חולדה מודל מרכזי עייפות בעזרת ששונה שיטת פלטפורמה מרובים

סיכום

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להציג מודל עכברוש של מרכזי עייפות בעזרת שונה פלטפורמה מרובים שיטה (MMPM).

תקציר

במאמר זה הצגנו מודל עכברוש של מרכזי עייפות בעזרת שונה פלטפורמה מרובים שיטה (MMPM). תיבת מרובים פלטפורמה תוכנן כמו מיכל מים עם פלטפורמות צר על החלק התחתון. העכברושים דגם היו לשים לתוך הטנק, עמד על הבמות במשך 14 h (18:00-8:00) ליום 21 ימים רצופים, עם קבוצת בקרה הריק להגדיר עבור חדות. בסוף מידול, חולדות בקבוצה מודל הראתה ברור מראה עייף. כדי להעריך את הדגם, ביצענו מספר בדיקות התנהגותית, כולל במגרש הפתוח (למוד), לבחון את גבוהות פלוס מבוך (EPM) בדיקה של הבדיקה ממצה שחייה (ES). התוצאות הראו כי חרדה, ליקוי קוגניציה מרחבית, עניים שריר ביצועים ולאחר שנדחתה פעילות התנדבותית הציג בחולדות דגם לאשר את האבחנה של עייפות המרכזית. שינויים של המוליכות העצבית המרכזית גם לאמת את התוצאה. לסיכום, המודל בהצלחה מדומה עייפות המרכזית ולאחר מחקר עתידי עם המודל עשוי לעזור לחשוף את מנגנון פתולוגי של המחלה.

מבוא

עייפות היא אחד הגורמים העיקריים המאיימים על בריאות האדם¹. בעשרות השנים האחרונות, מחקרים שונים הוכיחו כי עייפות הוא המופעלות באופן עקיף אבל מונחה מרכזי, תמיד מלווה עם הפרעות רגשיות, קוגניטיביות. פיזיולוג איטלקי א Mosso הציע לראשונה את המילה עייפות מרכזית². זה מוגדר בדרך כלל מוגבל פעילות התנדבותית, קוגניציה ירידת ערך עקב תפקוד לקוי של הדחף התמסורת של מערכת העצבים המרכזית (CNS)³. לעומת עייפות שרירים היקפית, עייפות המרכזי מדגיש שינויי מערכת העצבים, כמו גם בהפרעות רגשיות/התנהגותיות הסוגר כולל דיכאון, חרדה, קוגניציה ליקוי של אובדן זיכרון. מחקר אחד מראה כי גורמים רבים יכול לגרום עייפות המרכזית, בין אילו פעילות פיזית מוגזמת, מתח נפשי הם די הכרחית⁴. באשר בפתוגנזה, תיאוריות כמו טריפטופן-kynurenine מסלול השערה⁵ מסבירות שינויי מסלולים מסוימים; עם זאת, מחקרים מעמיקים יותר נדרשים עדיין לחשוף את מתאמים המרכזי-ההיקפית של עייפות המרכזית.

כמו המנגנון הבסיסי של עייפות המרכזי הוא עדיין לא ברור, במודל חיה יעיל הוא די חשוב למחקר נוסף. הדגמים עייפות הקיימים הם בעיקר המושרה על ידי פעילות גופנית מוגזמת, כמו הליכונים⁶ ו שחייה שנטענו משקל⁷, עם חשש קטן על גורמים נפשיים. כדאי לדמות הפיתוח של מרכזי עייפות, הקבוצה שלנו פיתח מודל עכברוש עם MMPM. במהלך התהליך מידול, חולדות יישאר לעמוד על פלטפורמות צר בתיבת פלטפורמה מרובות במשך שעות ארוכות כולל חלק הזמן לישון. שונים של פעילות גופנית מוגזמת מודלים, המודל MMPM משתמש מניעת שינה חלקי כגורם נפשי תמורת זה מורכב בפתוגנזה של עייפות המרכזית.

מודל הערכה, אנו משתמשים הבדיקות OFT ו- EPM לקבוע חרדה רוח ואת פעילות התנדבותית. הבדיקה ES מבוצע כדי למדוד את ביצועי השרירים ההיקפיים. בנוסף, אנו לקחת את המוח של החולדה, לזהות דופמין (DA) / סרוטונין (5-HT) בתוכן שני hypothalamuses לבחון את ההבדלים נוירוטרנסמיטר מרכזי.

פרוטוקול שיובאו להלן נועד המודל המרכזי עייפות המושרה על ידי פעילות גופנית חוזרת ונשנית, חוסר שינה, מחקה מצב שכיח בחיי האדם. עם זאת, על-ידי התאמת משך מודל, זה יכול לשמש בתחומים רבים אחרים, כמו מחקרי תצפית ומתח שינה. בעתיד מחקר, אנו מקווים כי מודל זה יעזור לגלות עוד שינויים CNS וקשריהם עם מערכת היקפיים, כדי לחשוף את המנגנון הפתוגנזה של עייפות המרכזית.

פרוטוקול

כל החיות היו מתוחזק בהתאם להנחיות על ידי החקיקה הסינית על השימוש אתית, טיפול של חיות מעבדה.

1. מידול טרום הכנה

1. הכנת המעבדה
   1. הפעל את מנורת UV במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי.
   2. בקרת הטמפרטורה במעבדה ב 25 ± 3 מעלות צלזיוס, והלחות היחסית סביב 30%.
   3. להפעיל את המעבדה אור בשעה 6, תכבה את האור בשעה 18:00 להקים מעגל/כהה 12 h/12 שעות.
2. פלטפורמה מרובים תיבת בנייה
   1. לבנות מיכל פלסטיק אטום ללא כיסוי של 110 × 60 × 40 ס מ³.
   2. תקן 15 פלטפורמות מעגלית (h = 8 ס"מ, d = 6.5 ס מ) על החלק התחתון של הטנק, סניטר להפיץ שלוש שורות ועמודות חמש. להשאיר מספיק מקום בין כל פלטפורמה, בערך 10 ס מ בין טורים או 13 ס מ בין שורות.
   3. הגדר פורקן מים על הצד הלטראלי של הטנק, להתקין ברז.
   4. הופכים שער ברזל-חוט אחר תנועותיהם לטנק עם קופסת האוכל תלוי על זה.
3. קיבוץ וחולדות דיור
   הערה: חולדות זכרים Wistar של בן, 8 שבועות, במשקל של 200-210 g, משמשים את הניסוי. העכברושים חיים בקבוצות במהלך תהליך דוגמנות.
   1. מספר הזנב שורשים של החולדות עם עט מרקר.
   2. שוקל את החולדות לא לכלול את קלות או כבדות במיוחד, חלק את השאר באופן אקראי לקבוצות מודל ושליטה.
   3. לשים את החולדות בעדינות לתוך הכלובים נקי ולאפשר להם להסתגלות למעבדה לפחות 3 ימים. מספקים מספיק מים, אספקת המזון.

2. מידול עם MMPM

הערה: התהליך מתחיל בשעה 18:00 ומסתיים ב-8 בבוקר למחרת, עבור סכום כולל של 14 שעות ביום, במשך 21 ימים. כדי למנוע הפרעה גורמים, האדם נדרש לבצע את הניסוי כולו, כשאתה לובש אותו המעבדה. 10 חולדות Wistar משמשים את הניסוי.

1. מניחים את הטנק על משטח שטוח, למשל, על הרצפה. ואז למלא את המיכל בערך 7 ס מ של מים חמים (25 ± 3 ° C), כ- 1 ס מ מתחת פלטפורמת שטוח.
2. להכין מספיק אוכל ושתייה וכל העכברים למיכל עבור יום אחד. להכניס תיבת מזון למספוא ומים ולתלות אותו על השער.
   הערה: כמה עכברים חכם ללמוד על תיבת האוכל. אם כך, להסיע אותם בחזרה לתוך הטנק.
3. לקחת את החולדות קבוצה דגם הכלוב, לתפוס אותם על ידי הזנב, לשים אותם בעדינות לתוך הטנק. ההשקה כל העכברושים במים במקום פלטפורמות להמריץ את הפחד של מים. ודא כי כל עכבר מקבל פלטפורמה לעמוד עליה, בעוד חולדות של קבוצת הביקורת נשאר בכלובים המקורי שלהם עם מספיק אוכל ומים.
4. מכסה למיכל. נטר את החולדות כדי למנוע מהפציעה. אם עכבר נשאר במים למשך יותר משעה בלי לטפס על הפלטפורמה, תוציא את זה למיכל ולהסיר אותו מן הבחינה.
5. לאחר 14 h, לקחת את החולדות דגם מהמיכל, תייבשי את השיער שלהם עם מייבש. לסמן מחדש זנבות של החולדות אם זה נמוג. להחזיר את החולדות לכלובים המקורי שלהם ולספק להם מספיק אוכל ומים.
6. פלאש בכל פינה של הטנק. לרומם בצד אחד של הטנק, לפתוח את הברז כדי outflow את השפכים.
7. לחטא את המיכל עם 75% אתנול תרסיס, לחשוף אותם בפני האור האולטרה סגול.

3. דגם: התנהגותית מבדק

הערה: כל הבדיקות מבוצעות במעבדה התנהגותית. רעש, אור נוסף אסורה במהלך הבדיקה כדי למנוע הפרעה. במידת האפשר, השתמש את המשתמשים מקבלי אותו לערוך כל בדיקה. מעיל כהה וכפפות נדרשים עבור זיהוי סולם אפור בעיבוד תמונה. לבצע את OFT תחילה שכן יש לפחות. ההשפעה על ההתנהגות חולדה.

1. למוד
   1. בדוק את ההקלטה מעל תיבת שדה פתוח כדי לוודא זה מחובר כהלכה לתחנת העבודה ועוסק בכל פינה של התיבה. להתאים את התאורה לחסל צללים בתיבה.
   2. להעביר את החולדות למעבדה התנהגותית בכלובים המקורי שלהם. לאפשר להם להסתגלות במשך לפחות שעה לפני המבחן.
   3. לנקות, לנקות את התיבה עם 75% אתנול כדי להבטיח כי אין צואה או הריח נשאר מהניסוי הקודם.
   4. להסיר את חולדה מן הכלוב על ידי הגב והניחו אותה בעדינות לתוך האזור המרכזי של התיבה. במהירות נסיגה האצולה מהתיבה כדי לא לחסום את הזריקה.
   5. קלט המספר של החולדה, להתחיל בהקלטה. לספור ולהקליט את התדירות של פעילויות אנכי של החולדה, כולל גידול וטיפוס.
   6. לאחר 5 דקות, לעצור את ההקלטה, קח את החולדה מחוץ לקופסה, להחזיר אותו לכלוב.
   7. חזור על שלבים 3.1.3 - 3.1.6 עד כל העכברושים סיימו את המבחן.
2. EPM
   1. בצע את השלבים שלפני הסימון, להתאקלמות באשר OFT (שלבים 3.1.1 - 3.1.2).
   2. להסיר את חולדה מן הכלוב על ידי גבו ושם אותה בעדינות על החלק צומת של שתי זרועות. להנחית את החולדה לכיוון הזרוע השמאלית פתוח ולעזוב במהירות כדי לא לחסום את הזריקה.
   3. קלט המספר של החולדה, להתחיל בהקלטה. לספור ולהקליט את התדירות של הזרוע שונים כניסות. אם החולדה יוריד את המבוך במבחן, תרים אותו ולשלוח אותו למבוך. להקליט מידע מפורט עבור ניתוח נתונים.
   4. לאחר 5 דקות, לעצור את ההקלטה, קח את החולדה החוצה, להחזיר אותו לכלוב.
   5. הסר את הצואה, לנגב את המבוך עם 75% אתנול לחסל את הריח של חולדה לשעבר.
   6. חזור על שלבים 3.2.2 - 3.2.5 עד כל העכברושים סיימו את המבחן.
3. מבחן ES
   1. למלא את מיכל שחייה (70 × 30 × 110 ס מ³) עם 80 ס מ של מים חמים (25 ± 3 ° C).
      הערה: אם יש תרמוסטט במיכל, טמפרטורת המים להגדיר בסביבות 37 ° C, הדומה לטמפרטורת הגוף של החולדה. אם לא, לקבוע את טמפרטורת החדר לשמור את זה קבוע.
   2. להפוך מטען עבור כל עכברוש עם סיכת אשכולות ולקשור אותו בעדינות על שורש הזנב שלה. העומס שוקל 10% ממשקל של החולדה.
   3. תפוס חולדה בזנב ולזרוק אותו לתוך הטנק שחייה. אם החולדות מצטופפות או להיצמד לקיר, להבחין ביניהם ונהג אותם בחזרה למים.
   4. להתחיל תזמון כרגע כאשר העכברוש מכניסים מים ותזמון עצור כאשר הוא נחלש, אשר הוכח כמו הכשל להיאבק מחוץ למים עם הפה והאף מתחת למים במשך יותר מ 10 s.
      הערה: לפעמים, תשישות וטביעה מתרחש בפתאומיות. ודאו שיש לכם מספיק ניסויים כדי להקליט ולשמור את החיה בו זמנית.
   5. הסר את החולדות מותש מהמים מבלי להפריע לאחרים. תייבשי את השיער שלהם, לסמן מחדש את המספרים שלהם ולשלוח אותם חזרה לכלוב.
   6. להחליף את המים במיכל לאחר סיום קבוצה אחת. לאחר כל העכברושים נעשים, לרוקן למיכל שחייה, לנקות, לעקר אותה עם אתנול וביו -אור UV.

4. מודל ההערכה: נוירוטרנסמיטר מרכזי זיהוי

1. עזים ומתנגד העכברוש עם הזרקה הצפק התוך של 10% כלורין (3 מ"ל/ק"ג) עד שזה חסר הכרה.
2. לערוף את החולדה.
3. עושים חתך אורכי לאורך הקו שלאחר המדיאלי, לפתוח את הגולגולת לשני הצדדים, לחשוף את המוח. . תהפוך את הגולגולת, מסירים את המוח והניח את המוח על שקית קרח.
4. להפריד ולהסיר ההיפותלמוס, וזה האיזור בצורת מעוין בחלק המרכזי של הבסיס של המוח יש גבול ברור עם הרקמות הסובבות. למקם אותו צינור סטרילי ומקפיאים עם חנקן נוזלי. אחסן את כל הדגימות מקרר-80 ° C.
5. לזהות את התוכן של DA ו- 5-HT בהיפותלמוס באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)⁸.

תוצאות

נתאר מודל עכברוש של מרכזי עייפות בעזרת MMPM. 24 Wistar חולדות מחולקים באופן אקראי את קבוצת הביקורת וקבוצת מודל, עם 12 חולדות בכל קבוצה. המנגנון דגם מיועד מיכל מים עם פלטפורמות צר על החלק התחתון (איור 1). מודל חולדות לעמוד על הבמות במשך 14 שעות ליום, כולל זמן שינה חלקית, למשך 21 יום (איור 2).

מבחנים התנהגותיים מבוצעות לאחר דוגמנות כדי להעריך את השינויים הרגשיים והגופניים...

דיון

MMPM מיועד במקור חסך שינה⁹. חולדות הן פצח מיכל מים עם פלטפורמות קבוע בתחתית. מונע על ידי הפחד האינסטינקטיבי של מים, חולדות יישאר לעמוד על הפלטפורמות, מתרחשת ללא שינה. המחקר מראה כי שעות שונות של חוסר שינה להוביל שינויים שונים עכברוש התנהגות ומצב רוח, כולל זיהוי לקות¹⁰, רגשות שליליים¹¹, ועייפות במרכז. יש חוקרים להוכיח כי מניעת שינה כרונית עם השיטה פלטפורמה אחת (SPM) יכול לגרום לעייפות המרכזי, עם זיהוי לקות והחברה הפרעות¹². מחקר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
התאמה אישית של מיכל מים למניעת שינה מרובת פלטפורמות	, הוא מסופק על ידי המעבדה הנוירו-אימונולוגית של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה		110 ס"מ x 60 ס"מ x 40 ס"מ. יש 15 פלטפורמות קטנות מפלסטיק בתחתית. הפלטפורמה הקטנה בקוטר 6.5 ס"מ ובגובה 8 ס"מ
חולדות Wistar	בייג'ינג וויטונג ליהואה מספר רישיון של חברת טכנולוגיית בעלי חיים ניסיוניים	SYXK (בייג'ינג) 2016-0011	השתמש ב-32 חולדות זכרים בריאים של Wistar, בני 8 שבועות (200-210 גרם)
Agilent 1100LC כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים	אג'ילנט	G1379A, G1311A, G1313A, G1316A	G1379A, משאבה כרומטוגרפית מסוג G1311A, דגימה אוטומטית G1313A, תיבת טמפרטורת עמודה G1316A
גלאי אלקטרוכימי עשור II SDC אלקטרודה אלקטרוכימית	של חברת		, אלקטרודת ייחוס Ag / AgCl, תחנות עבודה (Clarity CHS)
צנטריפוגת קירור במהירות גבוהה Biofuge Stratos	HERAEUS
VCX130 מכשיר שבירה קולי	SONICS
ACS-ZEAS בקנה מידה אלקטרוני	פיתוח טכנולוגיית Phos, בייג'ינג.		משקל חולדות השקילה יכול להיות מדויק עד 0.1 גרם.
תיבת שדה פתוח	, היא מסופקת על ידי המעבדה הנוירו-אימונולוגית של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה		קופסת עץ של שדה פתוח  100 ס"מ על 100 ס"מ על 40 ס"מ, בתוך הקיר והתחתון כמו האפור. החלק התחתון מחולק ל-25 ריבועים שווים בשטח, שכל אחד מהם הוא 20 ס"מ על 20 ס"מ, ו-16 הרשתות לאורך הקיר החיצוני הן החיצוניות, ו-9 הרשתות האחרות הן מרכזיות. המצלמה מותקנת מעל החציון.
מבוך פלוס מוגבה	בייג'ינג zhongshi dechuang טכנולוגיה פיתוח ושות' בע"מ.		הזרועות הפתוחות והזרועות הסגורות של הצלב מורכבות מ-30 ס"מ על 5 ס"מ על 15 ס"מ, והאזור המרכזי הוא 5 ס"מ על 5 ס"מ, עם מצלמה המותקנת מעל המרכז וגובה 45 ס"מ.
דלי שחייה של חולדות.	Zhenhua ציוד מכשור ביולוגי ושות', בע"מ. אנהוי, סין.		נפח תוף הפלסטיק הוא 70 ס"מ על 30 ס"מ על 110 ס"מ, המשמש לשחייה בחולדות.
מדחום	Shiya מכשיר ושות', בע"מ, צ'אנגג'ואו, סין.		שליטה בטמפרטורת
המים משאבת מים קטנה	Xincheng טכנולוגיה ושות', בע"מ, צ'נגדו, סין.		משמש להתנהגות מיכל מים ושחייה.
תוכנה התנהגותית Ethovition3.0.	Nuldus, הולנד		ניתוח מדידה של סרטוני התנהגות חולדות.