הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57383

⸱

14 במאי 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

תקציר

הדמיה לחיות תאים היא טכניקה רב עוצמה שיכול לשמש ישירות להמחיש תופעות ביולוגיות בתאים יחיד במשך פרקי זמן ארוכים. בעשור האחרון, טכנולוגיות חדשני יש שיפור משמעותי את המעשיות של הדמיה לחיות תאים. התאים עכשיו ניתן לשמור בפוקוס, באופן רציף עם תמונה על פני כמה ימים תוך מתוחזקים תחת 37 °C ו- 5% CO2 תנאים התרבות תאים. יתר על כן, המבט של שדות מרובים, המייצג תנאים ניסויים שונים ניתן לרכוש בו זמנית, ובכך לספק נתוני הניסוי תפוקה גבוהה. הדמיה לחיות תאים מספק יתרון משמעותי על פני תאים קבוע הדמיה על-ידי מתן עבור פריט חזותי ישיר וכימות הטמפורלי של אירועים הסלולר דינמי. הדמיה לחיות תאים יכולים לזהות גם וריאציה בהתנהגות של תאים בודדים שאת אחרת הוחמצו באמצעות מבחני מבוסס-אוכלוסייה. כאן נתאר פרוטוקולים הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic... נדגים שיטות לדמיין אם mitotically נעצר למות תאים ישירות מתוך מיטוזה או להחליק בחזרה לאטמוספרה. גם נתאר כיצד מערכת מחזור התא מבוסס ubiquitination פלורסנט מחוון (FUCCI) ניתן להשתמש כדי להעריך את השבר של תאים לאטמוספרה נולד מן החלקה mitotic מסוגלים להזין מחדש את מחזור התא. לבסוף, אנו מתארים שיטה הדמיה לחיות תאים לזיהוי אירועים קרע מעטפת הגרעין.

מבוא

תרופות אנטי-mitotic זמן רב השתמשו ב- משטרי כימותרפיות של סוגים שונים של גידולים מוצקים, לעתים קרובות להציג את היעילות הגדולה1,2,3. Mechanistically, תרופות אלו לשבש את התקדמות mitotic נורמלית ולקדם mitotic למעצר מתרבים במהירות תאים סרטניים. עם זאת, גורל, בתגובה למעצר mitotic זה משתנה מאוד: בעוד שבריר של תאי עובר מוות של תאים ישירות מתוך מיטוזה, יציאה של מיטוזה ואחרים לחזור לאטמוספרה כתאים tetraploid (תהליך הנקרא גלישה mitotic)4, 5,-6,-7,-8. תאים אלה לאטמוספרה יכול לבצע אפופטוזיס, עוברים קבוע מחזור התא מעצר או אפילו להזין מחדש את מחזור התא4,5,6,7,8,9 10, ,11. תאים להתחמק מוות תאי mitotic על ידי מחליקה לתוך לאטמוספרה, רק להזין מחדש את מחזור התא בעקבות הסרת סמים, עשויים לתרום לכן הופעתה של אוכלוסיות תאים סרטן. יתר על כן, תאים כי לחמוק מן מיטוזה הן tetraploid, tetraploidy ידוע לקדם יציבות כרומוזום שמניע הגידול נסיגה12,13,14,15. הגדרת הגורמים השולטים גורל בתגובה טיפולים תרופות אנטי mitotic לכן קריטי כדי למטב את הרפוי הנוכחי.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ישירות להתבונן וללמוד את גורלו של תאים עוברים מעצר ממושך mitotic בתגובה פקליטקסל אנטי-mitotic סמים. פקליטקסל היא הוותיקה טיפולית במרפאה הוכיח תכופה בסוגי גידולים רבים, כולל אלה של השד, השחלות והריאות16,17,18,19, 20-פקליטקסל, אשר אלקלואיד צמח נגזר מקליפת עץ הטקסוס, מייצבת microtubules, וכך מונע שלהם21,dynamicity22. בעוד לשבור של דינמיקה microtubule מאת פקליטקסל אינה משפיעה על מחזור התא התקדמות של גרם1 G2, התרופה להוביל ההפעלה מתמשכת של המחסום מכלול ציר במהלך מיטוזה על ידי הפרעה קינטוכור-microtubule מצורף (נבדקה לעומק כאן23,24)25. כתוצאה מכך, "אנאפאזה" תחילת נמנעת ב תאים שטופלו פקליטקסל ותוצאות mitotic מעצר ממושך.

פרוטוקול זה יתאר תחילה גישות לזהות תאים mitotic בניסויים הדמיה לחיות תאים. מיטוזה, ניתן לאבחן בתאים תרביות רקמה חסיד בשל שני שינויים ביולוגיים תא מורגש. ראשית, כרומוזומים להיות מרוכז מאוד מייד לפני התמוטטות מעטפת הגרעין. אמנם, לעיתים קרובות ניתן לגילוי על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות סטנדרטי כרומוזום עיבוי יכול באופן ברור יותר יזוהו באמצעות פלורסנט מתייג את תווית כרומוזומים (למשל היסטון שכותרתו fluorescently חלבונים). השני, mitotic תאים גם יכול להיות מזוהה על ידי השינויים הדרמטיים מורפולוגי הנובעים תא עיגול.

פרוטוקול זה ואז תדגים כיצד להשתמש גישות הדמיה לחיות תאים כדי לאתר את גורלם של התאים חווים מעצר mitotic ממושך. תאים נעצרה מיטוזה עוברים אחד הגורל ברורים. ראשית, תאים יכול לעבור מות תאים במהלך מיטוזה. תופעה זו הוא מדמיין בקלות על ידי מיקרוסקופ אור, כמו תאים הגוסס שנצפו הפסיכיאטר, bleb, ו/או קרע. שנית, תאים יכולים לצאת מן מיטוזה, לחזור בחזרה לאטמוספרה ללא הפרדה בין כרומוזום או ציטוקינזה, תהליך הנקרא mitotic החלקה. את decondensation של כרומוזומים ו/או את שיטוח של התא mitotic ברצון מזהה תהליך זה. התאים לגלוש בין מיטוזה גם לעתים קרובות להציג גרעינים לא סדיר, מרובי אונות, לעתים קרובות הנמל micronuclei מספר5. שלישית, התאים נעצרה מיטוזה יכול ליזום את "אנאפאזה", להמשיך דרך מיטוזה לאחר עיכוב ארוך. בעוד נדיר בריכוזים גבוהים של סמים, התנהגות זו עולה כי התאים נעצר ייתכן ששיחת במחסום מכלול ציר, או כי המחסום מכלול ציר הוא נחלש חלקית או לקויה. תחילת "אנאפאזה", ניתן לאבחן על ידי כרומוזום סגרגציה ציטוקינזה עוקבות באמצעות הדמיה לחיות תאים.

שיטות הדמיה לחיות תאים כדי לעקוב אחר גורלם של תאים להתחמק מוות תאי mitotic מאת שעברו החלקה mitotic גם יתוארו. התאים עוברים החלקה mitotic למות. לאטמוספרה עוקבות, להפעיל מעצר עמיד של מחזור התא1 G או הזן מחדש את מחזור התא ליזום סבב חדש של חלוקת התא4. גישה באמצעות המערכת (מחזור התא מבוסס ubiquitination פלורסנט מחוון) FUCCI כדי לקבוע את השבר של תאים הזן מחדש את מחזור התא בעקבות גלישה mitotic יתוארו. FUCCI מאפשר פריט חזותי ישיר של המעבר /S1G, ניתן להשתמש בשילוב עם לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה26,גם במבחנה וגם ויוו27. מערכת FUCCI לוקח את היתרונות של שני חלבונים fluorescently שכותרתו, קטום צורות של hCdt1 (כרומטין הרישוי של שכפול ה-DNA גורם 1) ו- hGeminin, רמות אשר נעים בהתבסס על מיקום מחזור התא. hCdt1 (דבוקה חלבון פלואורסצנטי אדום) נוכח ברמה גבוהה במהלך שלב1 G איפה שהוא פועל רשיון ה-DNA לצורך שכפול, אבל הוא ubiquitinated על ידי ליגאז אוביקוויטין E3 SCFSkp2 והשפילו במהלך שלבי /M2S/G כדי למנוע שכפול מחדש של ה-DNA26. לעומת זאת, הוא מעכב של hCdt1 אשר רמות שיא במהלך S/G2/M hGeminin (דבוקה של חלבון פלואורסצנטי ירוק), אבל היא ubiquitinated על-ידי E3 ליגאז אוביקוויטין APCCdh1 והשפילו בקצה של מיטוזה ולאורך ג'י1 26. כתוצאה מכך, FUCCI מספק פלורסצנטיות פשוטה מפרט. של החלקים שלב מחזור התא, כמוצג תאים פלואורסצנטי אדום במהלך פלורסצנטיות1, ו- green G במהלך S/G2/M. מערכת FUCCI היא התקדמות משמעותית על גישות אחרות (כגון צביעת bromodeoxyuridine) כדי לזהות תאים המקדימות, כי היא לא דורשת קיבוע תא, מאפשר הדמיה תא בודד ללא הצורך נוספים תרופתי טיפולים כדי לסנכרן את אוכלוסיות תאים. אך לא נדון במסגרת פרוטוקול זה, חיישנים לחיות תאים נוספים גם פותחו כדי להמחיש התקדמות מחזור התא, כולל חיישן הליקאז B G128, DNA ליגאז-RFP29 , PCDNA-GFP30 חיישנים S-פאזי, החיישן FUCCI-4 האחרונות, אשר מזהה בכל שלבי מחזור התא31.

לבסוף, שיטת הדמיה לחיות תאים כדי לזהות קרע מעטפת הגרעין יתוארו. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי המעטפות גרעיני של תאים סרטניים הם לא יציבה ונוטה להתפרץ, ובכך לאפשר את התוכן של נוקלאופלזמה, הציטופלסמה להתערבב. תופעה זו, כינה קרע גרעינית, יכול לקדם נזק לדנ א וגירוי של תגובה חיסונית מולדת32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. בעוד הגורמים הבסיסיים של קרע גרעיני להישאר שהיישום מאופיין, ידוע כי דפורמציות במבנה הגרעין לתאם עם שכיחות מוגברת של קרע גרעיני42. אפקט ידוע אחד של טיפול פקליטקסל הוא הדור של מבנים גרעיני חריג בצורה בולטת בעקבות מיטוזה; ככזה, שיטה באמצעות הדמיה לחיות תאים לכמת קרע גרעיני יתוארו, בעת סיור גם אם פקליטקסל לטיפול מגדיל את תדירות האירועים קרע גרעינית. קרע גרעיני יכול יזוהו על-ידי דליפת חלבון פלואורסצנטי גרעיני במיקוד שנצפה לתוך הציטופלסמה (למשל דיימר טנדם חוזר של RFP דבוקה אות לוקליזציה גרעינית, TDRFP-NLS). דליפה זו מוצגת בפירוש לפי העין, אשר מאפשרת כימות פשוטה אירועי קרע.

פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ epifluorescence widefield, אשר מצויד עם הבמה מקודד, תוכנה autofocusing שותק. השלב מקודד מאפשר תנועה אוטומטי מדויק קואורדינטות X-Y מוגדר, בזמן פוקוס אוטומטי התוכנה שומרת על תאים בפוקוס למשך כל תקופת הדמיה. בנוסף, פרוטוקול זה דורש ציוד כדי לשמור על תאים ב 37 ° C עם humidified 5% CO2 אווירה. זו יכולה להיות מושגת על-ידי תחימת המיקרוסקופ כולו בתוך חום, אווירה מבוקרת מארז, או באמצעות מכשירים הבמה-העליון כך מקומית שומר על הטמפרטורה והסביבה. המטרה בשלב ניגודיות בשימוש פרוטוקול זה היא עבור תוכנית חיל הים 10 x עם הפתח המספרי של 0.30. עם זאת, המטרות X 20 מספיקים גם לזהות שני תאים מעוגלים לאטמוספרה mitotic, שעברו שיטוח מוקד מטוס בודד. אם ביצוע שלב-ניגודיות הדמיה (כמתואר בשיטה זו), המכסה יכול להיות או זכוכית או פלסטיק. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד (DIC) התערבות דיפרנציאלית, זה הכרחי כדי להשתמש לכסות זכוכית כדי למנוע דפולריזציה של אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש ללא טרנספורמציה ויציב chromosomally ברשתית פיגמנט אפיתל (RPE-1) תא הקו לניסויים הדמיה לחיות תאים. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים כל קו תא חסיד כל עוד התא תרבות בתנאים מותאמים לפי הצורך. כל ההליכים חייבת לדבוק אבטחה מוסדיים, מנחים ותקנות.

1. הכנת התאים הדמיה לחיות תאים

  1. להשתמש בתאים RPE-1 מעבר טרי המופשרים ותחילת ביטוי אנושי היסטון שויזת עבודה H2B דבוקה חלבון פלואורסצנטי (למשל ויזת עבודה H2B-GFP), או את מערכת FUCCI (פרוטוקול מפורט על איך ליצור תאים לבטא FUCCI ניתן למצוא התייחסות45) כדי להעריך את גורל mitotic.
    1. כדי למדוד את התדירות של קרע גרעינית, שימוש תאי RPE-1 לבטא ויזת עבודה H2B-GFP והן דיימר טנדם של חלבון פלואורסצנטי אדום דבוקה אות יחיד לוקליזציה הגרעין (TDRFP-NLS).
      הערה: בונה של שלושה חלבונים ניאון ירוק התמזגו במשולב לאות לוקליזציה גרעיני יחיד (GFP3- NLS) היו בשימוש גם להפגין קרע (כמו התייחסות42).
    2. לשמור על תאים על 10 ס מ צלחות תרביות רקמה במצע הגידול המתאים. תאי RPE-1 נשמרים בפנול אדום חינם, F-12 ששינה נשר בינוני/מזין תערובת של Dulbecco (DMEM:F12) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) 100 IU/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/מ ל.
  2. האחות בינוני את התאים, כדי לבשל תרביות רקמה עם 10 מ ל תמיסת מלח סטרילית, טמפרטורת החדר פוספט buffered (PBS) הסר בינוני הנותרים ולאחר מכן מחוק לגמרי מגניב.
    1. להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין עם חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לתאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות או עד רוב התאים יש מנותקת לצלחת.
      הערה: לא שומרים תאים בטריפסין יותר הדרושים.
  3. להוסיף 10 מ של מדיום מלאה כדי לאסוף את התאים trypsinized עם stripette סרולוגית 10 מ ל לוותר על צינור חרוטי 15 מ"ל.
    1. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב x 180 גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. וארוקן את תגובת שיקוע, נזהר שלא לשבש את צניפה, ואז ביסודיות resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום חדש על-ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה המדיום stripette סרולוגית.
  5. השתמש hemocytometer או אוטומטיות תא ספירת מכונת לספור תאים46.
    1. לדלל בתאים צינור חרוטי ל 30,000 תאים למ"ל בינוני מלא.
    2. צלחת 30,000 RPE-1 תאים (1 מ"ל נפח) לכל טוב של זכוכית 12-ובכן עם תחתית (עובי #1.5) הדמיה המנה כדי להשיג צפיפות הסלולר נדרש למחרת (30%-50% confluent).
      הערה: תמיד לטפל לצלחת עם כפפות, להיזהר לא לגעת בקרקעית הזכוכית.
  6. מאפשרים לתאים לגדול בחממה תרביות רקמה 37 ° C עד שהם לחלוטין לצרף ולשטח על הצלחת הדמיה תת. בעוד תאים באפשרותך לצרף קצת כמו 4 שעות, מומלץ כי התאים הם לא לטפל בתרופות ולא עם תמונה עד למחרת היום.
  7. הוסף פקליטקסל (מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) לריכוז הסופי הרצוי שלם בינוני, מערבבים היטב.
    1. להכין בינוני מלא עם אמצעי אחסון שווה של דימתיל סולפוקסיד לבד כדי להשתמש בפקד.
    2. חמים המדיום המכיל סם או דימתיל סולפוקסיד עד 37 ° C לפני הוספת תאים. פעולה זו תמנע את הסחף מוקד עקב שינוי טמפרטורה פתאומי.
    3. להוסיף 1 מ"ל של מדיום פקליטקסל או דימתיל סולפוקסיד לבד כדי בארות בודדים של המנה הדמיה 12-ובכן הכוללת.

2. הגדרת המיקרוסקופ עבור הדמיה לחיות תאים

  1. ניקוי הזכוכית-התחתון של המנה הדמיה עם שואב האבק אופטי כדי להסיר את כל טביעות אצבעות או אבק שעשויים להפריע הדמיה. להשתמש מנקה אופטי מספיק כדי להרטיב את המשטח כולו זכוכית.
  2. למקם את צלחת זכוכית-התחתון על השלב מיקרוסקופ מתאם מאכל הדמיה, הסר את מכסה פלסטיק מתוך קערה ולאחר מכסים את תא זכוכית. להבטיח שהחדר יש שסתום כדי לאפשר זרימה קבועה של אוויר בהיקף של 5% CO2.
    הערה: כדי ללחלוח 5% CO2, הגז מוזרם דרך צינורות מוכנס לתוך אמבט מים סטריליים דיור. דבר זה מאפשר הגז להפוך equilibrated ל 95% לחות.
  3. החניך/כיול הבמה המקודד באמצעות התוכנה לשליטה המיקרוסקופ. זה להבטיח קואורדינטות X-Y מדויקות ולמנוע להיסחף מוקד.
  4. להתמקד התאים באמצעות אופטיקה חדות שלב ולבצע תאורה קולר (המתוארים בפירוט הפניה47) כדי למקד את האור ולספק חדות אופטימלית.
  5. השתמש רכישת תוכנה כדי לקבוע את זמני חשיפה אופטימלית עבור אור לבן וערוצי כל פלורסנט בשימוש (חשיפות כי לתת 75% רוויה פיקסל המצלמה הם אידיאלי, בתנאי זה כמות האור אינה רעילה לתאים).
    1. השתמש רכישת תוכנה כדי לבחור מספר, שאינם חופפים שדות ראייה מכל קידוח עבור הדמיה. בחר אזורים הדמיה יש דבקה גם הזכוכית-התחתון ואיפה הם בין 50% ל- 70% confluent תאים. הימנע אזורים של תאים גושית, כמו פעולה זו תגרום לאחר מכן ניתוח קשה.
      הערה: חשוב לי המבט של שדות שאינם חופפים מכל קידוח כדי למנוע מעקב לאותם התאים פעמיים. אם התאים נמצאים תאי מאוד, ייתכן צורך לרכוש מספר תמונות מקרין החוצה הנקודה המרכזית, תפר שאותם בחזרה ביחד לעשות אחד גדול שדה ראייה.
  6. להפעיל התכונה של המיקרוסקופ autofocusing שותק להבטיח שכל הנקודות נשמרות בפוקוס משך זמן הניסוי.
  7. כדי להעריך את גורל mitotic, להגדיר את התוכנה הדמיה כדי לאסוף תמונות תצוגה של כל שדה שנבחר בכל 10 דקות עבור למעלה כדי ה 96 Unperturbed מיטוזה נמשך 20 – 40 דקות, ובכך 10 דקות מרווחי יספק מספיק דגימה לזהות בעת חלוקת התאים. כדי לזהות קרע הגרעיני, שהוא אירוע חולף, לרכוש תמונות כל 5 דקות.
    הערה: ודא שהמחשב נהיגה התוכנה רכישת התמונה כולל עדכון אוטומטי, שומרי מסך ו מצבי חיסכון באנרגיה זמינה, כמו אלה יכולים לעיתים להפריע ייבוא תמונות על ניסויים זמן.
  8. ליזום את הניסוי הדמיה. מעת לעת לאשר כי ייבוא תמונות פועל בצורה חלקה במהלך הסרטון.

3. וידאו ניתוח לזיהוי גורל בתגובה פקליטקסל

  1. לאשר כי תאים שבעורך הם בריאים לאורך כל הקורס של הניסוי הדמיה. תאי בקרה שטופלו דימתיל סולפוקסיד צריך להיות פעיל מתרבים ובר קיימא.
    הערה: אם תאים שהפגינו סימנים של מתח, לא quantitate הוידאו ולהתרכז מיטוב תנאים הדמיה48. סימנים של הדמיה מתח כוללים תאים מתים/blebbing, תאים להיכשל לצרף/ממרח בצלחת ותאים להציג אינדקס mitotic נמוכה ו/או ממושך מיטוזה. מקורות אפשריים של מתח כוללים תנודות בטמפרטורה או רמות2 CO בתוך הדמיה קאמרית או phototoxicity48.
  2. כאשר הדמיה תצוגה של שדה שלמה עם 10 X או המטרה X 20, מאות תאים בודדים עשוי להיות נוכח. לכן, כדי לסייע עם כימות, לחלק את שדה הראיה הגזרות קטנים באמצעות כלי תוכנה הזמינים. ציון תאים בתוך כל רביע בנפרד (כפי שמתואר צעדים 3.3.1–3.6.2).
  3. בעת ניתוח הוידאו, מעקב אחר כל תא בתצוגה ממוזג באמצעות ניגוד שלב ו/או בתמונות פלורסנט. השתמש בכלי ניתוח תוכנה ליצירת התצוגה הממוזג.
    1. החל בתחילת הסרטון, לזהות תא יחיד לאטמוספרה ולעקוב אחר ההתקדמות שלה דרך מחזור התא באמצעות אופטיקה שלב. כדי לעקוב אחר לתא בודד, להתבונן התא ממסגרת למסגרת לפי העין. לזהות תאים לאטמוספרה בשל מורפולוגיה שעברו שיטוח שלהם (כמו המוערך על ידי ניגודיות שלב) וחוסר עיבוי הדנ א שלהם (כפי לאומדן ויזת עבודה H2B-GFP) (איור 1 א').
  4. לזהות תאים מזינים מיטוזה על ידי התבוננות תא עיגול (באמצעות שלב-ניגודיות אופטיקה) ו/או עיבוי כרומוזום (באמצעות ויזת עבודה H2B-GFP) (איור 1 א'-C). עיבוי עיגול, כרומוזום בשני תאים הם דמיינו בקלות לפי העין.
    1. להוסיף את הזמן כאשר התא נכנס מיטוזה. המשך מעקב התא עד שהוא מגיע גורלה ("אנאפאזה" כמו שלב 3.5, מוות של תאים של מיטוזה כמו שלב 3.6.1 או גלישה mitotic כמו שלב 3.6.2).
  5. תאים שליטה עליו ביעילות ליישר את הכרומוזומים שלהם, הזן "אנאפאזה" בתוך 1 h (איור 1D). לדמיין את "אנאפאזה" מאת אופטיקה חדות שלב כמו התא מתחיל לכאוב לתוך שני או באמצעות ויזואליזציה של כרומוזומים poleward-המעבר המסומנת ויזת עבודה H2B-GFP (איור 1 א'). להוסיף את הזמן כאשר התא עובר "אנאפאזה".
  6. לעומת זאת, תאים שטופלו פקליטקסל יישאר מעוגל עם כרומוזומים מרוכז במשך מספר שעות (h 3-40) (איור 1B-D).
    1. לזהות תאים נעצר mitotically שעוברים מוות של תאים.
      הערה: תאים מתים במהלך מיטוזה הם דמיינו ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ, כמו תאים bleb, לכווץ, ו/או קרע (איור 1B). אם הדמיה ויזת עבודה H2B-GFP, הכרומוזומים גם קטע במהלך מוות של תאים.
    2. לזהות תאים נעצר mitotically עוברים תא החלקה.
      הערה: תאים עוברים החלקה mitotic הם נצפו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, כפי שהם לשטח בחזרה החוצה לתוך לאטמוספרה decondense הכרומוזומים מבלי שעברו "אנאפאזה" (איור 1C). התאים עוברים החלקה mitotic להצמיח תאי tetraploid גדולים כי הם לעיתים קרובות multinucleated (איור 1C).
  7. המשך מעקב אחר תאים של שדה הראייה המקורית. לאחר מעקב אחר מנקודת מבט כל שדה, לעבור תצוגה של שדה נפרדת שנרכשה מן הדבר טוב והמשך מעקב אחר תאים.

4. וידאו ניתוח לזיהוי גורל בעקבות גלישה Mitotic

  1. להעריך את גורל בעקבות גלישה mitotic (כפי שמתואר בשלב 3.6.2) באמצעות תאי RPE-1 לבטא את המערכת FUCCI. בנוסף הדמיה שלב-חדות, יש צורך לרכוש פלואורסצנטי אדום (מעיד על שלב1 G) ותמונות (מרמז על S/G2/M) ירוק זריחה).
    1. מעקב אחר תאים FUCCI RPE-1 כפי שמתואר בשלב 3.3 דרך 3.7.
      1. כדי לוודא כי מערכת FUCCI פועל כראוי, לאמת את השליטה תאים חלופי לביטוי החלבונים ניאון אדום וירוק דרך ניתוח של הנתונים הדמיה לחיות תאים. תאים שליטה השינוי יתבצע להיתקל פלואורסצנטי אדום לגמרי גרעינית כדי מפגין פלורסצנטיות ירוק לחלוטין הגרעין במהלך לאטמוספרה כהתקדמות תאי G1 לשלב S. תאים צריך להמשיך מפגין פלורסצנטיות ירוק לאורך כל ביצוע מיטוזה. מייד לאחר מיטוזה, תאים צריך להפגין שוב פלואורסצנטי אדום לחלוטין במהלך לאטמוספרה.
        הערה: בעוד שיטות קיימות לכמת עוצמות קרינה פלואורסצנטית RFP והן GFP מן המערכת FUCCI של תאים בודדים באמצעות עקבות פלורסנט49, זה לעתים קרובות לא נחוץ שינוי הצבע פלורסצנטיות הוא גלוי על-ידי העין ועמיד.
  2. לזהות תאים נעצרה מיטוזה באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, לאתר אותם עד שהם עוברים החלקה mitotic, כמתואר ב- 3.4 ו 3.6.2. תאים שישנה להחליק מחוץ מיטוזה ולתוך בחזרה לאטמוספרה להיתקל פלורסצנטיות ירוק במהלך מיטוזה כדי פלואורסצנטי אדום במהלך שלב1 G (איור 2 א- ג).
    1. מעקב אחר אלה החליקה תאים באמצעות ניגוד שלב והדמיה פלורסנטי לפי העין כדי להעריך את גורלם תא (איור דו-ממדי).
      1. לזהות תאים הזן מחדש את מחזור התא. תאים אלה מזוהים על ידי השינוי האדום-כדי-ירוק בביטוי פלורסצנטיות, באמצעות מערכת FUCCI המציין מעבר /S1G (איור 2 א).
      2. לזהות תאים עוברים G1 מחזור התא מעצר. תאים אלה מזוהים על ידי ביטוי של פלואורסצנטי אדום אשר נמשך > 24 שעות (איור 2B).
      3. לזהות תאים מתים לאטמוספרה. תאים אלה מזוהים על ידי תאי קרע/blebbing/כיווץ באמצעות הדמיה שלב-ניגודיות (איור 2C).

5. ניתוח וידאו לזהות את התדירות של מעטפת הגרעין קרע

  1. השתמש תאי RPE-1 לבטא ויזת עבודה H2B-GFP, TDRFP-NLS כדי להעריך את מעטפת הגרעין קרע. בנוסף הדמיה ניגודיות שלב, רוכשים פלואורסצנטי אדום (TRITC) ותמונות פלורסצנטיות ירוק (FITC). לרכוש תמונות כל 5 דקות כדי להמחיש את הקרע.
    הערה: חיוני ליצירת שורות תאים שבו TDRFP-NLS ביעילות מיובאים לתוך הגרעין עם פלורסצנטיות cytoplasmic מינימלי.
  2. תאים תמונה כפי שמתואר בשלב 3.3 דרך 3.4. האות זריחה TDRFP-NLS של ויזת עבודה H2B-GFP צריך להתאים במשותף במהלך לאטמוספרה. על מיטוזה (כמו מטמיעים לתא עיגול באמצעות עיבוי אופטיקה ו/או כרומוזום שלב על ידי ויזת עבודה H2B-GFP), מעטפת הגרעין יהיה לשבור ויהפוך האות TDRFP-NLS cytoplasmic (איור 3 א). בעקבות מיטוזה, מעטפת הגרעין ישנה בתאי הבת ויהפוך האות TDRFP-NLS גרעינית.
  3. מעקב אחר תאים הבת ברחבי לאטמוספרה עוקבות על-ידי הדמיה לחיות תאים. זיהוי אירועים קרע גרעינית על ידי התבוננות פרץ ארעית של גרעיני מותאם לשפות אחרות TDRFP-NLS לתוך הציטופלסמה שמסביב. תוך דקות, מעטפת הגרעין יתוקנו, TDRFP-המודיעין relocalized את הגרעין (איור 3 א).
    הערה: לעתים קרובות, ה-DNA הגרעיני, כפי דמיינו ידי ויזת עבודה H2B-GFP, יראו לבלוט באתר קרע כמו bleb קטן.
  4. ציון השבר של הגרעינים עוברים אירוע להיקרע במהלך לאטמוספרה. ניקוד זה שבר, לספור את מספר התאים עוברים אירוע להיקרע מעל המספר הכולל של תאים מסומנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, תאי RPE-1 לבטא ויזת עבודה H2B-GFP היו מטופלים עם פקד אנטי mitotic או רכב (דימתיל סולפוקסיד), נותחו על ידי הדמיה לחיות תאים. ניתוח גילה כי 100% תאי RPE-1 mitotic שליטה יזם "אנאפאזה" ממוצע של 22 דקות לאחר הזנת מיטוזה (איור 1 א', ד 1). לעומת זאת, תאי RPE-1 מטופלים עם פקליטקסל הציג מעצר mitotic מעמיק שנמשך כמה שעות (איור 1D). הדמיה חשפה כי 48% של תאים mitotically נעצר אלה עברו מוות תאי m...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההיבט הקריטי ביותר של הדמיה לחיות תאים לטווח ארוך זה להבטיח את בריאותו של התאים להיות עם תמונה. זה חיוני כי תאים להיחשף מינימלי לחצים סביבתיים חיצוניים, כגון תנאים ירודים לגבי טמפרטורה, לחות, ו/או CO2 רמות. חשוב גם להגביל את נזקי מ תאורה פלורסנט עירור, הדמיה מתח הידוע להשפיע על התנהגות תא50. הגבלת נזקי יכול להיעשות בדרכים רבות כמו מפורט במקום48. באופן כללי, מומלץ להשתמש בזמן חשיפה הקצר ביותר הדרושה להפקת אות פלורסצנטיות מספיק בהיר מספיק לעקוב ביעילות תאים, ובכך י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

AFB, MAV, NJG רוצה להודות ריאן קווינטון להערות על כתב היד, אדריאן Salic עבור TDRFP-NLS הבונה. AFB ו MAV ממומנות על ידי 5T32GM008541 NIGMS למערכות ביולוגיות פרמקולוגיה הכשרה גרנט. NJG הוא חבר של בימוי ותסריט, מעבדות מחקר של סרטן השד Dahod אשרף, נתמכת על ידי NIH מענקים GM117150, CA-154531, קרן Grunebaum קארין, התוכנית פרסים משפחת סמית, התוכנית מלומדים סרל ומחקר של מלנומה ברית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פנול נטול אדום, DMEM:F12 מדיהHycloneSH3027202
10% סרום בקר עוברי (FBS)Gibco10438026
100 IU/ml פניצילין, ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין.Gibco15070063
PBSGibco10010049
0.25% Trypsin/EDTAGemini50-753-3104
צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית 12 בארותCellvisP12-1.5H-N
PaclitaxelTSZ ChemRS036
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SigmaNC0215085
Environmental ChamberIn Vivo Scientific
5% CO2AirgasZ03NI7432000201
15 מ"ל צינורות חרוטייםפישרברנד05-539-12
10 ס"מ צלחות תרבית רקמות פוליסטירןFalcon08772E
10 מ"ל פיפטה סרולוגית חד פעמיתפישרברנד4488
5804R 15 אמפר צנטריפוגהEppendorf97007-370
1000 מיקרוליטר פיפטהגילסוןפיפטמן קלאסי
20 מיקרוליטר פיפטהגילסוןפיפטמן קלאסי
p1000 קצות פיפטהשארפp1126
p20 קצות פיפטהשארפp1121
RPE-1 תאיםATCCCRL-4000
חממה גלקסי 170SEppendorfCO17011005
Pipette BoyIntegra156401
המציטומטרפישר סיינטיפיק0267110
Nikon Ti-E-PFS מיקרוסקופ הפוך להדמיית תאים חייםמיקרו מכשירי וידאו, בע"מ
מערכת במה XY קודמת ואור לבן תאורת LEDMicro Video Instruments, Inc.500-H117P1N4
קודם Proscan 3 בקר XYZ עם מקודדיםMicro Video Instruments, Inc.500-H31XYZE
אנדור מצלמה דיגיטליתמיקרו מכשירי וידאו, בע"מD10NLC
Nikon NIS Elements AR SoftwareMicro Video Instruments, Inc.
SOLA LED Illuminator עבור FluorescenceMicro Video Instruments, Inc.SOLA-E
InVivo עם בקרת זרימת CO2Micro Video Instruments, Inc.Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS פוקוס מושלם ממונע אףמיקרו וידאו אינסטרומנטס, בע"
מערכת Ti-C מעבה צריחמיקרו וידיאו אינסטרומנטס, בע"מ
MEL51000 Ti-C LWD LWD יחידת עדשות למערכת מעבה צריחמיקרו וידיאו אינסטרומנטס, בע"מ
Te-C LWD Ph1 מודולמיקרו וידיאו אינסטרומנטס, בע"מ
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16 מ"מMicro Video Instruments, Inc.
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM ObjectiveMicro Video Instruments, Inc.
MEA53100MQS31000תא סביבתי מMEP59391MEL56200MEH41100MRH10101MRH48230

מקורות

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411(2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724(2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564(2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101(2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טיפול ב-Paclitaxelהערכת גורל תאיהחלקה מיטוטיתקרע של מעטפת הגרעיןמערכת FUCCIסימון H2B-GFPמיקרוסקופיית ניגודיות פאזהדימוי לטווח ארוךניתוח תא בודד
לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.