מאמר שיטה

סינתזה של צינורות פחמן עם קירות רב שופרת סילבר חלקיקים והערכה של פעילות אנטיבקטריאליות שלהם ומאפיינים ציטוטוקסיות

DOI:

10.3791/57384

⸱

10 במאי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, ננו מיקרוביאלית היו מסונתז על ידי חמצון חומצי צינוריות פחמן multiwalled ומשקעים חותכות עוקבות של סילבר חלקיקים. פעילות מיקרוביאלית בדיקות cytotoxicity בוצעו עם ננו מוכן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, עם קירות רב פחמן (MWCNTs) טופלו פתרון חומצה גופרתית מימית כדי ליצור קבוצת פונקציונלית מבוססת חמצן. MWCNTs כסף הוכנו על ידי בתצהיר מוטעה של כסף מן תמיסה מימית של AgNO3 על MWCNTs מחמצנים. בהתחשב צבע ייחודי CNTs, לא ניתן היה להחיל אותם על הריכוז המעכב המינימלי או מבחני רעילות מיטוכונדריאלי כדי להעריך את המאפיינים רעילות ו אנטיבקטריאלי, מאז הם היו מפריעים מבחני. עיכוב אזור וריכוז אחרים המינימלי עבור Ag-MWCNTs נמדדו, חי/מת Trypan Blue מבחני שימשו כדי למדוד את המאפיינים רעילות ו אנטיבקטריאלי ללא הפרעה עם הצבע של CNTs.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הסופית של מחקר זה היא להפוך אותו ליצור biofilms ננו אנטי בקטריאלי ידידותי לסביבה זה יכול לעכב את הצמיחה של חיידקים. אלה ננו אנטי בקטריאלי יש פוטנציאל להתגבר על הבעיות ההתנגדות רעילות, אנטיביוטיקה של כימיקלים נפוצים או תרכובות כימיות לאנטיביוטיקה. ממבנה biofilm הוא רטוב חוץ-תאית פולימריים חומר (EPS) המורכבת סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, ושומנים1,2. Biofilms למנוע החדירה של חומרים זרים ולעזור חיידקים לגדול נמרצות3,4. Biofilms לגרום מחלות זיהומיות כרוניות5,6וריח. Methylobacterium spp., לדוגמה, גדל על ידי שמירת מקומות בהם מים היא תמיד נוכח או שבהם קשה להבטיח חיסול חיידקים על בסיס מתמשך, כגון מחליפי חום המזגן, חדרי מקלחת ומכשור רפואי. סוגים אלה של biofilms לגרום מחלות זיהומיות כרוניות5,6וריח.

בדרך כלל, כימיקלים או תרכובות כימיות אנטיביוטיקה משמשים כדי לעכב את הצמיחה של חיידקים היוצרים biofilms. הופעתם של חיידקים עמידים בפני אנטיביוטיקה, חששות בטיחות ויוו של כימיקלים משגעים את הצורך לפתח חומרים חדשים כדי למנוע היווצרות של biofilms וכדי לעכב את הצמיחה של חיידקים.

במחקר זה, ננו מיקרוביאלית הם מסונתז חופשיים של עמידות לאנטיביוטיקה ורעילות. כסף הוא חומר מיקרוביאלית ידועים, התפתחויות וננו -טכנולוגיה הובילו מחקר פעיל לתוך ההשפעות מיקרוביאלית של חלקיקי מתכת7,8. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו כי יחס השטח לבנפח גבוה של חלקיקים וגודל קטן לגרום פעילות אנטי-בקטריאלי מוגברת9,10,11.

ננו שהוצגו במסמך זה משלבים סילבר חלקיקים עם מאפיינים מיקרוביאלית מוגברת של פחמן עם יחס רוחב-גובה גבוה, ובכך מגדיל את פני השטח לכל יחידת נפח. ננו-חלקיק כסף מפוברק-פחמן nanotube הפרדות צבע תערוכות מאפיינים מיקרוביאלית משמעותית, רעילות מינימלית לתאי האדם ושל בעלי החיים. התהליכים סינתטי במחקרים קודמים להשתמש צמצום סוכנים מסוכנים כגון NaBH4, formamide, dimethylformamide הידרזין. התהליך הוא מורכב, מסוכן, גוזלת זמן. תהליך סינטטי דיווחו כאן משתמש אתנול כסוכן צמצום משמעותי פחות מסוכנים.

אזור עיכוב של ריכוז אחרים מינימלי (MBC) עבור Ag-MWCNTs נמדדו; חיים/מתים, מבחני Trypan Blue שימשו כדי למדוד רעילות, תכונות אנטיבקטריאליות. הריכוז המעכב המינימלי (MIC), מבחני רעילות מיטוכונדריאלי (MTT) בוצעו לא בשל צבע יוצא דופן של פחמן, אשר היו מתערבים עם מבחני. לבסוף, נקבע ריכוז מינימלי כדי למנוע הצמיחה של Methylobacterium spp. מבלי להשפיע על התאים בתרבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MWCNT חמצון

  1. למדוד 30-50 מ ג של MWCNT לתוך בקבוקון 50-mL. לאט לאט להוסיף 8 מ ל H2אז4: עב ס3 פתרון (90% ריכוז הראשונית, כרך/כרך 3:1) מאת פיפטה עם טיפים פיפטה 1 מ"ל.
    התראה: הכנת להתבצע בשכונה fume כימי.
    1. לאפשר 30 דקות עבור התגובה אקסותרמית להשלים.
  2. Sonicate הפתרון ב 60-80 ° C ל-160 W עבור 1 h עד MWCNT ישקע בתחתית המבחנה.
    התראה: מפלס המים ב- sonicator צריך להיות נמוך מ העליון של המבחנה כך מים לא יוכנסו לתוך הבקבוקון.
  3. להעביר את הפתרון שפופרת צנטרפוגה.
    1. עם micropipette, להוסיף 30 מ של מים מזוקקים dropwise הפתרון MWCNT-COOH.
      התראה: תגובה אקסותרמית חזקה מתרחשת במהלך הוספת מים מזוקקים. להוסיף מים מזוקקים לאט, מאפשרים זמן קירור.
  4. Centrifuge הפתרון MWCNT-COOH-12,000-g ובטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    התראה: בעת ההפעלה צנטריפוגה, ודא שלצנטריפוגה ישמר מאוזן על ידי הנחת צינור עם אותו משקל מול הצינור הדגימה.
  5. הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה, עצה פיפטה 1 מ"ל. הוסף 5 מ של אתנול עם פיפטה, עצה פיפטה 1 מ"ל. לשטוף את דפנות המבחנה עם אתנול pipetted נוספים. Centrifuge הפתרון-12,000-g ובטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    1. לקבוע את ה-pH של תגובת שיקוע בנייר pH. חזור על שטיפה ו צריך שתוציאו עד ה-pH supernatant הוא נייטרלי.
  6. הסר כל תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים כדי לזרז ומעוררים MWCNT-COOH אחיד בפתרון. שזה יבש והקפיא פתרון C º 60 תחת ואקום עד יבש.

2. כסף Nanoparticle התצהיר על MWCNTs

  1. מקום 10 מ ג של MWCNT-COOH צינור חרוטי 50-mL, לדלל עם 30 מ ל מים מזוקקים. Sonicate פתרון-60 ° C ל-160 W עבור 1 h.
  2. מקום 6 מ של N AgNO 0.13 צינור חרוטי 50-mL, לדלל עם 18 מ ל מים מזוקקים. Sonicate פתרון-60 ° C ל-160 W עבור 1 h.
    התראה: להוסיף AgNO3 בפרופורציה המסה הכוללת של MWCNTs כך המסה הכוללת של Ag אינו עולה על 20%.
  3. להוסיף את הפתרון3 AgNO dropwise הפתרון MWCNTs עם פיפטה, 1 מ"ל פיפטה עצה בזמן sonicating את התערובת-60 ° C ל-160 W. המשך sonicating לשעה לאחר הוספת AgNO3.
  4. Centrifuge הפתרון-12,000-g ובטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. Centrifuge הפתרון ולהסיר את תגובת שיקוע פעמיים נוספות.
  5. להוסיף התערובת Ag-MWCNTs 1 מ"ל של מים מזוקקים, לפזר את התמיסה בשכבה אחידה הפתרון. הוסף 5 מ של אתנול ולאפשר את התגובה להמשיך בטמפרטורת החדר מאובטח.
  6. Centrifuge הפתרון-12,000-g ובטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
  7. לקבוע את ה-pH של תגובת שיקוע בנייר pH. חזור על שטיפה ו צריך שתוציאו עד supernatant pH נייטרלי.
  8. להוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים Ag-MWCNTs, לפיזור אחיד בפתרון. שזה יבש והקפיא את הפתרון ב-70 מעלות צלזיוס תחת ואקום במשך 24 שעות ביממה.

3. אזור של עיכוב הבדיקה

  1. מערבבים 18.12 g של אגר R2A ו- 1 ליטר של מים מזוקקים בבקבוקון. לחטא את התערובת ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  2. לאפשר ג'ל להתקרר בטמפרטורת החדר. מקום 10 מ"ל של ג'ל הפטרי לפני התקשות להכין את המדיום מוצק.
  3. המקום 100 µL של חיידקים על המדיום מוצק. מורחים את החיידקים על המדיום מוצק שימוש מפזר.
    התראה: הליך זה להתבצע בשכונה fume כימי מואר עם מנורת אלכוהול.
  4. דגירה כל המנות של 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  5. גרם מיקס 3.12 R2A מרק עם 1 ליטר של מים מזוקקים בבקבוקון. לחטא את התערובת ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. להעביר את המושבות בוגר מדיום נוזלי באמצעות לולאה מחט, דגירה באינקובטור ב 180 סל ד ו- 30 ° C.
  7. להקליט את הערך OD (צפיפות אופטית) על ידי ספקטרופוטומטר UV על 600 ננומטר על בסיס תעריף-שעה כדי למדוד את התפתחות חיידקים.
    הערה: אגר R2A היה בשימוש במבחן הזה, יותר מאשר על אגר מולר-הינטון רגיל, כי R2A אגר המועדפת לצמיחה של Methylobacterium spp.
  8. מקום 10 מיליליטר אגר R2A מוכן בצלחת פטרי להכין אגר התחתון.
    1. מערבבים g 3.12 R2A מרק ו- 8 גרם של אגר עם 1 ליטר של מים מזוקקים. לחטא את התערובת ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות במקום 10 מ"ל של התכשיר על אגר התחתון.
  9. לטעון µL 50 של Ag-MWCNTs פתרון בתקליטור סטרילי נייר עם micropipette.
    1. יבש ולחטא מדגם Ag-MWCNTs תא ואקום תחת אולטרא סגול למשך 30 דקות.
  10. המקום Ag-MWCNTs לדוגמה על אגר.
  11. דגירה של צלחת אגר ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  12. אזור מדידה של עיכוב12.
    הערה: הוראות התוכנה ששימשה נכללות את ההפניות.

4. מבחן אנטיבקטריאלי

  1. חזור על שלבים 3.1 ל 3.7 להכין התרבות חיידקי.
  2. -OD המרבי, לחסן µL 100 של חיידקים לתוך 3 מ"ל של מדיום נוזלי טריים עם טיפ פיפטה מיקרו פיפטה ו- 100-µL.
  3. היכונו חמש 50 דגימות µL של הפתרון בקרת צינורות חרוט 15-mL. להוסיף את הבא כל שפופרת: 1) מתנול; 2) MWCNT µg/mL 1000-COOH; 3) Ag-µg/mL 50-MWCNTs; 4) Ag-µg/mL 40-MWMWCNTs; 5) Ag-µg/mL 30-MWCNTs.
  4. דגירה-180 סל ד ו- 30 ° C עד שהפקד יהיה פעיל מקסימאלית כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר UV כמתואר לעיל.
  5. למדוד את הערך OD של כל מדגם ולחשב את הריכוז מיקרופון. הערך OD קשורה ישירות מספר תאים חיידקיים במרק הדגימה.
  6. מורחים את החיידקים בתרבית על מדיום מוצק עם מפזר.
  7. דגירה המנה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  8. לספור מושבות חיידקים ואת הערכים CFU מידה לקביעת אנטיבקטריאלי12.
    הערה: הוראות התוכנה ששימשה נכללות את ההפניות.

5. הכדאיות Assay

  1. לאחר הסרת התאים תרבות חממה, שאיבה של המדיום, לשטוף שלוש פעמים עם לרחוץ dropwise של 5 מ של PBS.
  2. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ב- PBS תא שטף ו יניקה לאחר 1 דקות.
    1. הקש על הלוח כדי להסיר תאים תקוע.
  3. הוסף 5 מ של DMEM (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco) ולהסיר את התאים. Centrifuge את הדגימות-200 g x עבור 3 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
    1. להוסיף 1 מ"ל של DPBS, לערבב.
    2. ספירת תאים µL 10 של הפתרון עם מכונת ספירת תאים אוטומטית.
      הערה: הוראות עבור מכונת ספירת תאים בשימוש נכללות את ההפניות13.
  4. מקום 1 × 105 תאים AML12 לכל טוב בצלחת שש-ובכן המכיל DMEM פתרון. המדיום מכיל סרום שור עוברית 10% (v/v), אנטיביוטיקה עקר 1%.
  5. דגירה לוח עבור 8-12 h ב 37 ° C בסביבת 5% CO2/95% אוויר.
  6. לשאוב את תגובת שיקוע מבארות עם העצמות.
    1. הוסף כל דגימה של שליטה, NMS-דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו- 30-40 µg/mL Ag-MWCNT 1 מ של DMEM.
    2. דגירה ב 37 ° C בסביבת 5% CO2/95% אוויר במשך 8 שעות.
  7. להסיר דגימות supernatant תשטוף עם 5 מ של PBS.
  8. להוסיף 1 מ"ל של חיים/מתים מוכן קיט (20 µL של 2 מ מ EthD-1 עם µL 5 של 4 מ מ calcein AM ב דימתיל סולפוקסיד ב 10 מ"ל של PBS) dropwise התא.
  9. דגירה room temperature למשך 30-45 דקות או 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות פלורסצנטיות מדידה עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה 100 X או 300 X.

6. Trypan Blue Assay

  1. להכין דוגמאות על פי שלבים 5.1 דרך 5.6.2 לעיל.
  2. הסר את תגובת שיקוע.
  3. לשטוף צלחת עם 1 מ"ל של 1 x DPBS, decant.
  4. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין צלחת, תקופת דגירה של 3 דקות לנתק את התאים מתרבות. השתמש תא תרבות בינוני כדי לשטוף את הצלחת לאסוף תאים. המקום התאים שנאספו בשפופרת 15-mL.
  5. צנטריפוגה צינור 200 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
  6. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל בינוני טריים תא צניפה ומעוררים מחדש את התאים.
  7. להוסיף 10 µL של trypan blue עם 10 µL של התאים התפזרו ולספור את התאים עם מכונת ספירת תאים אוטומטית.
    הערה: הוראות עבור מכונת ספירת תאים בשימוש נכללות את ההפניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) לאשר את היווצרות Ag-MWCNTs (איור 1A ו 1B). הסינתזה המוצלחת שלהם אושר ע י שינוי משטח הטעינה. גודל החלקיקים Ag שהופקדו על MWCNTs חושבה (איור 1C). גודל החלקיקים הממוצע היה כ 3.83 ננומטר. הדפוס XRD-מסונתז Ag-MWCNTs מוצג באיור 1D. הפסגה ב 20-30 מעלות מקביל MWCNT; הפסגות הנותרים תואמות Ag. נתוני פעילות מיקרוביאלית מוצגים באיור

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מדווחים על שיטה פשוטה להכנת MWCNTs עם חלקיקים Ag הופקדו. Nanomaterial המכילות כסף זה מדגים משמעותי פעילות נגד חיידקים ופוטנציאל מינימלי לקליטה בלתי מבוקרת של סילבר חלקיקים בגוף. נדגים זאת 30 µg/mL של מסונתז Ag-MWCNTs היא רמה יעיל של אנטיבקטריאלי נגד Methylobacterium spp. עם cytotoxicity זניח כדי בתרבית של תאי הכבד. למרות שיפורים נוספים והערכות אבטחה לגבי Ag-MWCNTs נחוצים לפני הרחבה בתחום המסחרי, באמצעות אתנול כסוכן צמצום יכול לעזור לייצר Ag-MWCNTs ידידותי לסביבה וזול.

הם הפגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר של אוניברסיטת צ'אנג-אנג (2016) על ידי התוכנית פיתוח טכנולוגיית ננו-חומר דרך נבחרת מחקר קרן של Korea(NRF) ממומן על ידי משרד המדע ICT (מספר 2017M3A7B8061942).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1 N כסף חנקתיSIGMA-ALDRICH1090811000
ננו-צינור פחמן, רב קירותטוקיו כימית תעשייה ושות', בע"מ308068-56-6
R2A אגרMBcellMB-R1129
R2A מרקMBcellMB-R2230
Methylobacterium spp.KCTC12618מאוסף קוריאה לתרביות סוג Daejeon Korea 12618, Daejon, קוריאה
ערכת הדמיה של תאים חיים / מתיםThermoFisher SCIENTIFICR37601
AML12מאוניברסיטת צ'ונגנאם, דאג'און, קוריאה
אנושי PBMCATCCPCS-800-011
TEMJEOLJEM-2100F
XRDRigakuD / MAX 2500מקור פוטון Cu K (40kV, 100mA)
JuLI BrNanoEnTekJULI-BRSC 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
  3. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  4. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
  5. Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
  6. Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
  7. Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
  8. Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
  9. Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346(2005).
  10. Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
  11. Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
  12. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
  13. NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

compositetrypan blue

מאמרים קשורים