מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי
במאמר זה
סיכום
תקציר
Microenvironments הסלולר להכיל מגוון של רמזים, כגון גורמי גדילה, מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציות המערכת. רמזים אלה הם מתוזמר היטב, חיוניות בוויסות תא פונקציות במערכת חיה. למרות מספר חוקרים ניסו לחקור את הקשר בין גורמים סביבתיים לבין הרצוי תאיים, הרבה נותר עלום. זאת במידה רבה בשל חוסר במתודולוגיה נכונה לחקות כזה רמזים סביבתיים במבחנה, ולבדוק במקביל רמזים סביבתיים שונים על תאי. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמה משולבת של ערוצי microfluidic, מערך nanofiber, ואחריו ניתוח מתא בודד גבוה-תוכן, לבחון את תאי הגזע פנוטיפים ששונו על ידי גורמים סביבתיים ברורים. כדי להדגים את היישום של הפלטפורמה, מחקר זה מתמקד הפנוטיפים של עצמי חידוש תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כאן, אנו מציגים את הליכי הכנת מערך nanofiber ומבנה microfluidic הזיוף של מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME). יתר על כן, מתוארים השלבים הכוללת של פרופילים, תא מכתים עם מספר סמני פלורסנט, הדמיה פלורסצנטיות מרובות ניתוחים סטטיסטיים, תא בודד.
מבוא
Pluripotent האנושי תאי גזע (hPSCs)1,2 עצמית לחדש unlimitedly ו להתמיין שושלות רקמות שונות, אשר יכול לחולל מהפכה פיתוח תרופות, טיפולים מבוססי תאים, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית 3 , 4 , 5 , 6. מאכלים תרבות כללית, לוחות microtiter, עם זאת, לא נועדו לאפשר מניפולציה תא הפיסיקליות והכימיות מדויק ברמה התאית עם מגוון של ננו - כדי מיקרו-מטר, הוא גורם קריטי עבור הרחבת הסלולר, התחדשות עצמית, בידול. כדי לטפל חיסרון זה, מחקרים חקרו את התפקידים של microenvironments הסלולר בוויסות-גורל החלטות ותא פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור מערך MACME
הערה: כל חומרים וציוד מפורטים בטבלה חומרים.
-
הכנת מסכות עבור מערך nanofiber ותבנית עבור מבנה microfluidic
- ליצור תמונות תלת מימד (3D) של מסכות המשמשות את nanofiber ומעריכי ליציקות מבנים microfluidic באמצעות חבילות תוכנה גרפיקת תלת-ממד-מחשב (טבלה 1).
הערה: תמונות 3D לקריאה ולהדפסה במדפסת תלת-ממד. מסכות המודפס של עובש יש מידות זהות עם תמונות 3D המוגדרים באמצעות התוכנה גרפיקה צעד 1.1.1. - הדפס תבנית המבוססת על עיצובים אלה משתמשים במדפסת תלת-ממד ומסיכות.
הערה: פרוטוקול זה, דמויי סילון דיו מדפסת תלת-ממד עם UV-לריפוי שרף היה ב....
- ליצור תמונות תלת מימד (3D) של מסכות המשמשות את nanofiber ומעריכי ליציקות מבנים microfluidic באמצעות חבילות תוכנה גרפיקת תלת-ממד-מחשב (טבלה 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
MACME מערכים: העיצוב ועל פבריקציה נוספת: בשילוב עם טכנולוגיית nanofiber, השתמשנו תרבית תאים microfluidic, ההקרנה טכניקות עבדה בעבר כדי לזהות תנאים אופטימליים hPSC התחדשות עצמית או בידול35,36 (איור 1). זה גם מתאים להקמת מבחני מבוססת תא תפוקה גבוהה חזקים בגלל התא תרבות צ'יימברס והתנאים הם בדיוק לשליטה וניתן להרחבה42,43,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מדגים את השיטה ההקרנה הראשונה להקים מערכת תרבות חזקים לשמירה של hPSCs מוסמך. ראשית, אנחנו תיאר כיצד להכין פלטפורמה שמציעות מגוונות ECMs מלאכותיים ותא זריעה צפיפויות באמצעות מכשיר microfluidic משולב עם מערך nanofiber, המערך MACME. שנית, כמותי המבוסס על תמונות תא בודד phenotyping היה שבוצעו50 להעריך תוצאות הסלולר הפרט והתנהגויות ששונו כתוצאה ביוכימיים שונים ותכונות ביופיזיקלי. ב פרוטוקול זה, הסביבה המורכב GT nanofiber וחלבונים ECM בקרה חיובית מצב של תא הראשונית גבוהה זריעה צפיפות מתאפיינ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים פרופסור ש Nakatsuji-iCeMS, אוניברסיטת קיוטו, על מתן ES תאים אנושיים. אנו מודים גם פרופסור א מרוימה טוקיו במכון הטכנולוגי התמיכה שלו בשימוש של מיקרוסקופ כוח אטומי. מימון בנדיבות סופק על ידי החברה יפן הקידום של המדע (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006, 24656502); מימון נמסר גם האנרגיה החדשה, ארגון פיתוח טכנולוגיה תעשייתית (NEDO) ושל קרן מדעי החיים Terumo. WPI-iCeMS נתמך על ידי את העולם Premier הבינלאומי מחקר במרכז היוזמה (WPI), משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן. חלק של עבודה זו נתמכה על ידי רכזת ננוטכנולוגיה באוניברסיטת קיוטו, במתקן ננו-עיבוד AIST "ננוטכנולוגיה פלטפורמה פרויקט" בחסות MEXT, יפן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פוליסטירן (PS) | Sigma | #182435 | Mw ממוצע: 290,000, Mn: ממוצע: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| ג'לטין (GT) | Sigma | G2625 | מעור חזיר, |
| ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184 | A Doe Corning Toray | #1064291 | חומר ריפוי PDMS ובסיס אלסטומר סיליקון הם מרכיבים של ערכה זו. |
| OpenSCAD | זוהי תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית חינמית (http://www.openscad.org/) המשמשת לעיצוב התבנית של המכשיר המיקרופלואידי. | ||
| AutoCAD 2014 Autodesk | זוהי תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) המשמשת לעיצוב המסכה המשמשת להכנת מערך ננו-סיבים. | ||
| מדפסת תלת מימד, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| שרף הניתן לריפוי UV, AR-M2 | Keyence | זה משמש להדפסת תלת מימד על ידי Agilista. | |
| חומצה אצטית | סיגמא | #338826 | ≥ 99.99% |
| אתיל אצטט | סיגמא | #270989 | נטול מים, 99.8% |
| טטרהידרופוראן (THF) | סיגמא | #401757 | |
| MSP-30T | מכשיר | מכונת מקרטעת מגנטרון | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | זוהי פלטת בסיס פוליסטירן שעליה נוצר מערך הננו-סיבים. גודל צלחת זה הוא בדרך כלל 127.7 x 85.5 מ"מ. |
| מכונת פריקת קורונה מסוג אקדח | שינקו אלקטריק & מכשור | CFG-500 | מכשיר שימושי זה משמש ליצירת עטרה להפעלת המשטח התחתון של שכבת ה-PDMS בשלב 1.5 "הרכבת מערכי MACME" בפרוטוקול. |
| מזרק 5 מ"ל | Terumo | SS-05SZ | |
| מחט קהה מנירוסטה (מד 23) | Nipro | #2166 | הקוטר והאורך החיצוניים הם 0.6 ו-32 מ"מ, בהתאמה. |
| ספק כוח במתח גבוה | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified | Matrix Corning | #354277 | חלבון זה מתייחס כמטריצת ג'ל ממברנת הבסיס בפרוטוקול. |
| CellStick Vitronectin, Human, פתרון | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | מדיום תרבית ללא מזין וללא קסנו לתחזוקה של תאי ES ו-iPS אנושיים |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), פנול | אדום תרמו פישר מדעי | #12605028 | זהו פרוטאז רקומביננטי דמוי טריפסין לדיסוציאציה של תאי יונקים דבקים. |
| ערכת הדמיה Click-iT EdU עם Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher | Scientific C10086 | התיוג הפלואורסצנטי של תאים מתרבים בצביעה פלואורסצנטית על הצלחת בוצע לאורך מדריך המוצר של ערכה זו. |
| נספח V, Alexa Fluor 594 מצומד | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 נוגדן (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| חמור נגד עכבר IgG H& L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | זהו נוגדן משני המשמש לצביעה של תאים פלואורסצנטיים על הצלחת. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | זהו מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בעדשת אובייקטיבית CFI Plan Fluor 4&/0.13 N.A. (Nikon), מצלמת CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), מנורת כספית (Intensilight, Nikon), שלב אוטומטי XYZ (שלב ממונע Ti-S-ER עם מקודדים, ניקון), וקוביות סינון לארבע תעלות פלואורסצנטיות (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | זוהי תוכנת הדמיית מיקרוסקופ המשמשת לרכישת תמונות אוטומטית. | |
| CellProfiler, גרסה 2.1.0 | זוהי תוכנה פתוחה בחינם לניתוח תמונות תאים (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM מבוצע על ידי חבילת kohonen של תוכנה זו. זה זמין בחינם (https://www.r-project.org/). | ||
| אשכול 3.0 | זוהי תוכנת אשכולות הקוד הפתוח (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). אשכולות היררכיים ללא פיקוח מתבצעים באמצעות תוכנה זו. | ||
| Java TreeView | תוכנת קוד פתוח זו (http://jtreeview.sourceforge.net/) משמשת להמחשת נתוני אשכולות כמפת חום ודנדרוגרמה. | ||
| H9 תאי גזע עובריים אנושיים | בנק תאי גזע WiCell | WA09 |
מקורות
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
