פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כרומוזומים חייב להיות אמין, בצורה אחידה הפרדה לתאי הבת במהלך חלוקת התא mitotic. נאמנות של סגרגציה כרומוזומלית נשלטת על ידי מנגנונים מרובים הכוללים את מחסום הרכבה פלך (שק). הקרום הוא חלק מערכת משוב מורכבים כי הוא אחראי למניעת התקדמות התא באמצעות מיטוזה אלא אם כל kinetochores כרומוזומלית יש מחובר ציר microtubules. לקרטע כרומוזומלית, כרומוזום נורמלית סגרגציה הוא מחוון של מחזור התא לקוי שליטה מחסומים והוא יכול לשמש כדי למדוד את יציבות גנומית של חלוקת תאים. הסרת הפיקוח של הקרום יכול לגרום הטרנספורמציה של תאים נורמליים לתא ממאיר דרך ההצטברות של שגיאות במהלך ההפרדה כרומוזומלית. יישום של השק ואת היווצרות קינטוכור מורכבים מוסדרים בחוזקה על ידי אינטראקציות בין kinases פוספטאז כגון 2A חלבון פוספטאז (PP2A). פרוטוקול זה מתאר תא חי הדמיה של משתרך כרומוזומים בתוך העכבר מתחלקים fibroblasts מבודד מן העכברים היה נוקאאוט של יחידת משנה התקינה PP2A-B56γ. שיטה זו גוברת על החסרונות של מחזור התא שליטה הדימות האחרות כגון cytometry זרימה או immunocytochemistry רק לספק תמונת מצב ציטוקינזה תא, במקום פריט חזותי ייתכן דינמי של כרומוזומים במהלך מיטוזה.
מבוא
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטה נוחה להמחיש סגרגציה כרומוזומלית והתקדמות mitotic במהלך מחזור התא בהעכבר מתחלקים fibroblasts באמצעות היסטון 2B-GFP, BacMam 2.0 תיוג והדמיה תא חי.
מחזור התא שליטה מחסומים לפקח על כרומוזום סגרגציה, יש תפקיד חשוב בשמירה על שלמות גנטי של התא 1,2,3. הצטברות של כרומוזומים אי הפרדה יכול להוביל aneuploidy, אשר מהווה סימן היכר של גידולים מוצקים ביותר 4. לפיכך, זיהוי מפגרות כרומוזומים יכול לשמש כשיטה ללמוד יציבות כרומוזומלית.
Fluorescently שכותרתו חלבונים יכולים להיות בשימוש לד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים שנערכו במחקרים אלה בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש במתקן המחקר והתרופות האמריקני (FDA) ואוכל.
1. בידוד והתרבות של העכבר מתחלקים Fibroblasts (MEFs)
- לבודד את העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) זן PP2A-B56γ-עכבר, הארנבונים מאותה פראי סוג ב פרוטוקול סטנדרטי 7,8,9.
- ExpandMEFs עבור 3 קטעים, להקפיא ולאחסן עד לצורך ניסויים 8.
2. culturing Mefs 2-ובכן תאיים כיסוי זכוכית עבור Live הדמיה
- הכנת 500 מ"ל של המדיה צמיחה MEF המכיל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
MEFs פראי סוג ו PP2A-B56γ-עכברים נזרע בכוס כיסוי תא 2-ובכן, מותר לצרף. יום 2, MEFs סונכרנו באמצעות 0.1% FBS במשך 24 שעות ביממה. יום 3, MEFs בתקשורת עם 200 ng/mL nocodazole ו 30 regentwere PPC CL-HB מודגרות עבור 18 h ב- 37° C ו- 5% CO2. יום 4, התאים היו עם תמונה באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב (איור 1). חיים תא הדמיה שימש כדי להמחיש את גורלו של תאים בודדים כפי שהם התקדם מ NEBD באמצעות מיטוזה (איור 2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחזור התא שליטה מחסומים להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק למנוע אנאפלואידיה ותא טרנספורמציה 1,2,3. במחקר הנוכחי, מצאנו את איון של PP2A-B56γ, גרמו מחסום הרכבה פלך נחלש. הדמיה חיה תא אפשר לנו להתבונן כרומוזומלית סגרגציה שגויה במהלך מיטוזה ב PP2A-B56γ MEFs שטופלו nocodazole 9.
פרוטוקול זה מנצל תווית Histone2B-GFP שנוצר באמצעות טכנולוגיה BacMam 2.0 הכרומוזומים תווית עבור הדמיה תא חי........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות Hung גואו-Chiuan ד ר ד ר Bharatkumar ג'ושי להערות יקר זה לשפר את כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-גלוטמין | גיבקו | 25030081 | |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X) | ג'יבקו | 11140050 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | ג'יבקו | 15140122 | |
| דולבקו' s פוספט חוצץ | מלח Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| סרום בקר עוברי | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| קופסאות אחסון בקבוקון קריוגני | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| בקבוקונים קריוגניים | Corning/costar | 431416 | |
| צלוחיות T75 | Cellstar | 658175 | |
| 2 זכוכית כיסוי תא היטב | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב | קרל זייס מיקרוסקופיה | Zeiss Cell Observer SD | |
| אמבט מים | Thermoscientific | 280 סדרה | |
| חממה | Sanyo פתרונות מסחריים | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II ארון בטיחות ביולוגי | חברת Baker | SterilGard | |
| תוכנת Axiovision | Zeiss | גרסה 4.8.2 | |
| תוכנת ImageJ | המכון הלאומי לבריאות | גרסה 1.51r |
מקורות
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and s....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
