מאמר שיטה

רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

DOI:

10.3791/57374

⸱

14 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 2Department of Molecular Pathogenesis, Juntendo University Faculty of Medicine, 3Atopy Research Center, Juntendo University Faculty of Medicine, 4Department of Oral Pathobiological Science and Surgery, Tokyo Dental College, 5Department of Gastroenterology, Juntendo University Faculty of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לאפשר זיהוי רגישה מאוד של סרטן המעי הגס האנושי disseminating (CRC) תאים להמדינות רקמות, במסמך זה נראה עבור התמרה חושית יעילה של חלקיקים lentiviral חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך תאים תא צורב PDX-derived CRC פרוטוקול לפני הזרקת שלהם לתוך עכברים הנמען, עם תצפית מיקרוסקופית סטריאו-זריחה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ההתקדמות הנוכחי בטיפול בסרטן המעי הגס האנושי (CRC), כמה טיפולים קיצוניים יעילים לשלבים מאוחר של CRC. כדי להתגבר על האתגר הזה קליניים, גידול xenograft העכבר מודלים באמצעות שורות תאים ותיקה קרצינומה של האדם והעכבר הטרנסגניים רבים פותחו מודלים עם גידולים כמו במודלים פרה. הם חלקית לחקות את התכונות של האנושי קרצינומה, אך לעיתים קרובות אינם מצליחים לסכם היבטים מרכזיים של ממאירות האנושי כולל פלישה גרורות. לפיכך, מודלים חלופיים שמייצגים יותר את התקדמות ממאיר ב CRC האנושי יש כבר המיוחל.

במסמך זה אנו מראים לדור של החולה, נגזר הגידול xenografts (PDXs) על ידי השתלה תת עורית של קטעים CRC קטן בניתוח גזור מן המטופל. המעי הגס PDXs לפתח ומזכירים histopathologically ה-CRC אצל המטופל. עם זאת, כמה micrometastases ספונטנית הן לזיהוי ב חתכים קונבנציונאלי איברים רחוקים המושפעת במודל PDX. כדי להקל על זיהוי גרורתי הפצתו לתוך איברים רחוקים, אנו מופק לתאי הגידול תא צורב PDXs המעי הגס בתרבות, נגוע אותם GFP lentivirus לפני זריקה לתוך IL2Rγ הנד/שי-scid מאוד immunodeficientnull (ליקר) עכברים. תא צורב CRC נגזר PDX Orthotopically מוזרק תאים באופן עקבי טופס גידולים ראשוני חיובי עבור GFP בעכברים הנמען. יתר על כן, באופן ספונטני פיתוח micrometastatic מושבות לבטא GFP מזוהים בעיקר בריאות של עכברים אלה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. יתר על כן, intrasplenic הזרקה של CRC organoids לעתים קרובות מייצר הכבד מושבת. ממצאים אלה מצביעים יחדיו, על מתויג-GFP CRC PDX-derived תא צורב התאים להיות ויזואלית לזיהוי במהלך תהליך רב-שלבי, כינה את המפל הפלישה-גרורות. הפרוטוקולים שתואר כוללים הקמת PDXs של CRC האנושי והתרבות תלת-ממד לתאים המתאימים CRC תא צורב transduced על ידי חלקיקים lentiviral GFP.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הסיבה המובילה השניה של סרטן מקרי מוות ברחבי העולם1. התגובה לא מספיק טיפולים קונבנציונליים של חולים עם מחלה בשלב מתקדם מציין לחוסר היעילות של ניסיונות לרפא באופן קיצוני CRCs. כדי לפתח גישות טיפוליות יעיל יותר, הוקמו דגמים פרה העכבר שונים של סרטן המחקים את המאפיינים של CRCs. שורות תאים שונים של CRC היה בשימוש נרחב ליצירת הגידול xenografts עקב שלהם נוחות וקלות תפעול. תרבות לטווח ארוך של שורות תאים סרטן, עם זאת, לעיתים קרובות גורמת הבחירה של אוכלוסיות תאים ייחודיות כי הם די proliferative תחת תנאי תרבות מסוימת, ובכך וכתוצאה מכך תוצאות לא אמין והמגבלות מכריע הסם פרה פיתוח.

מבלי בתרבית במבחנה, החולה נגזר הגידול xenografts (PDXs) גם שהיא נוצרה על-ידי ההשרשה לתוך מודלים חייתיים של רקמות CRC בניתוח גזור מן המטופלים-2,-3,-4. PDXs מזוהים באופן נרחב recapitulating histopathological התכונות הגדולות ולהציג שינויים גנטיים במקור בגידולים של החולים שממנו הם נשאבו. יתר על כן, organoids החולה נגזר הגידול מורכב של תאים סרטניים אשכולות הוקמו על ידי תרבות בתנאים תלת-ממד זה מקרוב ממש מחקה את תכונות ביולוגיות של5,גידולים המקורי6. אלה organoids הגידול הוחלו גם על תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה, ובכך לאפשר טיפולים אישית להיות מעוצב5. עם זאת, במידה ניכרת הטרוגנית CRC אוכלוסיות מנועות להיות נוכח בתוך הגידול בנפח גדול. אוכלוסיות CRC מסוים עשוי באופן סלקטיבי להתרבות והרחב במהלך הסדרה בתוך vivo ו- in vitro לקשרי של קטעים PDX, גידול organoids, בהתאמה. זה יכול גם לאפשר את הכולל ביטוי גנים פרופילים ואת מצב גנטי/אפי CRCs המושפע לשינוי, ובכך וכתוצאה מכך דמיון מינימלי ה-CRC הורים.

החולה-derived CRC organoids ואלה מופק לא סרטני המעי הגס האנושי מתוכנן הנמל גם יש כבר מועסקים שילובים של מוטציות oncogenic לחקור את גולת הכותרת של תאים סרטניים אנושיים כשניסחתי הגידול הפלישה, גרורות 68,7,,9. עם זאת, נמוך מאוד השכיחות של גרורות ספונטנית הנובעות orthotopic השרשה של החולה-derived CRC לתוך עכברים immunodeficient, הפכה אותו קשה ללמוד את תהליך רב-שלבי של המפל הפלישה-גרורות הכולל המקומי הפלישה, intravasation, תחבורה למחזור הדם, extravasation, קולוניזציה של איברים רחוקים4,10. Micrometastasis כמו המיוצג על-ידי הגידול בתצהיר תא של ≤2 מ"מ, שהוקמה על ידי המטופל, נגזר organoids CRC, לעתים קרובות התעלמו ניתוח histopathological של קטעים מן המושפעים איברים רחוקים במודלים של העכבר ניסיוני. ויזואליזציה של micrometastases ספונטנית היה גם מינימלי ויוו בשל הקושי ביעילות ידביקו סמני פלואורסצנט תאים סרטניים תא צורב לפני ההזרקה שלהם לתוך עכברים הנמען. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול ביעילות מגלי GFP lentivirus לתאי תא צורב CRC PDX-derived בתרבות 3D לפני זריקה לתוך עכברים הנמען ולאפשר זיהוי רגישה מאוד, העסקת מיקרוסקופ סטריאו-זריחה, של שלהם קולוניזציה של איברים שונים כדי טופס micrometastases.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החולה מסופקים בכתב הסכמה מדעת, הפרויקט אושרה על ידי ועדת האתיקה המחקר של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Juntendo. הניסויים העכבר אושרו גם על-ידי ועדת האתיקה של המחקר חיה של הפקולטה לרפואה Juntendo.

1. הקמת PDXs CRC בעכברים Immunodeficient

ניסיוני ההליכים להקמת CRC PDXs (שלב 1) מתוארים ב איור 1A.

  1. הכנת הרקמה CRC העיקרי מיד לאחר כריתה כירורגית של הגידול מן המטופל.
  2. שטיפת הרקמה CRC הראשי על-ידי עצבנות בעדינות מספר פעמים ב 30 מ של פוספט סטרילי כקרח במאגר צינור חרוטי 50 מ ל תמיסת מלח (PBS) ולשמור אותו בקרח.
  3. למקם את הרקמה על צלחת פטרי 10 ס מ באמצעות פינצטה סטרילי, להסיר את אזורי נמק בהרחבה ככל האפשר באמצעות מספריים סטרילי, הרקמות גידולים מוצקים לחתוך חתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ מ3 בגודל) באמצעות סכיני סטרילי.
    הערה: אזורי נמק לעיתים קרובות לבן, רך ומתפורר יותר מאשר והסביבה.
  4. מניחים את חתיכות קטנות של הגידול באמצעות פינצטה סטרילי ב 2 מ של PBS קר כקרח סטרילי על צלחת 6-. טוב.
  5. גזע 6 בת שבוע IL2Rγ הנד/שי-scid null (ריקו) מאוד immunodeficient עכברים בתנאים חינם פתוגן מסוים וחופשית–נבט–.
  6. עזים ומתנגד העכברים עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול. מבטיח את קצב נורמלי ואת עומק הנשימה ואת העדר רפלקס קמצוץ הבוהן על ההרדמה המתאים. הוטרינר משחה על העיניים הוא אופציה, כדי למנוע יובש עינית תחת הרדמה.
  7. לעקר כל כלי ניתוח באמצעות חום יבש עיקור ולאחר מכן להשתמש בכלים אלה עבור כל שגרות כדי למנוע זיהומים בפצע בעכברים הנמען.
  8. הנח את העכבר anesthetized במצב של שכיבה על הספסל מעבדה. עושים חתך קטן על החלקים התחתונים של האגף הימני והשמאלי של העכבר הנמען ליצירת כיסים תת עורית להשתלה רקמות באמצעות מספריים סטרילי. הקפידו לא לנקב את קרום הצפק. צריך להיות דימום קטן עם הליך זה.
  9. בעדינות לטבול לעיל מוכן שברי הגידול לתוך 50 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותי, ואז שתל אותם לתוך החלקים התחתונים של הכיסים תת עורי מימין ומשמאל.
  10. תפר החתך עם הפצע קטעי בעכברים שעברו ניתוחים. ודא כי רקמות הגידול מושתל ממוקמים במרחק מה מן החתך מתחת לעור.
    הערה: בהתאם מזעור ניתוחים, טיפולים לא כאב לאחר ניתוח, זיהום נוהלו במחקר זה.
  11. הנח את העכבר על משטח חם ' ולשמור על תנוחת שכיבה בחזה ובצלעות, עד להכרה מספקת משוחזר. ברגע מלא התאושש מסוגל לשבת על-ארבע, ניתן להחזיר העכברים לכלובים שלהם הביתה. כדי למנוע טריפה, אינם מאפשרים גידול עם בעלי חיים שאינם המופעל באותו הכלוב.
  12. בדוק אם תפר דליפה, לאשר כי העכברים הם במצב יציב למחרת, בקבוצה שטופלו בניתוח. בדוק את העכברים סימנים של מחלה, למדוד את גודל הגידול בכל עכבר, פעם בשבוע, העסקת מחוגה.

2. ניתוח שגיאות CRC PDXs של עכברים

ניסיוני נהלי דיסקציה של CRC PDXs (שלב 2) מתוארים ב איור 1B.

  1. לאפשר את הגידול לגדול subcutaneously ~ 1 ס מ3 בגודל, אשר בדרך כלל לוקח כ 1 – 3 חודשים.
  2. עזים ומתנגד העכבר עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול.
  3. הנח את העכבר במצב של שכיבה על הספסל מעבדה. פצעים וחתכים בעור, לחשוף את הגידול, בזהירות לנתק את העור מן הגידול באמצעות מספריים סטרילי. לאחר הסרת הגידול, הנח אותו על 10 ס מ פטרי להסיר כל אזורי נמק רווחתה של הגידול, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 5 מ של PBS.
    הערה: אזורי נמק לעיתים קרובות לבן, רך ומתפורר יותר מאשר והסביבה.
  4. במקום הגידול על קרח, מחלקים אותו באותה מידה לפחות 4 חלקים עבור יישומים שונים לרבות 1) CRC תא צורב התרבות, 2) השתלת לתוך עכברים המשני, בדיקה היסטולוגית 3), 4) הקפאה ואחסון של השברים הגידול.
    1. עבור הדור של organoids CRC, במקום הרקמה גידולים מוצקים על צלחת פטרי 6 ס מ המכיל 1 מ"ל של PBS סטרילי. לשמור את הרקמה על הקרח עד עיבוד (שלב 3).
    2. להקים את המודל PDX עבור CRC האנושי, מעבר PDXs טריים של CRC לתוך עכבר משנית. חתוך את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ מ3 בגודל) באמצעות סכיני סטרילי, בעדינות טבלו אלה שברי רקמת 50 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותי. לאחר מכן, שתל קטעים אלה לתוך החלקים התחתונים של הכיסים תת עורית הימני והשמאלי של העכבר את המשקה, כפי שמתואר בשלב 1.8-1.11.
    3. לצורך בדיקה היסטולוגית, לתקן את הדגימות ב 5 מ של פורמלין במאגר נייטרלי 10% 15 מ"ל צינור חרוטי בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
    4. הקפאה קריוגנית, חתוך את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ מ3 בגודל), בעדינות טבלו את הדגימות µL 500 של תא הקפאה פתרון 1-1.5 mL cryovial צינורות. לאחר מכן, העבר את הצינור מקפיא-80 ° C.

3. מיצוי של PDXs לתוך התליה תא לתרבות תא צורב CRC

ניסיוני נהלי דיסוציאציה של CRC PDXs (שלב 3) מתוארים ב איור 1B.

  1. מקום הגידול מוכן לעיל (שלב 2.4.1) קטעים על 10 ס מ פטרי.
  2. מינצ השברים באמצעות סכיני סטרילי ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 8 מ ל 10% עגל עוברית סרום (FCS)-בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) עם 80 µL של מניות אנזים collagenase (ראה טבלה של חומרים).
  3. סגור את הצינור בחוזקה, לעטוף את הכובע עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע דליפה. מביצועם השברים טחון הגידול לתוך התליה תא, להתסיס אותו בעדינות על 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. שימו לב כי עדיין יהיו קטעים רבים של רקמות מעוכל שנותרו בצינור.
  4. Centrifuge את הצינור ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. לפתור בגדר התא באמצעות 10 מ"ל של 10% FCS-DMEM כדי להפוך התליה תא.
  5. כדי לסלק פסולת רקמות מעוכל, לסנן התליה תא פעמיים באמצעות מסננת תא את 40 µm על צינור חרוטי 50 מ. לאחר מכן, צנטריפוגה הזרימה דרך ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר על קרח.

4. הדור של Organoids CRC תרבותי על מטריצה חוץ-תאית מלאכותי

ניסיוני נהלי התרבות תא צורב CRC של PDXs המעי הגס (שלב 4) מתוארים ב איור 1B.

  1. ליצור מדיום תרבות מתאים organoids נגזר PDX CRC (ראה טבלה של חומרים, "המדיום תרבות CRC תא צורב") העסקת מדיה שתואר קודם לכן עבור המעי הגס האנושי organoids11.
  2. החל µL 150 של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב על צלחת 12-טוב על קרח, ואז דגירה זה למשך 30-60 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מגשים לגבש את ג'ל.
  3. להשעות בגדר תא מהשלב 3.5 עם המדיום תרבות תא צורב CRC (מתוך שלב 4.1) עם 5% FCS להשגת התאמה 3 x 105 תאים/מ ל.... לאחר מכן, זרע 1 מ"ל של המדיום לצלחת מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה מוכן בשלב 4.2. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. השתמש hemocytometer של ספירת מספר תאים סרטניים כולל תאים בודדים ואשכולות multicellular (קבוצה של תאים חסיד) תא ההשעיה.
    הערה: 5% FCS משמש כדי להרוות את הפעילות האנזימטית מתרחשת שיורית של collagenase במחקר זה.
  4. בזהירות לאסוף המדיום תרבות, כולל צף התאים יש מנותקת מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה לצלחת, לתוך mL 1.5 צנטריפוגה צינור למחרת היום centrifuge זה ב 1,400 x g למשך 5 דקות. לאחר מכן, להסיר את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 70 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים. בקרח.
  5. כדי להגביר את הכדאיות תא CRC, כיסוי את הגידול המכילות תאים מלאכותיים מטריצה חוץ-תאית אל תא צורב גידול תאים המצורפת הצלחת מלאכותי מצופים מטריצה חוץ-תאית, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מגשים לגבש הציפוי המלאכותי מטריצה חוץ-תאית. לאחר מכן, דגירה זה עם 1 מ"ל של המדיום תרבות CRC תא תא צורב עם 1% FCS ב 37 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 5% CO2.
  6. לשנות את המדיום תרבות בכל יום שני. כמו organoids CRC למלא את המדיום, זה יכול להיות צורך לשנות המדיום מדי יום.

5. דור והעשרה של חלקיקים Lentiviral GFP

ניסיוני נהלי דור והעשרה של חלקיקים lentiviral GFP (שלב 5) מתוארים ב איור 1C.

  1. התרבות תאים HEK293T עם רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% FCS, להתכונן 10 ס מ 6 מנות (2 x 106 תאים לכל מנה) תרביות תאים בנוהל.
  2. עבור תרביות תאים לכל תבשיל, להכין µL 500 של תערובת µL 20 מהתרכובת תרביות תאים ב- DMEM עם PRRL-GFP וקטור (5 µg)12 כולל שני פלסמידים אריזה lentiviral, כגון pCMV-VSV-G (1 µg) ו- pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), ב- mL 1.5 סטרילי microtube. לשמור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ואז להוסיף לו על גבי כל אחת מהמנות ס מ-10, דגירה אותם עבור 18 h.
  3. להסיר את המדיום, הוסף 5 מ של טרי בינוני 1640 FCS-RPMI 10% על כל מנה, ולהשאיר במשך 24 שעות ביממה.
  4. לאסוף את המדיום ממוזגים של כל מנה לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל ולאחסן סך של 30 מ של המדיום ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסף 5 מ ל 1640 RPMI טריים על כל מנה ולהשאיר במשך 24 שעות ביממה.
  5. לאסוף את המדיום ממוזגים כל מנה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ ל זכור, כי סה כ, 30 מ של המדיום על קרח. לאחר מכן, למחוק את התאים.
  6. לסנן 60 מ של המדיום (מתוך שלב 5.4 – 5.5) דרך מסנן מיקרומטר 0.45 להסיר התאים ולחלק כמות זו לתוך צינורות פוליפרופילן צנטריפוגה מ ל 12 עבור ultracentrifugation.
  7. להתרכז וירוס, centrifuge אותם באמצעות רוטור דלי מתנדנדים (ראה טבלה של חומרים) ב x 85,327 g עבור h 1.5-4 מעלות צלזיוס.
  8. להסיר לאלתר את המדיום. כדי לפתור את גלולה מרוכזת וירוס, מקום 250 µL של F-12 תערובת של חומרי מזון חזיר (F12) / DMEM בינונית ללא FCS כל העשר צינורות, לשמור על זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שימו לב: הווירוס הצניפה לעתים קרובות בלתי נראה.
  9. בעדינות pipette של המדיום כדי לאסוף 3 מ"ל של מרוכז 5 x GFP lentivirus המניה, בסך הכל, יש להניח כולל GFP חלקיקים lentiviral עם 10 יחידות transducing8 מ ל (טו/mL). לאחר מכן, אחסן את microtubes 1.5 מ ל 12 (כולל µL 250 למחזור) תחת תנאים סטריליים ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנה. להכין aliquots קטנים רבים של התמיסה המקורית כדי למנוע מספר מחזורים הפשרת ההקפאה–.

6. תוויות של CRC תאים תא צורב עם GFP Lentiviral חלקיקים בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותי

נהלי ניסיוני labelling התאים תא צורב CRC עם GFP lentivirus (שלב 6) מתוארים ב איור 1C.

  1. אפשר את organoids CRC מוכן בשלב 4.6 כדי לגדול ללא התערבות, במשך 7-10 ימים, לקצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תא סטרילי ולאחר מכן להעביר אותם לתוך microtube 1.5 מ.
    הערה: הצמיחה של CRC organoids בתרבות תלוי באופי של גידולים המקורי מחולים. למנוע צמיחת יתר של organoids שגיאות CRC, על ידי שמירה על אותם ב- 60-70% הנהרות מוקדמת להעביר ביחס פיצול של 1:2 לצלחת חדשה מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה 12-. טוב.
  2. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g, להסיר את המדיום תרבות ולפתור בגדר תא ב- 500 µL ל- PBS על-ידי הקשה עדין.
  3. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולמחוק PBS.
  4. לנתק את organoids CRC חסיד, להוסיף 500 µL של פתרון ניתוק התא של הפרוטאוליטי, אנזימים collagenolytic לתא הצניפה בצינור ומערבבים על-ידי הקשה עדין. לאחר מכן, יוצאים הצינורות להתפשר על 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מאוד בעדינות pipette התליה תא עם µL 500 נוספת של 1% FCS-DMEM מספר פעמים ב microtube 1.5 mL בערך מביצועם התאים. דור של תאים בודדים מ- organoids CRC מאת pipetting קשות מפחית במידה ניכרת תא הכדאיות. לכן חיוני לעזוב את המסה של התאים לזיהוי חזותי ההשעיה תא על-ידי בעדינות pipetting ב microtube 1.5 mL.
  6. Centrifuge התליה תא למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  7. לפתור בגדר תא בתערובת של µL 100 מניות lentivirus x GFP 5 (> 108 TU/mL) ו- 400 µL של המדיום תרבות CRC תא צורב microtube 1.5 mL על-ידי הקשה עדין כדי להסתגל ריכוז של 5 x 105 הפומבית תאים סרטניים לכל 500 µL . השתמש hemocytometer עבור ספירת מספר תאים סרטניים, כולל תאים בודדים וקבוצות של תאים ההשעיה תא, כפי שתואר לעיל (שלב 4.3).
  8. להכין מלאכותית חוץ-תאית מצופים מטריצה 12-ובכן צלחת, כפי שמתואר בשלב 4.2. ואז, במקום 500 µL של התליה תא מוכן בשלב 6.7 בצלחת ולהשאיר את זה עבור 18 h ב 37 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 5% CO2.
  9. לאסוף את המדיום עם התאים צפים מנותקת את הצלחת מלאכותי מצופים מטריצה חוץ-תאית לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 mL. Centrifuge זה ב 1,400 x g להסיר את תגובת שיקוע וגם מחדש להשעות את צניפה ב 70 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים. בקרח.
  10. להגדלת הכדאיות תא CRC, מכסים את הגידול המכילות תאים מלאכותיים מטריצה חוץ-תאית אל organoids הגידול צמוד לבסיס מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה 12-. ובכן, כפי שמתואר בשלב 4.5. בשלב הבא, דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 חממה כדי לחזק את ציפוי מלאכותי מטריצה חוץ-תאית, ואז תרבות זה עם 1 מ"ל של המדיום תרבות CRC תא צורב עם 1% FCS ב 37 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 5% CO2.
  11. לבחון את התאים ב- 3 ימים לאחר ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות לאשר כמעט 100% חיוביות GFP עקב השימוש כייל נוגדנים גבוה של חלקיקים lentiviral (ראה איור 2 א).
  12. תרבות organoids את CRC לתקופות של 7-10 ימים כדי להרחיב את גדילת התאים לפני זריקה לתוך עכברים הנמען.

7. דור של גרורות מאת CRC GFP שכותרתו Organoids בעכברים הנמען

הטיפול. הניסיוני לדור של גרורות באמצעות את organoids שאותה ניתן להתאים GFP CRC (שלב 7) מתוארים ב איור 1C.

  1. לנתק את organoids CRC GFP שכותרתו לתוך התליה תא, לקצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תא סטרילי ולהעביר אותם לתוך microtube 1.5 מ ל, כפי שתואר לעיל (שלב 6.1).
  2. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g, להסיר את המדיום תרבות, ולפתור בגדר תא ב- 500 µL ל- PBS על-ידי הקשה עדין.
  3. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולמחוק PBS.
  4. כיסוי µL 500 של הפתרון ניתוק התא אל בגדר תא בצינור ומערבבים אותו על-ידי הקשה עדין. אז תעזוב את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר enzymatically מביצועם organoids חסיד של שגיאות CRC, כפי שתואר לעיל (שלב 6.4).
  5. מאוד בעדינות pipette התליה תא עם µL 500 נוספת של 1% FCS-DMEM מספר פעמים ב microtube 1.5 mL בערך מביצועם התאים, כפי שתואר לעיל (שלב 6.5). דור של תאים בודדים מ- organoids CRC מאת pipetting קשות מפחית במידה ניכרת תא הכדאיות. לפיכך, יוצאים המסה של התאים לזיהוי חזותי ההשעיה תא על-ידי בעדינות pipetting ב microtube 1.5 mL.
  6. Centrifuge התליה תא למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  7. להקים מודל העכבר גרורות ספונטנית של CRC PDXs:
    1. להכין השעיה התא כולל 5 x 105 תאים µL 50 ל- PBS עם מטריצה חוץ-תאית מלאכותי 50% לכל העכבר. לשמור על התליה על הקרח לפני השימוש. השתמש hemocytometer עבור ספירת התאים הסרטניים, כפי שמצוין בשלב 4.3.
    2. עזים ומתנגד עכבר עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול, כפי שמצוין בשלב 1.6.
    3. הנח את העכבר NOG במצב פרקדן על הספסל מעבדה. רירית פי הטבעת עם פינצטה סטרילי ומשוך בעדינות אל מחוץ לפי הטבעת. לאחר מכן, להזריק מיד התליה תא מוכן בשלב 7.7.1 submucosa רקטלי של העכבר באמצעות מזרק (מחט גודל: 22 גרם). באופן שגרתי, 4-6 עכברים לכל קבוצה משמשות כדי להעריך את התוצאות.
  8. להקים מודל ניסיוני גרורה של CRC PDXs:
    1. להכין השעיה תא תא צורב CRC כולל 4 x 104 תאים ב- 50 µL ל- PBS לכל העכבר. לשמור על התליה על הקרח לפני השימוש. השתמש hemocytometer עבור ספירת התאים הסרטניים (שלב 4.3).
    2. עזים ומתנגד עכבר עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול, כפי שמצוין בשלב 1.6.
    3. הנח את העכבר ליקר anesthetized במצב של שכיבה על הספסל מעבדה. עושים חתך קטן על החלק התחתון של אגף השמאלי ולאחר מכן לחתוך את הצפק לחשוף בקפידה את הטחול באמצעות פינצטה ומספריים סטרילי. לתפוס את רקמת השומן המצורפת הטחול עם פינצטה סטרילי, ואז לאט לאט להחדיר µL 50 של התליה תא (להכין לעיל, שלב 8.1) לתוך הטחול. להיות בטוחים כי התליה תא מוזרק כראוי ללא זליגות כלפי חוץ הטחול. באופן שגרתי, עכברים 4 לכל קבוצה משמשות כדי להעריך את התוצאות.
  9. למקם כל העכברים על משטח חם לאחר הניתוח ולקיים בתנוחת שכיבה בחזה ובצלעות עד להכרה מספקת משוחזר, כפי שמתואר בשלב 1.11. ברגע העכברים יש החלימו לחלוטין, להחזיר אותם לכלובים שלהם הביתה. כדי למנוע טריפה, אינם מאפשרים גידול עם בעלי חיים שאינם המופעל באותו הכלוב.
  10. בדוק אם תפר זליגת ואשר העכברים. אתה בחיים, בקבוצה שטופלו בניתוח, למחרת. בדוק את העכברים סימנים של גודל הגידול מחלת ולמדוד, העסקת מחוגה, בעכברים כל פעם בשבוע.
  11. להתבונן עכברים לגילוי גרורות ספונטנית (לתקופות של עד 2.5 חודשים), ניסיוני גרורות (1 חודש) לאחר ההזרקה.
  12. להקריב את העכברים באמצעות הרדמה, נקע בצוואר הרחם הימים המצוין. לנתח גידולים העיקרי ורקמות שונים כולל הכבד, הריאות. מניחים את ביתור גידולים ואיברים 5 מ של PBS קר כקרח על 10 ס מ פטרי ולאחסן אותם על קרח.
  13. כדי לאתר תאים תא צורב CRC GFP-חיובית, להתבונן הרקמות ביתור תחת מיקרוסקופ סטריאו-זריחה. לרכוש תמונות עם מצלמת CCD והכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה רגילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוקרצינומה העיקרי המעי הגס מאובחנים כבינוני הבדיל היה כבר resected בניתוח של נקבה בת 76 עם TNM סיווג, שלב IIIa, ואחריו כימותרפיה לאחר הניתוח. Immunohistochemically הראשית של תאים CRC מוכתם חיובי עבור carcinoembryonic אנטיגן, Ki-67, פאן-cytokeratin ו- E-קדהרין. חתיכות של הגידול resected היו גם subcutaneously מושתל לתוך המשקה עכברים לייצר את הדגם PDX של המעי הגס. CRC תא צורב תאים חולצו לאחר מכן לתרבות רקמות מן PDX המעי הגס אשר פיתח subcutaneously בעכברים אלו. Organoids CRC מסוגלים בעקביות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות דגם CRC PDX כבר מועסקים נרחב ללמוד הגידול העיקרי, אם המודל הזה הוא גם ישים חוקרת גרורות הגידול יש לא עדיין היה מלא מבואר. גרורות ספונטנית היו גם בקושי לזיהוי הכבד, הריאות של שונים דווח על המעי הגס PDX מודלים4,10. כדי לזהות micrometastases עם רגישות גבוהה, פיתחנו פרוטוקול עבור transducing חלקיקים lentiviral GFP לתוך organoids CRC נגזר PDX לפני שלהם orthotopic, זריקות תוך ורידי לתוך עכברים הנמען. ראוי לציין, הצלחנו להראות כי שיטה זו מאפשרת זיהוי רגישה מאוד של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין פוטנציאל ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי Juntendo אוניברסיטת יאנג החוקר בפרס (2013, 2014 2015) בן, את משותפת פרוייקט פרס (2013 ו- 2014) ק מ, ומענקים בסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, טכנולוגיה, יפן (16 15625 K כדי י' ק' ו- 16K 15598 ל מ. ג). אנו מודים במיוחד לכל חברי החוג לכירורגיה Coloproctological של פתולוגיה מולקולרית שימושי לדיונים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם ד ר הירויוקי Konno (המלונות בהם צפיתי אוניברסיטת Schoolof ברפואה) ואת ד ר הידקי קיטאג'ימה (אוניברסיטת הבינלאומי לבריאות ורווחה) להדרכה טכני נדיב הניתוחים להשתלה orthotopic לתוך עכברים, ד ר. Yoshitaka היפו (מרכז הסרטן צ'יבה) לקבלת ייעוץ טכני אודות ביצוע התרבות תא צורב הגידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NOD/Shi-scid IL2Rγ עכברים אפסים (NOG)המכון המרכזי לחיות ניסוי, קנאגאווה, יפןמגדלים עכברים זכרים בני 6 שבועות בתנאים נטולי חיידקים ונטולי פתוגנים
ספציפיים קליפס פצעים
פעמיים; 		ייצור Natsume#C-21-Sחיטוי לפני השימוש
גודל מחט מזרק המילטון
: מד 22		טוקיו מדע, יפןחיטוי עם 70% אלכוהול ו-PBS סטרילי.
צלחת 6 בארותBMBio# 92006
צלחת 12 בארותBMBio# 92412
צינור חרוטי 15 מ"לסומיטונו בקליטMS-57150
צינור חרוטי 50 מ"לסומיטומו בקליטMS-57500
מיקרו צינוראפנדורף# 0030120086חיטוי לפני השימוש
המוציטומטרארמה# 03-202-1
40μ מסננת תאיםm Corning#352340
מטריצת קרום מרתף מטריג'לCorning#354234אחסן aliqupts בטמפרטורה של -20°C.
מניחים על קרח עד לשימוש
קולגנאז מסוג 1סיגמא#C1030150 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג 1 ב-1& פעמים; PBS. אחסן aliqupts ב-20° C למשך עד שנה
AccutaseInnovate Cell Technologies#5V2623Aחנות ב-4°C.
DMEM/F-12 עם GlutaMAX™Gibco#10565018חנות ב-4&00°C. חם ב-37&00; C לפני השימוש
Cell banker 1plusZENOAQ#628אחסן ב-4°C. השתמש תוך חודש
PenicillinGibco#15140122אחסן ב-4°C. השתמש תוך חודש
StreptomycinGibco#15140122אחסן ב-4°C. השתמש תוך חודש
hEGFPEPROTECH#AF-100-15אחסן ב-20&00;C. הוסף לבינוני באותו יום כמו השימוש
Y27632, מעכב ROCKWako#253-00591חנות ב-20&<מעלות צלזיוס. הוסף למדיום עלbr/> באותו יום כמו השימוש
במדיוםתרבית GibcoDMEM/F-12 עם GlutaMAX™ תוסף בתוספת 5% FBS, 100 U/ml פניצילין ו-100 µ גרם/מ"ל סטרפטומיצין.
יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות צלזיוס.
תרבית אורגנואידים CRC בינונית
עם 1% או 5% FCS		DMEM/F-12 עם GlutaMAX™ תוסף (Gibco #10565018) בתוספת 1% או 5% FCS, 100 U/ml פניצילין, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 ננוגרם/מ"ל hEGF ו-10 ומיקרו; M Y27632, מעכב ROCK.
חנות ב-4°C. לשימוש תוך חודש אחד.
עוצר הטרנספקציה FuGENE 6Roche11814 443001
Minisart 0.45 ומיקרו; m filterSartorius stedim17598-K
5 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילןבקמן קולטר326819
וקטור PRRL-GFPמתנה מד"ר רוברט א. ויינברג
pCMV-VSV-Gמתנה מד"ר רוברט א. ויינברג
pCMV-dR8.2 dvprמתנה מד"ר רוברט א. ויינברג
הדלי המתנדנד SW55Ti הרוטורבקמן קולטר
א Zeiss Axioplan 2 מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטיZeiss
10 מ"מ, יפן אחד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  3. Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
  4. Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
  5. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  6. Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  7. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
  8. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
  9. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
  10. Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
  11. Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
  12. Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
  13. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  14. Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRCGFPNOG

מאמרים קשורים