Method Article

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microenvironments הסלולר להכיל מגוון של רמזים, כגון גורמי גדילה, מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציות המערכת. רמזים אלה הם מתוזמר היטב, חיוניות בוויסות תא פונקציות במערכת חיה. למרות מספר חוקרים ניסו לחקור את הקשר בין גורמים סביבתיים לבין הרצוי תאיים, הרבה נותר עלום. זאת במידה רבה בשל חוסר במתודולוגיה נכונה לחקות כזה רמזים סביבתיים במבחנה, ולבדוק במקביל רמזים סביבתיים שונים על תאי. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמה משולבת של ערוצי microfluidic, מערך nanofiber, ואחריו ניתוח מתא בודד גבוה-תוכן, לבחון את תאי הגזע פנוטיפים ששונו על ידי גורמים סביבתיים ברורים. כדי להדגים את היישום של הפלטפורמה, מחקר זה מתמקד הפנוטיפים של עצמי חידוש תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כאן, אנו מציגים את הליכי הכנת מערך nanofiber ומבנה microfluidic הזיוף של מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME). יתר על כן, מתוארים השלבים הכוללת של פרופילים, תא מכתים עם מספר סמני פלורסנט, הדמיה פלורסצנטיות מרובות ניתוחים סטטיסטיים, תא בודד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent האנושי תאי גזע (hPSCs)1,2 עצמית לחדש unlimitedly ו להתמיין שושלות רקמות שונות, אשר יכול לחולל מהפכה פיתוח תרופות, טיפולים מבוססי תאים, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית 3 , 4 , 5 , 6. מאכלים תרבות כללית, לוחות microtiter, עם זאת, לא נועדו לאפשר מניפולציה תא הפיסיקליות והכימיות מדויק ברמה התאית עם מגוון של ננו - כדי מיקרו-מטר, הוא גורם קריטי עבור הרחבת הסלולר, התחדשות עצמית, בידול. כדי לטפל חיסרון זה, מחקרים חקרו את התפקידים של microenvironments הסלולר בוויסות-גורל החלטות ותא פ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור מערך MACME

הערה: כל חומרים וציוד מפורטים בטבלה חומרים.

  1. הכנת מסכות עבור מערך nanofiber ותבנית עבור מבנה microfluidic
    1. ליצור תמונות תלת מימד (3D) של מסכות המשמשות את nanofiber ומעריכי ליציקות מבנים microfluidic באמצעות חבילות תוכנה גרפיקת תלת-ממד-מחשב (טבלה 1).
      הערה: תמונות 3D לקריאה ולהדפסה במדפסת תלת-ממד. מסכות המודפס של עובש יש מידות זהות עם תמונות 3D המוגדרים באמצעות התוכנה גרפיקה צעד 1.1.1.
    2. הדפס תבנית המבוססת על עיצובים אלה משתמשים במדפסת תלת-ממד ומסיכות.
      הערה: פרוטוקול זה, דמויי סילון דיו מדפסת תלת-ממד עם UV-לריפוי שרף היה ב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME מערכים: העיצוב ועל פבריקציה נוספת: בשילוב עם טכנולוגיית nanofiber, השתמשנו תרבית תאים microfluidic, ההקרנה טכניקות עבדה בעבר כדי לזהות תנאים אופטימליים hPSC התחדשות עצמית או בידול35,36 (איור 1). זה גם מתאים להקמת מבחני מבוססת תא תפוקה גבוהה חזקים בגלל התא תרבות צ'יימברס והתנאים הם בדיוק לשליטה וניתן להרחבה42,43,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים את השיטה ההקרנה הראשונה להקים מערכת תרבות חזקים לשמירה של hPSCs מוסמך. ראשית, אנחנו תיאר כיצד להכין פלטפורמה שמציעות מגוונות ECMs מלאכותיים ותא זריעה צפיפויות באמצעות מכשיר microfluidic משולב עם מערך nanofiber, המערך MACME. שנית, כמותי המבוסס על תמונות תא בודד phenotyping היה שבוצעו50 להעריך תוצאות הסלולר הפרט והתנהגויות ששונו כתוצאה ביוכימיים שונים ותכונות ביופיזיקלי. ב פרוטוקול זה, הסביבה המורכב GT nanofiber וחלבונים ECM בקרה חיובית מצב של תא הראשונית גבוהה זריעה צפיפות מתאפיינ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים פרופסור ש Nakatsuji-iCeMS, אוניברסיטת קיוטו, על מתן ES תאים אנושיים. אנו מודים גם פרופסור א מרוימה טוקיו במכון הטכנולוגי התמיכה שלו בשימוש של מיקרוסקופ כוח אטומי. מימון בנדיבות סופק על ידי החברה יפן הקידום של המדע (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006, 24656502); מימון נמסר גם האנרגיה החדשה, ארגון פיתוח טכנולוגיה תעשייתית (NEDO) ושל קרן מדעי החיים Terumo. WPI-iCeMS נתמך על ידי את העולם Premier הבינלאומי מחקר במרכז היוזמה (WPI), משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן. חלק של עבודה זו נתמכה על ידי רכזת ננוטכנולוגיה באוניברסיטת קיוטו, במתקן ננו-עיבוד AIST "ננוטכנולוגיה פלטפורמה פרויקט" בחסות MEXT, יפן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פוליסטירן (PS)Sigma#182435Mw ממוצע: 290,000, Mn: ממוצע: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI)MicroChemG113113
ג'לטין (GT)SigmaG2625מעור חזיר,
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184A Doe Corning Toray#1064291חומר ריפוי PDMS ובסיס אלסטומר סיליקון הם מרכיבים של ערכה זו.
OpenSCADזוהי תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית חינמית (http://www.openscad.org/) המשמשת לעיצוב התבנית של המכשיר המיקרופלואידי.
AutoCAD 2014 Autodeskזוהי תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) המשמשת לעיצוב המסכה המשמשת להכנת מערך ננו-סיבים.
מדפסת תלת מימד, AGILISTA-3000Keyence
שרף הניתן לריפוי UV, AR-M2Keyenceזה משמש להדפסת תלת מימד על ידי Agilista.
חומצה אצטיתסיגמא#338826≥ 99.99%
אתיל אצטטסיגמא#270989נטול מים, 99.8%
טטרהידרופוראן (THF)סיגמא#401757
MSP-30Tמכשירמכונת מקרטעת מגנטרון
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811זוהי פלטת בסיס פוליסטירן שעליה נוצר מערך הננו-סיבים. גודל צלחת זה הוא בדרך כלל 127.7 x 85.5 מ"מ.
מכונת פריקת קורונה מסוג אקדחשינקו אלקטריק & מכשורCFG-500מכשיר שימושי זה משמש ליצירת עטרה להפעלת המשטח התחתון של שכבת ה-PDMS בשלב 1.5 "הרכבת מערכי MACME" בפרוטוקול.
מזרק 5 מ"לTerumoSS-05SZ
מחט קהה מנירוסטה (מד 23)Nipro#2166הקוטר והאורך החיצוניים הם 0.6 ו-32 מ"מ, בהתאמה.
ספק כוח במתח גבוהTechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochlorideDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma#56480
Matrigel hESC-QualifiedMatrix Corning#354277חלבון זה מתייחס כמטריצת ג'ל ממברנת הבסיס בפרוטוקול.
CellStick Vitronectin, Human, פתרוןSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940מדיום תרבית ללא מזין וללא קסנו לתחזוקה של תאי ES ו-iPS אנושיים
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), פנולאדום תרמו פישר מדעי#12605028זהו פרוטאז רקומביננטי דמוי טריפסין לדיסוציאציה של תאי יונקים דבקים.
ערכת הדמיה Click-iT EdU עם Alexa Fluor 647 AzidesThermo FisherScientific C10086התיוג הפלואורסצנטי של תאים מתרבים בצביעה פלואורסצנטית על הצלחת בוצע לאורך מדריך המוצר של ערכה זו.
נספח V, Alexa Fluor 594 מצומדThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 נוגדן (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
חמור נגד עכבר IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875זהו נוגדן משני המשמש לצביעה של תאים פלואורסצנטיים על הצלחת.
ECLIPSE Ti-ENikonזהו מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בעדשת אובייקטיבית CFI Plan Fluor 4&/0.13 N.A. (Nikon), מצלמת CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), מנורת כספית (Intensilight, Nikon), שלב אוטומטי XYZ (שלב ממונע Ti-S-ER עם מקודדים, ניקון), וקוביות סינון לארבע תעלות פלואורסצנטיות (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonזוהי תוכנת הדמיית מיקרוסקופ המשמשת לרכישת תמונות אוטומטית.
CellProfiler, גרסה 2.1.0זוהי תוכנה פתוחה בחינם לניתוח תמונות תאים (http://cellprofiler.org/).
RSOM מבוצע על ידי חבילת kohonen של תוכנה זו. זה זמין בחינם (https://www.r-project.org/).
אשכול 3.0זוהי תוכנת אשכולות הקוד הפתוח (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). אשכולות היררכיים ללא פיקוח מתבצעים באמצעות תוכנה זו.
Java TreeViewתוכנת קוד פתוח זו (http://jtreeview.sourceforge.net/) משמשת להמחשת נתוני אשכולות כמפת חום ודנדרוגרמה.
H9 תאי גזע עובריים אנושייםבנק תאי גזע WiCellWA09
מסוג ואקום ניתוח

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles