Method Article

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microenvironments הסלולר להכיל מגוון של רמזים, כגון גורמי גדילה, מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציות המערכת. רמזים אלה הם מתוזמר היטב, חיוניות בוויסות תא פונקציות במערכת חיה. למרות מספר חוקרים ניסו לחקור את הקשר בין גורמים סביבתיים לבין הרצוי תאיים, הרבה נותר עלום. זאת במידה רבה בשל חוסר במתודולוגיה נכונה לחקות כזה רמזים סביבתיים במבחנה, ולבדוק במקביל רמזים סביבתיים שונים על תאי. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמה משולבת של ערוצי microfluidic, מערך nanofiber, ואחריו ניתוח מתא בודד גבוה-תוכן, לבחון את תאי הגזע פנוטיפים ששונו על ידי גורמים סביבתיים ברורים. כדי להדגים את היישום של הפלטפורמה, מחקר זה מתמקד הפנוטיפים של עצמי חידוש תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כאן, אנו מציגים את הליכי הכנת מערך nanofiber ומבנה microfluidic הזיוף של מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME). יתר על כן, מתוארים השלבים הכוללת של פרופילים, תא מכתים עם מספר סמני פלורסנט, הדמיה פלורסצנטיות מרובות ניתוחים סטטיסטיים, תא בודד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent האנושי תאי גזע (hPSCs)1,2 עצמית לחדש unlimitedly ו להתמיין שושלות רקמות שונות, אשר יכול לחולל מהפכה פיתוח תרופות, טיפולים מבוססי תאים, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית 3 , 4 , 5 , 6. מאכלים תרבות כללית, לוחות microtiter, עם זאת, לא נועדו לאפשר מניפולציה תא הפיסיקליות והכימיות מדויק ברמה התאית עם מגוון של ננו - כדי מיקרו-מטר, הוא גורם קריטי עבור הרחבת הסלולר, התחדשות עצמית, בידול. כדי לטפל חיסרון זה, מחקרים חקרו את התפקידים של microenvironments הסלולר בוויסות-גורל החלטות ותא פונקציות4. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים נערכו לשחזר microenvironments הסלולר במבחנה7,8. תהליכי ייצור ננו מיקרו הקמנו אלה microenvironments באמצעות המניפולציה של כימי9,10,11,12,13, 14,15,16,17 ו הפיזי18,19,20 רמזים סביבתיים. עד עכשיו, היו דיווחים לחקור באופן שיטתי את המנגנון הבסיסי של רמזים סביבתיים הכימי והפיזי על החלטות גורל והפונקציות פלטפורמה אחת.

כאן, אנחנו מציגים אסטרטגיה המבוססת על עקרונות עיצוב פשוט להקים פלטפורמה הקרנה חזקה (איור 1). ראשית, אנו מתארים את ההליך בפיתוח של פלטפורמה משולבת ליצירת microenvironments הסלולר רב-תכליתי, מלאכותי באמצעות מערך nanofiber ומבנה microfluidic: מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) (איור 1א' ו- 2A). המערך nanofiber יש 12 microenvironments שונות שילובים שונים של חומרים nanofiber וצפיפות. Electrospinning שימשה לפברק nanofibers. החומרים nanofiber, כגון פוליסטירן (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22לטין (GT)23, נועדו לבחון את התכונות הכימיות שלהם, דבר שעשוי להשפיע על התא אדהזיה ותחזוקה של pluripotency ( איור 2B). צפיפות Nanofiber היו מגוונות על-ידי שינוי זמן electrospinning, nanofibers שנוצר הוגדרו לפי צפיפות שלהם (החמורה, עם D = XLow/נמוך/בינוני/גבוה). המבנה microfluidic מורכב polydimethylsiloxane (PDMS) מחסה-48 לשכות תרבית תאים, אשר יכולים להיות ממוקם לאורך הממדים סטנדרטי של microplate 96-ובכן. PDMS הוא פולימר מסתיימים, גז-להחלפה משמש בדרך כלל כדי לפברק התקנים microfluidic24. כל ערוץ microfluidic תוכננה להיות 700-מיקרומטר רחב ו- 8.4 מ מ ארוך והיו שני פתחי הכניסה-הקצוות שלה (טבלה 1). התאים היו בגבהים שונים (250, 500, 1000 מיקרומטר) לטיפול הראשוני זורעות תא הצפיפויות 0.3, 0.6 ו 1.2 × 105 תאים/cm, (2) אשר עשוי לתאם עם הישרדות, התפשטות, הבידול של hPSCs25 (איור 2C). מספר התאים נזרע לתא ביחס לצפיפות העמודה מעל הרצפה קאמרית, ובכך התא הראשוני זריעה צפיפות נשלטה על ידי החדרת התליה תא אותו לתוך התרבות תאי בגבהים שונים. כל הערוצים נועדו להיות ≥ 250-מיקרומטר-גבוהה26 כדי למזער את ההשפעות של חמצן נמוך מתח27 ו גזירה28 על התאים. ערוץ לגבהים של 250, 500 ו- 1000 מיקרומטר הם מקוצר כאן כמו XCD עם X = נמוך, בינוני, ו גבוה, בהתאמה. הסביבות עם צפיפויות שונות nanofiber וצפיפות זורעות תא הראשונית קוצרו כמו "צפיפות density_Cell Material_NF" (למשל, GT_HighNF_HighCD: סביבה מאופיין בצפיפות גבוהה nanofibers GT ו גבוהה הראשונית תא זורעות צפיפות).

כתוצאה מכך, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח מתא בודד לחקור באופן שיטתי בהתנהגות התא בתגובה גורמים סביבתיים (איור 1B). כמושג הוכחה-של-, זיהינו את הסביבה התאית אופטימלית עבור hPSC העצמי-חידוש, אשר היא פונקציה מפתח עבור hPSC תחזוקה (איור 1B)29. Cytometry מבוססת תמונה, ואחריו ניתוחים סטטיסטיים, מאפשר פרשנות כמותית של תגובות פנוטיפי הסלולר הפרט סביבות הסלולר. בין מגוון רחב של פונקציות הסלולר, מאמר זה מספק הליך מפורט כדי לזהות את התנאים אופטימאליים לשמירה על התחדשות עצמית hPSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור מערך MACME

הערה: כל חומרים וציוד מפורטים בטבלה חומרים.

  1. הכנת מסכות עבור מערך nanofiber ותבנית עבור מבנה microfluidic
    1. ליצור תמונות תלת מימד (3D) של מסכות המשמשות את nanofiber ומעריכי ליציקות מבנים microfluidic באמצעות חבילות תוכנה גרפיקת תלת-ממד-מחשב (טבלה 1).
      הערה: תמונות 3D לקריאה ולהדפסה במדפסת תלת-ממד. מסכות המודפס של עובש יש מידות זהות עם תמונות 3D המוגדרים באמצעות התוכנה גרפיקה צעד 1.1.1.
    2. הדפס תבנית המבוססת על עיצובים אלה משתמשים במדפסת תלת-ממד ומסיכות.
      הערה: פרוטוקול זה, דמויי סילון דיו מדפסת תלת-ממד עם UV-לריפוי שרף היה בשימוש30. רזולוציית המדפסת היה 635 × 400 dpi ו 15 מיקרומטר ב- X, Y ו- Z, בהתאמה, עם זאת, בפועל X, Y ברזולוציה שנמוך כ ארבע פעמים.
  2. Nanofiber-מערך הכנה (איור 3A)
    1. להכין תמיסות פולימר electrospinning.
      1. לדלל 13% נוזלים PMGI עם tetrahydrofuran על ידי 9% (w/v)22.
      2. להמיס 0.08 גר' PS (המספר הממוצע משקל מולקולרי (Mn): 130,000) THF:dimethylformamide (יחס 1:1 נפח)21, ולהוסיף THF:dimethylformamide להביא את אמצעי האחסון עד גמר 1 מ"ל (8% (w/v) PS פתרון).
      3. להמיס 0.1 גר' GT במים: חומצה אצטית: אתיל אצטט (יחס נפח של 1:1.6:2.1), ומוסיפים מים: חומצה אצטית: אתיל אצטט להביא את אמצעי האחסון עד גמר 1 מ"ל (10% (w/v) GT פתרון) כפי שמתואר23,31.
    2. השתמש מגנטרון sputtering המכונה, להפקיד פלטינה שכבה דקה עם עובי 5-nm ב פוליסטירן (PS) baseplate (127.7 × 85.5 מ מ), אשר משמש קטודית בכיוונון electrospinning.
    3. לטעון את כל הפתרונות פולימרי לתוך מזרק 5-mL מצויד עם מחט בוטה של פלדת 23-G.
    4. המקום, עוגן המזרק עם מחט משאבת מזרק עם 12-ס מ האספן של המכשיר electrospinning.
    5. להתחבר מחט מזרק ספק כח בעל מתח גבוה, להגדיר כדי להחיל על 11 kV.
    6. הגדר את קצב השאיבה של 0.2 מ"ל/h.
    7. לשמור על טמפרטורה ולחות ב- 30 ° C ו- < 30% (v/v).
    8. שימי את המסיכה על baseplate המוכנים בשלב 1.2.2.
    9. לפברק nanofibers על baseplate דרך החורים של מסיכה עם צפיפויות שונות על-ידי שינוי הזמן electrospinning (למשל, 20, 60, 90, 180 s).
    10. להסיר את המסכה baseplate.
      הערה. אתנול יכול להיות ריססו על nanofibers GT electrospun לפני הסרת המסכה להימנע מתקלפת GT nanofibers יחד עם המסכה.
    11. חזור על שלב 1.2.4-1.2.10 עד להשלמת מערך nanofiber פבריקציה נוספת.
    12. מקם את המערך nanofiber desiccator ב- 25 ° C עבור 16 h מתמוססות הממס הנותרים.
    13. Nanofibers Crosslink GT עם 0.2 מ' 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ו- 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) אתנול ב 25 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות23.
    14. לשטוף GT nanofibers פעמיים עם 99.5% (v/v) אתנול וביו -ואקום-יבש 25 ° c עבור 16 h.
  3. ייצור מבנים microfluidic (איור 3B)
    1. לערבב 2 גר' PDMS אשפרה הסוכן ו- 20 גרם של בסיס PDMS (1:10 משקל יחס; Pre-PDMS). 24
    2. יוצקים את התערובת pre-PDMS על העובש מפוברק בשלב 1.2.
    3. דה-גז התערובת pre-PDMS ב desiccator במשך 30 דקות.
    4. לרפא את התערובת pre-PDMS בתנור ב 65 ° C עבור 16 h.
  4. מערכי הרכבה של MACME (איור 3B)
    1. לקלף את מבנה PDMS נרפא בשלב 1.3.4 מ העובש ונקי עם אתנול 70% (v/v).
    2. לטיפול הפרשות corona אטמוספרי בצד התחתון של המבנה PDMS32.
      הערה: ב פרוטוקול זה, בקורונה משוחרר על-פני כל שכבה 3 או 4 פעמים עם מנגנון השחרור קורונה "שימושיים". טיפול בחמצן פלזמה הוחלף עם הפרשות corona האטמוספירה כדי לשנות את פני השטח adhesiveness.
    3. להרכיב את מבנה PDMS עם המערך nanofiber במהירות.
    4. תנור-אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך יומיים.

2. טעינת hESCs למערך MACME

  1. לתרבות שגרתית H9 תאי גזע עובריים (hESCs), לשמור על תאים ללא קסנו המוגדרים כימי תרבות בינונית עבור תחזוקה hPSC33 בתוספת 10 מיקרומטר רוק Y-27632 מעכב34 (בשם hPSC בינוני) בתרבות 35 מ מ תא מאכל מצופה קרום המרתף ג'ל מטריקס (מ ג).
  2. מעבר תאים כל ימים 4-7 באמצעות פרוטאז כמו טריפסין רקומביננטי.
  3. לעקר את מערך MACME בעל 99.5% אתנול, על-ידי טעינה אל התאים למשך 10 דקות ולאחר מכן הסר האתנול. חזור על שלב זה 3 פעמים.
  4. להציג את µL 12 של מ ג, µg/mL 10 vitronectin (VN), ו- 0.1% (w/v) GT לתוך הפקד תרבות צ'יימברס, דגירה התאים ב 37 ° C עבור h 1 כדי להרגיע אותם על משטחים קאמרית.
    הערה: ב פרוטוקול זה, MG, VN ו GT נבחרו כמו חלבונים הפניית תא אדהזיה ותרבות. בגלל מ"ג ו VN מטריצות תא סטנדרטי-תרבות המשמש לשמירה על התחדשות עצמית hPSC, הם משמשים כפקדי חיובי; GT מימדי ציפוי (2DGT) או ללא-ציפוי (NC) שימשו כפקדי שלילי.
  5. להציג hPSC מראש ומחוממת בינוני לתוך תאי כל מערך MACME. דגירה הצ'יימברס למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  6. HESC לרחוץ H9 תרבותי על מאכל 35 מ מ עם DPBS, להוסיף 0.5 מיליליטר פרוטאז כמו טריפסין רקומביננטי למנה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ו בקפידה מחוק לגמרי רק את supernatants מעורבב עם פרוטאז.
    הערה: בשלב השאיפה, התאים לא מנותקים.
  7. מיד להוסיף hPSC בינוני, בעדינות לוותר על המדיום מפני השטח המנה שוב ושוב כדי מביצועם תאים ולהעביר את התאים מנותקת צינור חרוטי 15-mL.
  8. צנטריפוגה-200 g x עבור 3 דקות לשאוב תגובת שיקוע, להשעות את התאים במדיום hPSC מראש ומחוממת.
  9. להציג µL 12 של התליה תא (1.2 × 106 תאים/mL) לתוך כל תא microfluidic.
    הערה: להציג את התאים לתא אחד מהשני באמצעות micropipette. כי מספר התאים נזרע ללשכה הוא יחסי לצפיפות העמודה מעל הרצפה קאמרית, יכול להיות נשלט צפיפות זורעות תא הראשונית אף-על-פי דגימות באותו תא ההשעיה שימשו. ודא pipetting מתבצעת בעדינות. הסר בינוני עודף התאים באמצעות מקל שקצהו כותנה לאחר הטעינה. המערך MACME תואם פיפטות מעבדתיות נפוץ והן מערכות אוטומטיות פיפטה, זה לא דורש שום ציוד מיוחד.
  10. שנה hPSC בינוני כל 12 שעות והתרבות במשך 4 ימים.
    הערה: אמצעי אחסון קבוע של המדיום (1.6, 3.2 ו- 6.4 µL) מתוחזקים באמצעות לשכות בגדלים שונים. התרבות התאים תחת מצב סטטי כדי למזער את מאמץ גזירה למעט החלפת של התא תרבות בינוני35,36.

3. כמותיים פרופיל תא בודד

  1. תא פלורסנט מכתים על צלחת
    הערה:     כדי לנתח את השינויים פנוטיפי לחידוש עצמי hPSCs, פרוטוקול זה נבחר שלושה סמנים פנוטיפי מפתח עבור פרוטוקול זה: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו), ו- V Annexin, כדי למדוד את המצב של pluripotency, התפשטות אפופטוזיס , בהתאמה (איור 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) משמש לזיהוי גרעין התא. OCT4 הוא אחד הגורמים הקריטיים שעתוק של pluripotency.
    1. דגירה H9 hESCs מערכים MACME בינוני hPSC בתוספת 10 מיקרומטר אדו אלקין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. אחרי כביסה עם כריכת annexin מאגר (10 מ מ HEPES (pH 7.4), 140 מ מ NaCl, 2.5 מ מ CaCl2), מכתים את התאים עם תפוז-פלורסנט לצבוע Annexin V המספר המשלים ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. לתקן תאים ב- PBS עם 4% (v/v) paraformaldehyde ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף פעמיים תאים עם PBS.
    4. Permeabilize תאים באמצעות PBS 0.3% (v/v) טריטון X-100 ב- 20 ° C עבור 16 h.
      הערה: Paraformaldehyde מחלישה את הקשר בין צלחת הבסיס פלסטיק מבנה microfluidic PDMS. לפיכך, הניתוק של השכבה PDMS מן המערך בשלב 3.2.1 יכול להתבצע גם מיד לאחר שלב זה.
    5. דגירה תאים במאגר המבוסס על טריס התגובה עם אזיד צבע אדום-פלורסנט ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. דגירה תאים במאגר חסימה (PBS עם סרום עז רגילה 5% (v/v), סרום חמור רגילה 5% (v/v), 3% (w/v) אלבומין שור, 0.1% (v/v) Tween-20, ו- 0.1% (w/v) N-dodecyl-β-D-maltoside) ב 4 ° C עבור 16 h.
    7. דגירה PBS עם 0.5% (v/v) פתרון טריטון X-100, נוגדן OCT3/4 אנושי (עכבר IgG) ב 4 ° C עבור 16 h.
    8. דגירה במאגר חסימה עם התווית על-ידי צבע ירוק-פלורסנט חמור נגד העכבר IgG (H + L) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    9. דגירה ב- PBS עם דאפי ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    10. החלף PBS-דאפי PBS.
    11. לשמר את המערך MACME ב 4 ° C עד ייבוא תמונות.
  2. תמונה רכישה (איור 4)
    1. לקלף את המבנה microfluidic PDMS מן המערך MACME.
    2. להסיר את PBS שיורית מן המערך MACME, החל 90%(v/v) גליצרול ב- PBS לתאים, למקם coverslips מעל התאים מוכתם.
    3. הגדר את הצלחת במהופך על הבמה של מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.
    4. לרכוש 12-bit צבע תמונות באופן אוטומטי באמצעות כל הרכיבים ממונע (שלב, מסננים, תריס של מערכות מיקוד) בידי מיקרוסקופ imaging התוכנה.
      הערה. ב פרוטוקול זה, חשיפה יותאם להגיע ליד ערכי העוצמה המרבית (עוצמת פיקסל הגבוהה ביותר: 4096), אבל לא רוויה, כל תמונה, דאפי, OCT4, Annexin V של אדו.
  3. עיבוד תמונה מונחה מחשב, קרינה פלואורסצנטית אות כמת (איור 5)
    הערה:     הניתוח הבא של התמונה תא מבוצעת בהתבסס על שיטת שתואר לעיל37.
    1. להמיר תמונות צבע בגווני אפור.
    2. לחשב את ערך הסף יחיד עבור כל תמונה דאפי עם השיטה אוטסו ולסווג פיקסלים מעל הסף הקידמה וגם בהמשך כרקע. ודא כי הערך החזית תואם עוצמת דאפי פלורסנט.
      הערה: תהליך ניתוח תמונה מכילה 5 צעדים; זיהוי של אובייקטים ראשוניים של דאפי תמונות, זיהוי של אובייקטים משני OCT4, Annexin V ותמונות אדו, בהתאמה, ומדידה של עוצמה אובייקט. איור 3 מספק התמונות של ממשק משתמש גרפי (GUI) על ההגדרה של עיבוד תמונה.
    3. למדוד עוצמות פלורסנט OCT4, עידו על כל תמונה.
    4. לזהות את האזור מוכתם Annexin V עם שיטת ההפצה, לכמת את עוצמת פלורסנט.
  4. 3.4 ניתוח סטטיסטי להמחיש פנוטיפים הסלולר בודדים על תא בודד הדמיה
    1. לנרמל את עוצמות פלורסנט קלט כל סמן פנוטיפי על ידי מרכוז ושינוי קנה מידה משתנים אלה לתת להם משקל שווה.
    2. לבצע ניתוח מפה (סום) הארגון-העצמי באמצעות סביבת תוכנה עבור חישוב סטטיסטי של גרפיקה כפי שתואר על ידי מחקרים קודמים38,39.
      1. צור 25 צמתים סום ייחודי ארבע "טבלת פענוח וקטורים" המתאים עוצמות פלורסנט ארבעה סמנים, דאפי, אדו, Annexin V ו- OCT4.
      2. להקצות לתאים בודדים ב- microenvironment בכל צומת (הדומה ביותר) "הזוכה", ותכין כמו תדר תא, לפיה הווקטורים טבלת הפענוח של הצומת הזוכה יעודכנו באמצעות ממוצע משוקלל, איפה המשקל שקצב הלמידה (כאן, 0.05 כמו ברירת המחדל).
        הערה: להשמיט נתונים צ'יימברס המכיל פחות מ- 1,000 תאים כי datasets המכיל מספר תאים לא סיפקו תוצאות רלוונטיות מבחינה סטטיסטית סום.
    3. לבצע ללא השגחה הירארכי קיבוץ באשכולות עם הערכים סום-צומת באמצעות שיטת הצמדה לממוצע המבוססת על המתאם פירסון תוכנה קיבוץ באשכולות40.
    4. להרכיב את נתוני האשכולות dendrogram ותצוגות heatmap41.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME מערכים: העיצוב ועל פבריקציה נוספת: בשילוב עם טכנולוגיית nanofiber, השתמשנו תרבית תאים microfluidic, ההקרנה טכניקות עבדה בעבר כדי לזהות תנאים אופטימליים hPSC התחדשות עצמית או בידול35,36 (איור 1). זה גם מתאים להקמת מבחני מבוססת תא תפוקה גבוהה חזקים בגלל התא תרבות צ'יימברס והתנאים הם בדיוק לשליטה וניתן להרחבה42,43,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים את השיטה ההקרנה הראשונה להקים מערכת תרבות חזקים לשמירה של hPSCs מוסמך. ראשית, אנחנו תיאר כיצד להכין פלטפורמה שמציעות מגוונות ECMs מלאכותיים ותא זריעה צפיפויות באמצעות מכשיר microfluidic משולב עם מערך nanofiber, המערך MACME. שנית, כמותי המבוסס על תמונות תא בודד phenotyping היה שבוצעו50 להעריך תוצאות הסלולר הפרט והתנהגויות ששונו כתוצאה ביוכימיים שונים ותכונות ביופיזיקלי. ב פרוטוקול זה, הסביבה המורכב GT nanofiber וחלבונים ECM בקרה חיובית מצב של תא הראשונית גבוהה זריעה צפיפות מתאפיינ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים פרופסור ש Nakatsuji-iCeMS, אוניברסיטת קיוטו, על מתן ES תאים אנושיים. אנו מודים גם פרופסור א מרוימה טוקיו במכון הטכנולוגי התמיכה שלו בשימוש של מיקרוסקופ כוח אטומי. מימון בנדיבות סופק על ידי החברה יפן הקידום של המדע (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006, 24656502); מימון נמסר גם האנרגיה החדשה, ארגון פיתוח טכנולוגיה תעשייתית (NEDO) ושל קרן מדעי החיים Terumo. WPI-iCeMS נתמך על ידי את העולם Premier הבינלאומי מחקר במרכז היוזמה (WPI), משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן. חלק של עבודה זו נתמכה על ידי רכזת ננוטכנולוגיה באוניברסיטת קיוטו, במתקן ננו-עיבוד AIST "ננוטכנולוגיה פלטפורמה פרויקט" בחסות MEXT, יפן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פוליסטירן (PS)Sigma#182435Mw ממוצע: 290,000, Mn: ממוצע: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI)MicroChemG113113
ג'לטין (GT)SigmaG2625מעור חזיר,
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184A Doe Corning Toray#1064291חומר ריפוי PDMS ובסיס אלסטומר סיליקון הם מרכיבים של ערכה זו.
OpenSCADזוהי תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית חינמית (http://www.openscad.org/) המשמשת לעיצוב התבנית של המכשיר המיקרופלואידי.
AutoCAD 2014 Autodeskזוהי תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) המשמשת לעיצוב המסכה המשמשת להכנת מערך ננו-סיבים.
מדפסת תלת מימד, AGILISTA-3000Keyence
שרף הניתן לריפוי UV, AR-M2Keyenceזה משמש להדפסת תלת מימד על ידי Agilista.
חומצה אצטיתסיגמא#338826≥ 99.99%
אתיל אצטטסיגמא#270989נטול מים, 99.8%
טטרהידרופוראן (THF)סיגמא#401757
MSP-30Tמכשירמכונת מקרטעת מגנטרון
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811זוהי פלטת בסיס פוליסטירן שעליה נוצר מערך הננו-סיבים. גודל צלחת זה הוא בדרך כלל 127.7 x 85.5 מ"מ.
מכונת פריקת קורונה מסוג אקדחשינקו אלקטריק & מכשורCFG-500מכשיר שימושי זה משמש ליצירת עטרה להפעלת המשטח התחתון של שכבת ה-PDMS בשלב 1.5 "הרכבת מערכי MACME" בפרוטוקול.
מזרק 5 מ"לTerumoSS-05SZ
מחט קהה מנירוסטה (מד 23)Nipro#2166הקוטר והאורך החיצוניים הם 0.6 ו-32 מ"מ, בהתאמה.
ספק כוח במתח גבוהTechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochlorideDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma#56480
Matrigel hESC-QualifiedMatrix Corning#354277חלבון זה מתייחס כמטריצת ג'ל ממברנת הבסיס בפרוטוקול.
CellStick Vitronectin, Human, פתרוןSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940מדיום תרבית ללא מזין וללא קסנו לתחזוקה של תאי ES ו-iPS אנושיים
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), פנולאדום תרמו פישר מדעי#12605028זהו פרוטאז רקומביננטי דמוי טריפסין לדיסוציאציה של תאי יונקים דבקים.
ערכת הדמיה Click-iT EdU עם Alexa Fluor 647 AzidesThermo FisherScientific C10086התיוג הפלואורסצנטי של תאים מתרבים בצביעה פלואורסצנטית על הצלחת בוצע לאורך מדריך המוצר של ערכה זו.
נספח V, Alexa Fluor 594 מצומדThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 נוגדן (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
חמור נגד עכבר IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875זהו נוגדן משני המשמש לצביעה של תאים פלואורסצנטיים על הצלחת.
ECLIPSE Ti-ENikonזהו מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בעדשת אובייקטיבית CFI Plan Fluor 4&/0.13 N.A. (Nikon), מצלמת CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), מנורת כספית (Intensilight, Nikon), שלב אוטומטי XYZ (שלב ממונע Ti-S-ER עם מקודדים, ניקון), וקוביות סינון לארבע תעלות פלואורסצנטיות (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonזוהי תוכנת הדמיית מיקרוסקופ המשמשת לרכישת תמונות אוטומטית.
CellProfiler, גרסה 2.1.0זוהי תוכנה פתוחה בחינם לניתוח תמונות תאים (http://cellprofiler.org/).
RSOM מבוצע על ידי חבילת kohonen של תוכנה זו. זה זמין בחינם (https://www.r-project.org/).
אשכול 3.0זוהי תוכנת אשכולות הקוד הפתוח (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). אשכולות היררכיים ללא פיקוח מתבצעים באמצעות תוכנה זו.
Java TreeViewתוכנת קוד פתוח זו (http://jtreeview.sourceforge.net/) משמשת להמחשת נתוני אשכולות כמפת חום ודנדרוגרמה.
H9 תאי גזע עובריים אנושייםבנק תאי גזע WiCellWA09
מסוג ואקום ניתוח

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles