, קרי, המרצה הקרנה ספציפיים כדי למזער השפעה ישירה על efferents הלא-בהיפוקמפוס MS; (3) המקומי גירוי אור תטא-אומנותית, המבטיח של התערבות ישירה מינימלי עם דינמיקה septo-בהיפוקמפוס תטא-אומנותית, entrainment דו צדדיים הכללית של התנודות תטא; (4) שליטה פרמטרית של תדר תטא תנודות סדירות; (5) כימות אמינות entrainment עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות LFP כדי לאפשר ניתוח כמותי סיבתיות בחיות מתנהגות. מאז בתכשיר הופך לרישית בעיקרו על תפקיד ידועים של העכבה septo-בהיפוקמפוס תטא דור^25,30, היא מאפשרת שליטה חזקה על מספר פרמטרים התנודות תטא בעכברים להתנהג. מחקרים איפה השני פחות ובדוקים משעולים, סוגי תאים של המעגלים septo-בהיפוקמפוס היו מניפולציות^{38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} חושפים עוד מנגנונים של הקצב תטא.

. טוק-אין זכר עכברים PV-Cre⁵⁹, בן, 10-25 שבועות שימשו. עכברים היו תחת תנאים סטנדרטיים במתקן של בעלי חיים, שמרה על מחזור/כהה 12 שעות. כל ההליכים בוצעו על פי הנחיות לאומיות ובינלאומיות, אושרו על ידי רשויות הבריאות המקומי (Landesamt לדנציג נטור, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. נגיפי הזרקה

1. במהלך ההליך כולו, לעקוב אחר הנחיות בטיחות ביולוגית⁶⁰. ללבוש חלוק מעבדה, המצחיקה, רשת לשיער, שני זוגות של כפפות.
2. צינורות עם האזמל סטרילי או מספריים לחתוך כ- 1 מ' אורך, הכנס אותו הבלוק מחזיק מזרק של המשאבה, לתקן את זה.
   1. למלא את הצנרור לחלוטין עם שמן סיליקון באמצעות המזרק.
   2. בדוק אם בועות אוויר יופיעו בהצנרת. אם בועות אוויר הם נצפו, מילוי מחדש את הצנרור שוב עם שמן.
   3. לתקן את הבוכנה כדי לחסום את דוחס.
   4. באיטיות הסוחר לעבר הבלוק מחזיק מזרק, עד קצה המזרק נוגעת הצנרת.
   5. להכניס את קצה המזרק הצנרת, באופן אוטומטי להעביר את דחפן גוש קדימה במהירות איטית על-ידי בחירה "להשרות" חלון הפקודה ועל שיעור אינפוזיה נמוך (למשל, nL 500/min) עד שהוא מגיע לשכונה מחזיק מזרק.
3. הכינו את המחט הזרקה (34 גר').
   1. הסר את הרכזת מחט עם חתך נקי באמצעות דיוק מקדחה/מטחנה מחובר דיסק חיתוך. אם יש צורך, להשתמש מחט כדי להסיר שאריות מתכת מהמשטח טריים חתוכים.
   2. שרשור צינורות קפילר (3-4 ס מ אורך) דרך המחט.
   3. הדבק המחט אל הצנרת עם דבק.
   4. לחבר את המחט הזרקת לסופו של הצנרת, המקשר אל המשאבה microsyringe.
4. לצרף את המחט בעל stereotaxic.
5. תיסוג אוויר עד בועת אוויר בצינור שקוף מעל המחט יהיה גלוי.
6. עזים ומתנגד את העכבר עם איזופלוריין 1.5-3% חמצן. להמתין כ- 2-3 דקות, ולאחר מכן לאשר העכבר הוא מורדם לחלוטין על-ידי הערכת את תגובתה קמצוץ הבוהן. במהלך הניתוח לעקוב הנשימה של החיה איזופלוריין ריכוז ולהתאים אותו במידת הצורך.
7. מקם את העכבר במסגרת סטיאוטטי בעזרת האוזן שאינו טראומטי מחזיקי.
8. להגן על העיניים של העכבר עם ג'ל השומנים.
9. להזריק לידוקאין 0.1 מ"ל intradermally מתחת לעור הראש באמצעות 0.01-1 mL מזרק, בצינורית הזרקה של 26 גרם.
10. לגלח ולחטא את הראש של העכבר באמצעות פתרון אתנול. לאחר מכן לסירוגין chlorhexidine 2% שלוש פעמים עם אתנול לחטא באתר כירורגית.
11. לבצע חתך קו האמצע באמצעות מספריים בסדר וחד הולך מבין מאחורי האוזניים לרמה של העיניים כך bregma ואת למדא גלויים.
12. הגולגולת על-ידי החלת כ 50 µL של NaCl באמצעות מזרק יבש ונקי עם ממחטת נייר, נשיפה של אוויר.
13. מקם את הראש העכבר על-ידי התאמת רמת dorso-הגחוני / המלחציים האף כך bregma ואת למבדה הם באותה רמה dorso-הגחוני / (± 0.3 מ מ).
14. לקדוח חור מעל MS (AP 0.98 ו- L 0.5 מ מ בהקשר bregma).
15. בשלב זה, מפשירים aliquot של הנגיף (צריך להכיל לפחות 2 µL של AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) במשך כ- 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
16. Centrifuge את aliquot-g x כ 4,000-RT עבור 1 דקות.
17. פיפטה µL 2 של הוירוס על חתיכת מצלמות-מיקרוסקופים; השתמש בצד המוגן בעבר.
18. להטביע את קצה המחט הזרקת בנוזל ולסגת בקפידה ב nL בערך 500/דקה תוך התבוננות על הרמה של הנוזל. כדי למנוע אוויר suctioning, לעצור נסיגה לפני הווירוס לחלוטין המנוצל. להתאים את קצב להחלפה לפי צמיגות פתרון; קצב מהיר יכול להקל על נסיגה של וירוס עם צמיגות גבוהה יותר.
19. לנקות את המחט עם ממחטת נייר.
20. בדוק כי הווירוס נכלל בצינור וירוס ושמן מופרדים על-ידי בועת אוויר. סמן את הרמה של הנגיף ברכבת התחתית על מנת לשלוט אם וירוס בהצלחה מותך במהלך ההזרקה.
21. מקם את המחט מעל הניתוח, לאט לאט להכניס אותו לתוך המוח בנקודת ההזרקה הראשונה (AP 0.98, L 0.5, V.-5.2, 5.5 מעלות לרוחב).
22. להזריק 450 nL של הנגיף בקצב של 100-150 nL לדקה להמתין 10 דקות בזהירות להזיז את המחט עד 0.1 מ מ ולא לחכות עוד 5 דקות.
    1. להזיז את המחט אל נקודת הזריקה השנייה (AP 0.98, L 0.5, V-4.6) ולהזריק עוד 450 nL ב- 100-150 nL/דקה.
    2. לחכות שוב 10 דקות לפני הזזת המחט עד 0.1 מ מ. חכה עוד 5 דקות לפני הסרת את המחט.
23. תפר את החתך בתפר משי שחור קלוע באמצעות קשר מרובע. חממו את החיה עם מנורה אדומה כדי להאיץ את ההחלמה. לנהל אנטיביוטיקה (0.3 מ ל Erycinum (1:4 ב NaCl סטרילי)), carprofen i.p. יומי 2-3 ימים לאחר הניתוח.
24. לחתוך את הצינור מעל לסימון שציינה את הרמה של הנגיף. ניתן להשתמש ברכבת התחתית לזריקות עוד יותר. מכינים מחט ההזרקה טריים לפני כל זריקה.
    הערה: ניתוח זה אורך כ- 1-1.5 שעות. החיה מתעוררת בדרך כלל תוך 5 דקות לאחר הניתוח. לחכות מינימום זמן של 6 שבועות לביטוי עצב מספיק אך לא יותר מ 5 חודשים לפני ביצוע השתלות סטיאוטטי, רמות הביטוי מתחילים להפחית כ- 6 חודשים לאחר הזרקת וירוס.

2. הכנת סיבים אופטיים (איור 1 א')

1. השתמש כינוייהם סיבים אופטיים (מיקרומטר 105 הליבה, זכוכית בלבוש ונטיל סיליקה, נה 0.22). רצועת 125 µm חיפוי של ליבת סיבים באמצעות מיקרו-חשפנית בזמן הסיבים עדיין מחובר סליל סיבים.
2. לחתוך הסיבים באורך של 2-3 ס מ בעזרת סכין יהלום.
3. להוסיף הסיבים ferrule קרמיקה מקל זרקוניה (ID: 126 מיקרומטר). כ 0.5-1 מ מ של סיבים אופטיים יש בולטות מן הצד הקמור של ferrule.
4. באמצעות מחט, חל בשני הקצוות של ferrule אבל לא על צדי ferrule טיפה אחת של דבק אפוקסי. לחלופין, השתמש דבק סופר.
5. לאפשר הדבק להתייבש במשך לפחות 30 דקות.
6. פולנית הצד הקמור של ferrule באמצעות יהלום משכשכים סיבים ליטוש הסרט (גריסים מיקרומטר 3).
7. לבדוק את הנאמנות של העברת האור באמצעות של מד הכוח האופטי.
   1. הגדר אורך הגל במד חשמל כדי באותם אורכי גל כמו הלייזר בשימוש.
   2. מקם את תיקון כבל עם קצה מול המרכז של החיישן. כוח על הלייזר ולקרוא את פלט אור מד הכוח. להקליט את הערך.
   3. להתחבר סיבים אופטיים תיקון כבל באמצעות שרוול ההזדווגות ומקמו אותו עם הקצה של סיבים מול המרכז של החיישן. כוח על הלייזר ולקרוא את פלט אור מד הכוח. להקליט את הערך.
   4. לחשב את קצב השידור: לחלק את הערך השני על-ידי הערך הראשון. אם קצב השידור מתחת 0.5, למחוק הסיבים, אחרת להשתמש בו עבור ההשתלה.
   5. בדיקת קצב השידור עבור כל סיב לפני ההשתלה.
   6. לניסויים מאוחר יותר, להתאים את עוצמת אור הפלט של הלייזר קצב השידור של סיבים אופטיים: הגדר את פלט אור מהקצה תיקון כבל 5-15 מחולק על ידי קצב השידור כדי להשיג עם פלט אור הסופי מהקצה סיבים של 5-15 מגוואט.
      הערה: ראה גם הפניה למעורר ⁶¹ עבור הכנת סיבים אופטיים.

3. הכנת טונגסטן תילים מערכים עבור LFP הקלטות (איור 1B)

1. דבק מספר (למשל 6) 100 מיקרומטר, סיליקה צינור מדריכים במקביל לצד דביק של נייר-דבק. חותכים חתיכה אחת, כ 4-6 מ מ, להרכבה מערך חוט אחד.
2. שרשור בידודי formvar 45 מיקרומטר טונגסטן החוטים דרך הצינורות מדריך באמצעות מלקחיים.
3. רצועת 6 בידודי אמייל בסדר נחושת מליטה חוטים (כ 5 מ מ אורך) של חוט הארקה (כ 2-3 ס"מ) באמצעות אזמל לגרד את הבידוד בשני הקצוות. לכל אותם כדי הפינים nanoconnector.
4. להתחבר לכל חוט מליטה תיל טונגסטן אחד באמצעות טיפה אחת של צבע מוליך כסף, בהתאמה. בוא יבש במשך לפחות 30 דקות.
5. למרוח כמות מינימלית של מלט כדי לכסות את החוטים. אל תחיל מלט עם החוטים טונגסטן, אשר יתווסף על רקמת המוח או על החלק העליון של nanoconnector. תן הבטון להתייבש במשך לפחות 30 דקות.
6. ביצוע של החתך זוויתי (5-20°) החוטים טונגסטן באמצעות מספריים מפלדת בוטה כדי לאפשר אמין השרשה של חוטים מתחת או מעל האזור הסמוך ventrally pyramidale הרובד, איפה תטא משרעת נמוכה מדי עבור הערכת של נאמנות entrainment.
7. Deinsulate העצה (כ 2 מ מ) של החוט הקרקע באמצעות אזמל לגרד משם הבידוד. להתייחס אליו עם שטף, presolder.
8. בדיקת פוטנציאל קרוס-שיחות בין אלקטרודות באמצעות דיגיטלי multimeter. כדי לעשות זאת, להתחבר סיכות מחבר multimeter, אשר חייב להיות מוגדר מצב מדידת התנגדות. בדוק pairwise שילובים של ערוצי; קריאה על multimeter מתחת 5 MΩ מציין משמעותי צולבות לדבר.
9. בדוק את אימפדנס של כל אלקטרודות מלוחים באמצעות מד עכבת. ערכי עכבה אופיינית הן מתחת 100 kΩ.
10. כדי להקל על ההשתלה, דבק סיבים אופטיים אחד למערך חוט כך הקצה של סיבי הוא ברמה של החוט הקצר הטיפ סיבים הוא קרוב, אבל לא נוגע את החוטים טונגסטן. לשמור על הזווית של סיבי קטן ככל האפשר על מנת למנוע נזק לרקמות במהלך ההשתלה.
    הערה: ראה גם הפניה למעורר ⁶² להרכבת מערכים תיל טונגסטן.

4. השתלות stereotaxic

1. ביצוע הכנות כמתואר בצעדים 1.6-1.13.
2. להסיר את רקמת החיבור מהחלק העליון של הגולגולת, לדחוף למטה שרירי הצוואר ביסודיות על ידי כ 2 מ מ כדי למנוע חפצים השריר במהלך ההקלטה.
3. לנקות את הגולגולת באמצעות צמר גפן-טיפ המוליך תמיסת מלח, קודחים חורים 4 (2 בחזית) ו- 2 לעיל המוח הקטן, בקוטר 0.8 מ מ למקם ברגים מפלדת עצם (00-96 x 1/16) עבור קרקע וייצוב של השתל (איור 1D). מקם את הבורג הקרקע, מחובר חוט הנחושת אחד (כ 2-3 ס מ אורך) מעל המוח הקטן.
4. לכסות את הקרקע-בורג לחלוטין עם מלט כדי למנוע חפצים השריר במהלך ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לבנות טבעת מלט חיבור כל הברגים (איור 1E).
5. בצע ניתוח של פתיחת גולגולת מעל הצד השרשה (היפוקמפוס, AP-1.94, L 1.4, V 1.4 בהקשר bregma). החל כ 5 µL של NaCl סטרילי על פני השטח של רקמת המוח.
6. הורידו לאט את המערך תיל באמצעות stereotaxis הניתוח. להקלטות אוניטרי, שתל סיליקון החללית במקום מערך תיל⁶³; על מנת למנוע optoelectric חפצים קלים, שתל סיבים אופטיים בנפרד בהיפוקמפוס עם קצה סיבים לא ישירות מול המכשיר (איור 1C -אני). לחקירה של התיאום של entrainment בין ההמיספרות, שתל של סיבים אופטיים נוספים באזור contralateral hippocampal CA1.
7. החל כ 5 µL של שמן חם שעווה/שמן פראפין, טרופה-70 ° C, עם מזרק מעל אתר ההשתלה כדי להגן על רקמת המוח.
8. החל הבטון סביב המערך תיל, לכסות את הגולגולת עם מלט.
9. חלות טיפה אחת של השטף הקרקע presoldered/הפניה מכשיר. ההאזנה ועל החוט presoldered מחובר הבורג הקרקע למשל באמצעות מחט, הפתיל את הרשת בעזרת מכונת הלחמה.
10. מכסה את כל פני הקרקע החוט עם מלט.
11. לנהל mL 0.3 Erycinum (1:4 בתוך סטרילי NaCl), carprofen (5 מ"ג/מ"ל) i.p. אחרי ניתוח לפחות שני הימים הבאים. העכבר בדרך כלל מתעורר בתוך 15 דקות לאחר ניתוח. חממו את החיה עם מנורה אדומה כדי להאיץ את ההחלמה.
12. לפקח על המשקל של העכבר מדי יום במשך השבוע הראשון שלאחר הניתוח, או עד המשקל יציב. אובדן משקל לא יעלה על 10% ממשקל העכבר הוקלט לפני הניתוח. כדי להאיץ ייצוב של משקל, לספק את העכבר עם מזון רטוב ולא החלב המרוכז בימים הראשונים שאחרי הניתוח.
13. כדי להקליט את פעילות תאית בהיפוקמפוס במהלך entrainment, שתל מכשיר בדיקה סיליקון בהיפוקמפוס (AP-1.94, L 1.4, V 1, עם הפחתת עוקבות) כפי שמתואר הפניה למעורר ⁶² (איור 1C -אני). שתל סיבים אופטיים בהיפוקמפוס מוקשי-3, L 1.4, V 1.6, סימטרית-rostral 39 °. שתל של סיבים אופטיים נוספים ב- MS (AP +0.98, L 1, V 3.9, לרוחב 15 °) אם גירוי של תא somata רצוי.

5. Optogenetic גירוי ורכישה נתונים אלקטרופיזיולוגיות

1. Habituate בעכבר כדי הגדרת הקלטה (למשל, הפעלות 15 דקות, 1-2 הפעלות ליום למשך 3 ימים). לבחון התנהגות החיה לפני תחילת הניסויים הראשונים. אם העכבר זז בבית הבליעה, לחקור את הסביבה, מרחרח, ביצוע rearings, וכדומה, להתחיל את ההפעלה הניסיונית הראשונה.
2. מקם את העכבר תא מוכר בהיעדרו של בעלי חיים אחרים באותו חדר.
3. צרף LED אל הבמה-הראש באמצעות דבק קלטת כדי לעקוב אחר המיקום של החיה. ודא כי נורית ה-LED הוא נלכד על ידי המצלמה לאורך כל תקופת כי החיה בוחנת את התא הקלטה לפני תחילת הניסויים. שיא בחושך כדי לעקוב אחר נורית ה-LED. הצב מצלמה מעל לחדר ההקלטה.
4. בדוק את פלט אור מן החוט תיקון. מעריכים את פלט אור מהקצה סיבים לאחר חיבור בהתאם קצב השידור של סיבי מושתל. ודא כי תפוקת האור מהקצה של הסיבים בין 5-15 מגוואט, כדי לאפשר entrainment אמין.
5. חבר את מגבר קדם headstage למחבר מושתל באופן כרוני. לחבר את כבל תיקון סיב אופטי סיבים בהיפוקמפוס כרוני מושתל לניסויים גירוי optogenetic. בניסויים גירוי אור שליטה, לחבר סיבים אופטיים ferrule דמה מחובר האוזנייה.
6. הנח את העכבר בתא ההקלטה.
7. פתח את התוכנה כדי לשלוט הגנרטור גירוי ליצירת פרוטוקול גירוי.
8. בחרו בערוץ השולט הלייזר 473 DPSS ננומטר. בשורה הראשונה הזן 3,000 mV (עמודה ראשונה), זמן 30 ms (עמודה שנייה), הערך 0 mV (בעמודה השלישית), זמן 112 ms (עמודה רביעית), שורה 840. אני חוזר, קבוצה 1. אני חוזר, כדי ליצור פרוטוקול למשך 2 דקות של 7 הרץ גירוי עם פולסים ארוך 30 ms. התאם את משך זמן בעמודה הרביעית, מספר החזרות שורה אם הגירוי בתדר אחר או משך שונה נדרשת. ב- mW בחר 0 השורה השנייה (עמודה ראשונה), הגיע הזמן 500 h (עמודה שנייה), שורה חוזר 1 וקבוצה חוזר 1, על מנת להבטיח כי הלייזר להיות כבוי לאחר פרוטוקול גירוי הסתיים.
9. לחץ על "קובץ > שמירה בשם" ולשמור את הקובץ בשם הרצוי.
10. להבטיח כי אחד האביזרים המקובלים לגירוי TTL פלט מפעילה את הלייזר מחובר ללוח לינקס דיגיטלי אנלוגי קלט כדי לסנכרן את רכישת אלקטרופיזיולוגיות ונתונים optogenetic.
11. לחלופין, כדי פרמטרית להסדיר ההשתנות של תדר תנודה תטא, החל רכבות של להבזקי האור שונים במרווחים הבין-דופק, עם התפלגות Gaussian חוורמה. לשנות את הפיזור של מרווחי זמן בין הדופק עבור פרוטוקולים שונים, למשל, משלב 3.2 עד 15.1 ms². החל פרוטוקולים אלה כדי ליצור תטא שהשרתים עם השתנות שונים של תדר תטא (איור 6).
12. פתח את התוכנה של מערכת הקלטה. לחץ על "ACQ" לרכוש ולגני שעשועים "" כדי להקליט. רגע לפני תחילתן של גירוי קל לתעד את ההתנהגות הבסיסית (למשל, 2 דקות כדי לאחזר מהירות בסיסית או 30 דקות כדי לחלץ את השדות המקום בסיסית).
13. פתח את התוכנה כדי לשלוט הגנרטור הגירוי. לחץ על 'קובץ > פתח' ובחרו קובץ פרוטוקול של הבחירה. לחץ על הורד, התחל"ליזום את גירוי האור.
    הערה: יבדקו את הניסוי, והתחלתי הגירוי בעזרת שלט רחוק; מספר זה אינו כולל את השפעת נוכחותו של הנסיין על ההתנהגות של החיה. בהתאם המטרה של המחקר, גירוי יכול להיות יזם, הסתיים במהלך התנהגויות ספציפיות.

6. בגישה משולבת עבור Optogenetic Entrainment וניגוד הקרנה ספציפיים של הפלט בהיפוקמפוס

1. אקספרס ChR2 בתאים MS GABAergic של PV-Cre עכברים, כמתואר בסעיף 1.
2. בנוסף, להזריק סך של 2.4 µL של CamKIIα תלויה halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) בשתי ההמיספרות בהיפוקמפוס הגבי (AP-1.7; L ± 1.05; V-2.05 ו- 1.4 מ"מ; AP-1.7; L ± 1.7; V-2.05 ו- 1.55 מ מ; AP-2.3; L ± 1.5; V-2.2 ו- 1.3 מ מ; AP-2.3; L ± 2.2; V-1.65 ו- 2.45 מ מ).
3. לאפשר 6 שבועות של ביטוי זמן.
4. שתל מערך תיל טונגסטן עם סיבים אופטיים באזור hippocampal CA1, כמתואר בסעיף 4. בנוסף, שתל דו צדדיים למרחקי מחצה לרוחב (LS, AP 0.1, L 0.25, V-2.25 מ מ ו- AP 0.5, L.-0.3, V-2.7 מ"מ).
5. ביצוע ניסויים תטא optogenetic של entrainment כמתואר בצעדים 5.4-5.5.
   1. עבור עיכוב סימולטני של פלט בהיפוקמפוס LS, ליצור דור גירוי פרוטוקול: לדוגמה, המפעיל התחלתה של ערוץ הפלט מחובר ה s 593 של 15 הלייזר DPSS ננומטר עם דופק רציף מתמשך סה כ 45 s, לפני מפעילה פלט פעימות הלייזר 473 DPSS ננומטר.
   2. לחבר שני סיבי? האם דרך מיתרי תיקון באמצעות מצמד כינוייהם סיבים אופטיים ללייזר DPSS ננומטר 593.
   3. להתחיל את ההקלטה להוריד, להפעיל את פרוטוקול כדי לשלוט הדור הגירוי.

7. עיבוד נתונים

1. להמיר את האותות אלקטרופיזיולוגיות ומקם את מידע המעקב עם נתונים Neurophysiological (ND) למנהל תבניות. dat ו- .pos, בהתאמה⁶⁴.
2. להשיג את LFP נמוך לעבור סינון, ולמטה דגימה של אותות פס רחב עד 1,250 הרץ באמצעות מנהל ND⁶⁶.
3. כל הקלטה, בחר את הערוץ עם משרעת מקסימלי של תטא תנודות (באמצעות Neuroscope)¹⁹.
4. לאתר חותמות הזמן של פעימות לייזר ושל שהשרתים של גירוי עם סף גילוי אלגוריתם (באמצעות MATLAB פונקציה findpeaks.m או דומה)¹¹.
5. כדי לייבא את הקובץ. dat תוכנת ניתוח נתונים רב ערוצית, לחץ על "קובץ > יבא", בחר "קבצים בינאריים" כסוג הנתונים ולאחר בחר את הקובץ. dat. בתיבת הדו-שיח ' תצורה ', הזן את המספר הנכון של ערוצים, קצב הדגימה של 1,250 הרץ, לחץ על "ok" ולאחר לשמור כקובץ .smr. מגרש ספקטרה כוח על-ידי בחירה "ניתוח > חדש תוצאה תצוגה > PowerSpectrum". הגדרות, בחר את הערוץ את משרעת תטה הגבוהים וגודל FFT 16,384, לחץ על "חדש", מגדירים "שעת ההתחלה" תחילתה של התקופה גירוי וכן "אחרית הימים" הסוף של גירוי אפוק, ולחץ "תהליך".
6. לחשב את הנאמנות entrainment כיחס של צריכת החשמל המצטברת ספקטרלי צפיפות (PSD) בטווח תדר גירוי optogenetic (גירוי תדירות ± 0.5 הרץ) PSD המצטבר בלהקה תטא (5-12 Hz) בשיטה multitaper (NW = 3, גודל חלון 8,192) בשביל שהשרתים s 10 (לדוגמה, ערכת הכלים < http://chronux.org/>).
7. אל תכלול שהשרתים הקלטה איפה הפסגה PSD דומיננטי ≤ 5 הרץ מניתוח (שהשרתים-תטה, באמצעות MATLAB פונקציה find.m).
8. על מגרש על הרסטר הספקטרום כוח LFP כל שהשרתים מוקלט על פי נאמנות מחושבים entrainment (באמצעות MATLAB פונקציות sortrows.m pcolor.m). לטעון את הכוח ספקטרה ואת entrainment נאמנות על-ידי לחיצה על 'קובץ > פתח', המאוחסנים הכוח סוג המשתנה in. = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

פילוח של ChR2 לתאים GABAergic MS כמתואר בסעיף 1 מודגם באיור2 א. Optogenetic גירוי של אקסונים של MS GABAergic תאים בהיפוקמפוס הגבי באמצעות סיבים אופטיים אשר הוא מושתל מעל אזור CA1 entrains תטא תנודות בתדר של הגירוי, חולשת (איור 2B) כמו גם contralateral האונה (איור 2C). תטא תנודות יכול entrained יותר או פחות ביעילות על ידי גירוי optogenetic (איור 3 א), היעילות של אשר היה שחושב עבור כל התקופה הקלטה כמו תטה יחסי כוח LFP סביב התדירות גירוי, קרי, entrainment נאמנות (איור 3B). Entrainment אמינות מעל 0.3, קרי, גבוה יותר מאשר בהקלטות ספונטנית אור-off, נצפתה כ-80% שהשרתים ההקלטה. Optostimulation בתדרים שאינם-תטה היה פחות יעיל (איור 3C).

מפורשת כלומר, מניפולציה פרמטרית התנודות תטה בתדירות מלווה שינויים מתהווים של תטא סדירות: קבוע הטמפורלי של משרעת והתדירות של תנודות תטא היה גדל במהלך תקופות עם גבוה נאמנות entrainment. יציבות התנודות יכול גם להיות מוסדר פרמטרית על-ידי החלת רכבות של להבזקי האור, תקופות אשר בצע הפצות גאוסיאנית עם דיספרסיות שונים (איור 4).

Optogenetic שליטה על תדירות תנודות חיסלה את המתאם בין תדר תטא מהירות הריצה, מסכים עם הפקד תדירות באמצעות MS לפי בסדר עולה afferents במהלך התנועה (איור 5A). Optostimulation המושרה גם תטא תנודות במהלך פקקת (איור 5B). שלבי הירי מועדף הקליטה באזור CA1 בתאים כפירמידה בשם, interneurons היו ללא שינוי ביחס תנודה תטה optogenetically entrained בהשוואה ספונטנית תטא (איור 6).

ללמוד את התרומה של ההיפוקמפוס כדי מסלול מחצה לרוחב בתקנה בתיווך תטה של גפיים, אנחנו optogenetically עכבות מסלול זה. היה Halorhodopsin (eNpHR3.0) בשני הצדדים הביעו בתאים כפירמידה בהיפוקמפוס (איור 7 א), ואילו ChR2 בא לידי ביטוי ב- MS GABAergic תאים מעל והיו תטא תנודות optogenetically entrained, (איור 7 ב). Entrainment תטא מופחתת השתנות של הפעלת מהירות אך לא מתי בהיפוקמפוס אל השביל? האם היה עכבות (איור 7C).

איור 1: איור של סיבים אופטיים, אלקטרודות, ניתוח. (א) איור של סיבים אופטיים. (B) איור של מערך תיל מודבקים על סיבים אופטיים עבור ההקלטה של LFP בהיפוקמפוס במהלך entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס. (ג) עבור הקלטה של הפעילות התאית בהיפוקמפוס, מכשיר בדיקה סיליקון הוא רכוב על microdrive. (ד) מיניאטורי הברגים הממוקמים על הגולגולת. חוטי נחושת הם presoldered את הבורג הקרקע ועיון לפני והצב אותן מעל המוח הקטן. מלט (E) מוחל על מכסה וחבר את הברגים. העיגול הכחול העליון מציין היכן הניתוח בוצע עבור ההשתלה של החללית סיליקון. העיגול הכחול התחתון מציין היכן הניתוח בוצע עבור ההשתלה של סיבים אופטיים בהיפוקמפוס. סיבים אופטיים (F) אחד הוא מושתל בזווית של סימטרית-rostral כדי להתמקד באזור hippocampal CA1. יכול להיות קטנטנים בד השני מחצה המדיאלי אם גירוי של תא somata רצוי (לא חובה). בדיקה (G) שהסיליקון הוא הוריד את בדיוק מעל באזור hippocampal CA1. (H) הגבולות של microdrive, מחבר ביצרו את השתל, הקרקע, החוטים הפניה הם מולחמים. (אני) נחושת רשת הוא נבנה כדי להקיף את השתל ולשמש כלוב פאראדיי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הכנה optogenetic תטא בהיפוקמפוס entrainment. ChR2 (א) בא לידי ביטוי בתאי PV+ המדיאלי במחיצה הבין-פרוזדורית PV-Cre עכברים (ערכה העליון). קרינה פלואורסצנטית בהיר ב MS (1, 2) מאשר מוצלחת לבנות ביטוי somata. MS סיבי פרוייקט באמצעות fornix (נ), fimbria (fi) בהיפוקמפוס (3-6); aca: commissure הקדמי; חלקה הקדמי. HDB: גרעין של האיבר אופקי של הלהקה אלכסוני; או: שכבה oriens. סיבים אופטיים לגירוי optogenetic עם אור כחול הוא מושתל מעל שכבת כפירמידה באזור hippocampal CA1 (ערכה נמוכה יותר). גודל ברים: 500 מיקרומטר (תמונות 1, 3, 4) ו- 50 מיקרומטר (תמונות 2, 5, 6). (B) LFP בהיפוקמפוס במהלך תנודות תטא ספונטנית (משמאל) ו- 7 הרץ (באמצע) או 10 הרץ (מימין) optogenetic entrainment. פסים כחולים מציינים את חלונות הזמן יישום קל. הערה שלב אפס על-ידי הפולס אור מסומנים בחץ. הערה גמא מעטפות במהלך ספונטנית, entrained תטא, מחוון קצב תטא פיזיולוגיים. שלב היפוך בין הרובד oriens (str. או.), שכבה radiatum (str. rad.) נשמר גם בתקופת entrainment. Entrainment (ג) אמינה במהלך חולשת (מגרשים העליון), כמו גם contralateral (מגרשים התחתונה) optogenetic גירוי. ערכות להמחיש עמדות של סיבי כבוד לעמדות אלקטרודות. דוגמה עקבות LFP במהלך תטא ויישום של להבזקי האור מוצגים באמצע. בצד הימין, חשמל ספקטרום של LFP בהיפוקמפוס במהלך ipsi - ו contralateral גירוי מקודדים לפי תדירות גירוי. איור זה השתנה מ הפניה למעורר 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: אמינות optogenetic תטא בהיפוקמפוס entrainment. (א) דוגמה LFP בהיפוקמפוס רשמים במהלך נאמנות entrainment נמוך וגבוה. (B) כוח צפיפות ספקטרלי של 10 s שהשרתים במהלך תטה ספונטנית, עם שורות מסודרות לפי מובילים תדר תטא (משמאל), ובמהלך 10 הרץ גירוי optogenetic (מימין), עם שורות מסודרות לפי entrainment נאמנות ו 7 הרץ (באמצע). דוגמה בהתאמה כוח ספקטרה (מסומן על ידי חץ) מותוות לעיל. שימו לב entrainment אמין נאמנות על-פני תקופות. בצד הימין, מוצג ההסתברות המצטברת של נאמנות entrainment לתדרי תטא. Entrainment (ג) דורש גירוי קצבי תטא. פעילות רשת בהיפוקמפוס יכול להיות בהצלחה entrained באמצעות תדרים בין 6-12 הרץ. בתדרים נמוכים (למשל, 2 או 4 הרץ) או גבוה יותר entrainment תדרים (למשל, 20 הרץ) הוא לא אמין. איור זה השתנה מ הפניה למעורר 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: מניפולציה פרמטרית של תטא תנודות סדירות. (א) גירוי הוחלה בתדרים שונים בטווח תטא עם תדירות אכזרי של הרץ 7.8 בעקבות התפלגות גאוסיאן. סטיית התקן של המרווחים הבין-הדופק היה גדל על פני פרוטוקולים σ = 3.19 כדי σ = 15.09. בסך הכל, פרוטוקולים 11 שנוצר, חלה, כל אחד עם סה כ משך התקופה גירוי של 1 דקות. מאלה, התפלגות ההסתברות של פרוטוקולים 5 מוצגים בצד השמאלי של האיור. כוח הצפיפויות ספקטרלי בטווח של 1-14 הרץ של LFP בהיפוקמפוס במהלך היישום של הפרוטוקולים בהתאמה מותוות באמצע הדמות. ההסתברויות של התקופות תטא במהלך היישום של הפרוטוקולים בהתאמה מומחשים בצד הימין. (B) השונות של אפלייד הדופק בין מרווחי נחוש השונות של תקופת בו-זמניות תטא (r פירסון = 0.94, p = 0.0002). (ג) הקשר בין ההשתנות משרעת תטה את הבין-הדופק מרווח (r פירסון = 0.61, p = 0.08). דמות זו שונתה הפניה למעורר 70. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: Optogenetic תטא entrainment אומנותית קובע LFP בהיפוקמפוס במהלך התנהגות. (א) Optogenetic גירוי התדר נקבע תדר תטא במהלך ומכניקה. לפיכך, afferents הקשורות מהירות לא משפיעים תדר תטא בהיפוקמפוס, כתוצאה מכך, מהירות היא לא בקורלציה עם תדר תטא (כחול) כפי שהוא במהלך ספונטנית תטא (שחור). הנתונים מוצגים אומר ± s.e.m. (B) בזמן ערנות שקטה, יכול להיות elicited של תטא בהיפוקמפוס בהיעדר תנועה. עקבות LFP בהיפוקמפוס לפני ובמהלך entrainment מוצלח מוצגים לעיל, לדוגמה מהירות עקבות שנרשם במהלך entrainment מוצגים להלן (הסימן האדום מתאים המעקב LFP בהיפוקמפוס המתואר לעיל). פסים כחולים לסמן את חלונות הזמן גירוי אור פולסים. איור זה השתנה מ הפניה למעורר 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: פעילות תאית בהיפוקמפוס במהלך תטא entrainment. פעילות תאית (A) הוקלט באמצעות סיליקון רגשים (ערכה). Interneurons יחיד ותאים כפירמידה היו מבודדים, מזוהה על פי צורת גל המתאימים שלהם. המוצג כאן הוא ממוצע waveform (באמצע) auto-correlogram של תא כפירמידה מבודד דוגמה. (B) מועדפת שלב השחרור של תאים כפירמידה (Pyr) היה לא שונה במהלך ספונטנית (ב n שחור, = נוירונים 29) ו optogenetically entrained (בכחול, n = 30) תטא (p = 0.79). (ג) מוצג כאן היא האוטומטית-correlogram (משמאל) ושלב ירי מועדף interneuron ירי מהיר במהלך ספונטנית, optogenetically entrained תטא. להלן המתאים בהיפוקמפוס LFP קצב במהלך ספונטנית (משמאל) ועל תטא (מימין) entrained. (D) מועדפת שלב השחרור של ירי מהיר interneurons לא היה שונה במהלך ספונטנית (בשחור) ו optogenetically entrained (בכחול, n = נוירונים 28) תטא (p = 0.97). ממוצע אוטומטי-correlogram מוצג בצד השמאל. (E) אוטומטית ממוצעת-correlogram str. oriens תאים. (F) מועדפת שלב השחרור של str. oriens interneurons היה לא שונה במהלך ספונטנית (שחור), optogenetically entrained (כחול, n = 10 נוירונים) תטא (p = 0.56). היסטוגרמות פריקה המועדפת השלבים מוצגים בצד הימין. (G) ירי ממוצע המחירים לא הושפעו על ידי תטא entrainment בתאים כפירמידה (p = 0.98), ירי מהיר interneurons (p = 0.96) או str. oriens interneurons (p = 0.85). איור זה השתנה מ הפניה למעורר 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7: שילוב של תטא בהיפוקמפוס entrainment ו- optogenetic עיכוב של בהיפוקמפוס subcortical פלט את חושבת. (א) eNpHR3.0 (halorhodopsin) בא לידי ביטוי בתאים כפירמידה בהיפוקמפוס (ערכה העליון). ביטוי מוצלח של הבונה אושר על-ידי קרינה פלואורסצנטית בהיר somata בהיפוקמפוס (תמונות העליון), אקסונים ב האם (תמונות נמוכה יותר). סיבים אופטיים היו מושתלים דו צדדיים מעל האם (ערכה התחתון). גודל ברים: 500 מיקרומטר (תמונות בצד השמאל), 50 מיקרומטר (תמונות בצד הימין). תטא בהיפוקמפוס (B) בהצלחה entrained במהלך עיכוב של ההיפוקמפוס כדי? האם מסלול. כאן מוצגות כוח צפיפויות ספקטרלי לגירוי אור כחול 9 הרץ במהלך פלט עיכוב. (ג) עיכוב של מסלול מרכזי פלט subcortical בהיפוקמפוס מונע תופעות של תטא בהיפוקמפוס entrainment על המהירות. המוצג כאן הוא ירידה השתנות מהירות על entrainment optogenetic (לבן בר עם פס כחול), עם נעדר על עיכוב סימולטני של ההיפוקמפוס כדי? האם מסלול (סרגל צהוב עם פס כחול). מהירות בסיסית ממוצע המתאים מוצג בצד השמאל. איור זה השתנה מ הפניה למעורר 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.