הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57410

⸱

20 במרץ 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

תקציר

התגובה נזק דנ א (DDR) משתמש שפע של חלבונים כדי לזהות אות, תיקון ה-DNA נגעים. בהתוויית תגובה זו הוא קריטי להבין מנגנונים תחזוקה הגנום. מאז הגיוס ו- exchange של חלבונים-נגעים דינמי מאוד, המחקר שלהם דורש את היכולת להפיק DNA נזק באופן מהיר ולא מופרד במרחב. כאן, אנו מתארים הליכים באופן מקומי לגרום נזק לדנ א בתאים אנושיים באמצעות זמין נפוץ סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם קו 405 ננומטר לייזר. הצטברות של תחזוקה הגנום גורמים-פסים לייזר יכול להיות מוערך על-ידי immunofluorescence (אם) או בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויג עם כתבים פלורסנט. שימוש phosphorylated היסטון H2A. X (γ-H2A.X) שכפול חלבון A (RPA) כסמני, השיטה מספקת רזולוציה מספיק להפלות גורמים גייס באופן מקומי מאלה שהתפשט על כרומטין סמוכים. אנו מספקים עוד קבצי script מבוססי ImageJ לפקח ביעילות את קינטיקה של חלבון relocalization ב DNA נזק לאתרים. אלה ליטושים מפשטות מאוד חקר הדינמיקות DDR.

מבוא

התאים חשופים ללא הרף אנדוגני אקסוגני ומקורות של נזק לדנ א המאיימים על תקינותם גנומית. DDR הוא הרכב של איתות המסלולים לזהות, אות, ולאחר תיקון ה-DNA נגעים לקיים יציבות הגנום. ב- DNA גדילי כפול מעברי (DSBs), DDR מתרחשת בעיקר על שתי פלטפורמות משלימות: כרומטין γ-H2A.X-שכותרתו ', אזור resected חד גדילי הדנ א (ssDNA) בדרך כלל מצופה ssDNA מחייב מורכבים RPA1,2.

UV-לייזר מיקרו-הקרנה של תאים טרום רגיש עם תימידין אנלוגי 5-ברומו-2' deoxyuridine (BrdU) או לצבוע דנ א bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) יוצר תערובת של נגעים דנ א חד גדילי מעברי (כולל SSBs) ו- DSBs אשר להפיק DDR המותאמות לשפות אחרות של כרומטין והן ssDNA פלטפורמות3,4. העבודות הקודמות הראה כי גיוס של הגנום גורמים תחזוקה פלטפורמות אלו ברורים שני ב DSB ניתן שיפלו תוך שימוש באנרגיה גבוהה UV-A לייזרים (335-365 ננומטר) בשילוב עם אם2,5. מיקרוסקופים מצויד עם לייזרים כאלה יקרות כפי שהם דורשים לייזר באנרגיה גבוהה, ייעודי קרינת UV-A להעברת ויעדים שהופך אותם הרבה פחות נפוצות בהגדרות האקדמית ובתחום הרוקחות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר עם 405 ננומטר לייזר קווים. המחקר של גיוס חלבון ו- exchange באתרים מוקרן מיקרו היא גם מנעה ידי ניתוח התמונה ידני מייגע נדרש לתאר את התנהגות דינמית של הגנום גורמים תחזוקה.

כאן, אנו מראים רגישות עולה מראש של תאים עם הכתם חומצת גרעין BrdU או BBET עקב באמצעות מיקרו-הקרנה 405 ננומטר לייזר במיקרוסקופ קונפוקלי משותף מאפשר בקרה של הגנום תחזוקה גורם דינמיקה ב DNA נגעים. שימוש γ-H2A.X או RPA subunits מורכבים סמני פלטפורמה יחד עם z-לערום יותר עומק השדה ואת deconvolution עבור רזולוציה משופרת מאפשר הנסיין להפלות גורמים אשר מגויסים באופן מקומי כדי DSBs מאלה להתפשט תחומים כרומטין גדולים סביב הנגע הראשוני. זו המשנה סיווג על פי מדורים אינטרה-גרעיני ברורים עוזר לחדד את התפקידים פוטנציאלי של חלבונים uncharacterized גייס לאתרים מוקרן-מיקרו. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים נוח, אופטימיזציה צינורות לנתח במהירות את הדינמיקה של הגנום גורמים תחזוקה באמצעות7,86,פיג'י (חלוקה ImageJ) תוכנת קוד פתוח. אלה ליטושים לשיטות מיקרו-הקרנה הנוכחי לדקלם את המחקר של DDR אפשרי כמעט בכל סביבה מעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. קדם רגישות עולה של תאים

  1. 24 שעות לפני הניסוי מיקרו-הקרנה, זרע תאים U2OS 40,000 לכל טוב 1 x DMEM המכיל 10% FBS בתרבות 8-ובכן שקופיות עם ישבנים 170 מיקרומטר-עבה coverslip דמוי זכוכית/פולימר כדי להבטיח מקסימלי להדמיה של 405 ננומטר לייזר אור והדמיה מעולה עם סריקה בלייזר הפוך מיקרוסקופ קונפוקלי. אם משתמש של microslide 8-ובכן, להשתמש µL 500 של מדיה או פתרונות לכל טוב עבור כל הטיפולים הבאים והשלבים שטיפה של הפרוטוקול.
    הערה: עקב שלהם מורפולוגיה שטוח, תאים U2OS הדבקות טובה, וגרעינים גדולים, להקל הגילוי של חלבון גיוס באתרים מוקרן מיקרו אך סוגי תאים חסיד אחרים ניתן להשתמש לפי הצורך. תאים אידיאלי להיות בסביבות 80% confluency בזמנו של מיקרו-הקרנה כדי להגדיל את המספר מוקרן תאים לכל ניסוי. זרימה גבוהה מאוד עלול לגרום שינויים מחזור התא זה יכול perturb שמסלולי התיקון ספציפיים כגון רקומבינציה הומולוגית אשר מתרחש במהלך השלבים S ו G2 של מחזור התא9.
  2. דגירה התאים בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2ולאחר מכן מראש לרגש את התאים עם (שלב 1.3) BrdU או (שלב 1.4) BBET (Hoechst 33342).
    הערה: כדי לצפות בשידור חי גיוס של חלבון בעל עניין (פוי) ה-DNA נגעים, transfect או מגלי פלסמיד ה-DNA נושא שילוב בין חלבון פלואורסצנטי בגודל 24 פוי h לאחר תא זריעה. h 24 שעות ביממה פוסט-transfection/התמרה חושית, מראש לרגש, מיקרו-להאיר את התאים כדי לפקח על הגיוס של הנקו באתרי ה-DNA נזק בזמן אמת.
  3. כדי להגדיל את מספר DSBs שנוצר על ידי תערוכות 405 ננומטר לייזר, להוסיף 10 מיקרומטר של BrdU המדיה עבור 24 שעןת לפני מיקרו-הקרנה. לפני מיקרו-הקרנה, שימוש של micropipette, יש לשטוף את התאים פעמיים עם בינונית ללא פנול אדום כדי להבטיח חשיפה מירבית של התאים 405 ננומטר לייזר.
  4. לחלופין, יטפל בתאים למשך 15 דקות עם BBET-µg/mL 10 ב המדיום המתאים בחממה תרבית תאים ב 37 º C. לאחר הטיפול, לשטוף פעמיים עם בינונית ללא פנול אדום לפני מיקרו-הקרנה.

2. מיקרו-הקרנה של תאים

  1. בחר מתאים לסריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: הניסויים שהוצגו כאן בוצעו על מערכת מיקרוסקופ מצוידים 50 mW 405 ננומטר לייזר קו מטרה שמן 63 X 1.4 מפתח נומרי. כדי ליצור DSBs, התאים היה מוקרן מיקרו-1 X זום סריקה 1,024 x 1,024 פיקסלים/שדה (0.21 מיקרומטר לפיקסל בהגדלה X 63), במצב חד כיווני-8 µs לפיקסל. עוצמת הלייזר בשימוש היה 25% ו- 80% עבור תאים BBET - ו BrdU-טרום-רגיש, בהתאמה. כדי לסייע למשתמשים להגדיר את תצורת המערכת, לייזר כוח שלאחר המטרה על מערכת הציג נמדדה באמצעות מד צריכת החשמל על-פי הוראות היצרן. המדידות תואמות 2.6 mW ו- 7.0 mW עבור BBET - ו BrdU-טרום-רגיש תאים, בהתאמה.
  2. הפעל את המיקרוסקופ ואת תא סביבתיים.
    1. להגדיר את התא עד 37 ° C עם 5% CO2 לפני דגימות ממוקמים בתוך החממה על הבמה כדי למנוע לחץ מיותר על התאים וכדי להבטיח קינטיקה DDR הומוגנית לאורך ניסויים.
  3. בחר שדות עם תאים מבוזר היטב, להתאים את המוקד, לרשום את עמדתם כדי להקל על ייבוא תמונות לאחר בפרוטוקול אם. רוכשים תמונה אחת לפחות שישמש כנקודת התייחסות לנזק מראש כדי לנטר את קינטיקה של חלבון הגיוס לאחר מיקרו-הקרנה.
    הערה: תרבות Gridded כלי עשוי לשמש גם כדי להקל על הלוקליזציה של תאים מיקרו-מוקרן על והשלבים.
    1. אם הניסויים באמצעות תאים התווית על-ידי BBET, להתאים את המוקד על תאים באמצעות הלייזר 405 ננומטר-עוצמת הלייזר הנמוך מספיק כדי להמחיש את התאים על מנת למנוע נזק לדנ א מוצדקות.
      1. הימנע מלהשתמש widefield זריחה כדי להתאים את המוקד על תאים שהוכתמו BBET כמו אור UV הנפלטת המנורה. יגרום נזק לדנ א באתרים מואר.
    2. אם באמצעות תאים התווית על-ידי BrdU, להתאים את המוקד באמצעות התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) או שלב-ניגודיות הדמיה מלהסתכל גרעיני תת תכונות כגון nucleoli.
    3. אם באמצעות תאים המבטאים שכותרתו fluorescently POIs, בחר מטוס מוקד בעוצמה פלורסצנטיות נציג.
      הערה: להימנע תאים המבטאים רמות גבוהות מאוד של הנקו ביטוי חזק עלול לגרום בלוקליזציה מלאכותית. בנוסף, בחר בתאים המבטאים הנקו ברמות דומות (בחירה של שיבוטים יציב מומלץ מאוד כדי למזער בווריאציות ביטוי פוי ורמות גיוס).
  4. קביעת התצורה של המיקרוסקופ על הצעד מיקרו-הקרנה באמצעות קרינה פלואורסצנטית-ההתאוששות לאחר _module photobleaching (FRAP) של המערכת.
    הערה: את הפרמטרים החשובים ביותר שיש לקחת בחשבון בעת הגדרת-up למערכת מיקרוסקופ עבור מיקרו-הקרנה ניסויים הם: הכוח פלט של 405 ננומטר לייזר, מספר האיטראציות (קרי, מספר הפעמים הלייזר יעבור באותן הקואורדינטות). מספר פיקסלים/שדה (ב- 63 X הגדלה והרזולוציה 1,024 x 1,024, 1 פיקסל = 0.21 מיקרומטר), וזמן להתעכב לפיקסל. כל הגורמים הללו תשפיע על כמות האנרגיה להיתקל התאים, ובכך כמות וסוג DNA נזק שנוצר (ראה דיון למידע נוסף במינון אופטימיזציה).
  5. באמצעות מודול FRAP של מערכת מיקרוסקופ, מיקרו-להאיר את התאים.
    הערה: ברוב המערכות, מיקרו-הקרנה של תאים מרובים יכול להתבצע בשדה יחיד נקודות או קווים/מלבנים (בדרך כלל 1-2 מיקרומטר רחב). בעת ביצוע הדמיה חיה של חלבונים עם התווית fluorescently מיד לאחר נזק, להגביל את המיקרו-ההקרנה למספר קטן של תאים לכל שדה כי לוקחים את הזמן כדי מיקרו-להאיר בכל תא תגרום אינדוקציה מושהית של DDR. הדבר חשוב במיוחד בעת פיקוח על חלבונים אשר מגויסים במהירות רבה כדי DNA נגעים.
  6. לאחר מיקרו-הקרנה, להחזיר את השקופיות רב טוב או צלחות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך פרק הזמן הנדרש לפני עיבוד הדגימות עבור אם (סעיף 5) או פנה/י מיד עם הדמיה לחיות (סעיף 3).
    1. כצעד ראשון, לתקן את התאים בתוך דקות ספורות ועד כמה שעות הקרנה שלאחר עבור פרוטוקול IF. בהתאם הנקו, קינטיקה הגיוס עשוי להשתנות. בדרך כלל, חלבונים הנמצאים כרומטין-הקשורים DSBs, SSBs בתרגום במהירות רבה כדי הנגע, מוסרות לעיתים בתוך 5 דקות. כמה גורמים כגון אלה באותו ssDNA גויס בנקודות זמן מאוחר יותר, ברגע המכונות כריתה עוסקת ולהישאר שם במשך שעות (ראה איור 1 עם הפניה4).

3. חיים הדמיה של חלבונים עם התווית Fluorescently

  1. לבצע הדמיה בצילום מואץ של התאים מוקרן-מיקרו. עבור חלבונים אשר מגויסים במהירות רבה כדי נגעים, כמה שניות לכל מסגרת יהיה אידיאלי, אך עבור חלבונים בתרגום האזור הפגוע מאוחר יותר (למשל, כריתה גורמים), רכישת ייתכן לבצע כל 1-2 דקות עד מישור מושגת.
    הערה: למזער את עוצמת הלייזר עבור רכישת התמונה כדי למנוע הלבנת ככל האפשר, כדי להבטיח כי חלבון גיוס באתרים נזק לא מגיעים לרוויה אשר למנוע אות כימות וניתוחים עוקבות (ראה ניתוח נתונים סעיף 4). במערכת שהוצגו, ההדמיה נעשתה עם 63 X / 1.4 שמן אובייקטיבית באמצעות זמן להתעכב של 8 µs לפיקסל, רזולוציה 1,024 x 1,024, 1 X זום, חישוב ממוצע של 2. שימו לב כי הפרמטרים האלה אולי צריך להיות אופטימיזציה עבור מערכות אחרות ו/או ניסויים שונים.
  2. מיקרו-להאיר התאים בתחומים נוספים עד קינטיקה מדידות מתקבלים עבור תאים 15-30. חזור על הניסויים לפחות 3 פעמים ב משכפל ביולוגי כדי להבטיח את הדיוק ואת הפארמצבטית של קינטיקה גיוס.
    הערה: בעת התאמת פרוטוקול זה למערכת קונאפוקלית ספציפי, זה עשוי להיות שימושי להתחיל על-ידי ניטור של קינטיקה גיוס של גורם תחזוקה הגנום הידועים fluorescently התווית על-ידי (לדוגמה, 53BP1-ה-GFP, RPA32-GFP, וכו '). באמצעות הדמיה לחיות כדי למטב את תנאים מיקרו-הקרנה יאפשר למשתמש לבחון פרמטרים מרובים במהירות.

4. גיוס קינטיקה ניתוח

  1. התקן את התוסף Microirradiation ניתוח10 התוכנה11ניתוח התמונה פיג'י.
  2. פתח תמונות שנרכשו בפיג'י. בחר "מנתח הנזק" מתוך התפריט הנפתח תוספים בסוויטת ניתוח Microirradiation. בצע את ההוראות להגדרת אזור רקע של עניין (ROI) (בדרך כלל 3 x 3 מיקרומטר), שאינו מוקרן ו לקרינה ROIs בכל תא מוקרן-מיקרו.
    1. שימוש ROIs בגודל זהה כדי למזער הטיות אפשריות ב אומר עוצמות האות. לתמונות הנרכש, כוללים גם מסגרת הקרנה קדם אחד לפחות אשר ישמש כקו כדי לפקח על גיוס באתרים מוקרן-מיקרו.
    2. לאחר שכל הנתונים רועי שנאסף על הסדרה מלא זמן לשגות, לשמור את הקובץ שנוצר על ידי תוסף המכיל את התוצאות ה-csv (מופרד באמצעות קובץ) או כקובץ txt (קובץ מופרד באמצעות טאבים). קובץ זה מכיל מדידות של עוצמת כלומר עבור כל נקודת זמן על כל ההשקעה (כלומר רקע בעוצמה, מתכוון בעוצמה בלתי-בלייזר, וכן אומר בעוצמה מוקרן).
      הערה: התוסף מפחית אוטומטית את עוצמת רקע (אניb) בעצימות של ROIs לקרינה (אניs), את שאינו מוקרן ROIs (אניn). הוא גם מחשב יחס בין שני הערכים (ראה להלן הנוסחה) לתיקון photobleaching (Irradiated/Non-מוקרן).
      figure-protocol-1
      התוסף גם מחשב נורמליזציה בין נקודת בפעם הראשונה (ערך מוגדר כ- 1), וכל שאר הדברים זמן עבור כל גרעין (יחס יחסית לנקודת הזמן הראשון). פרטים נוספים ניתן למצוא באתר האינטרנט תוסף10.
  3. לבצע את הניתוח באמצעות התוסף עבור כל מיקרו-מוקרן התאים (תאים לפחות 15-30), גרף את העשרת יחסי מרושע בבית מוקרן מיקרו אזורים לאורך זמן. לחשב השגיאות תקן של הממוצע עבור כל נתוני הצבע מגרש אותם.
    1. לאשר את ההבדלים גיוס קינטיקה בין שני תנאים ניסיוני על ידי ביצוע של התלמיד t-בדיקות עבור כל נקודת נתונים.

5. אם פרוטוקול

  1. להכין אם פתרונות. להכין פתרון טרום/פוסט-extraction (PBS קר כקרח x 1 המכיל 0.25% טריטון X-100), שטיפת פתרון (1 x PBS המכילה 0.05% Tween-20), חסימת פתרון (1 x PBS המכיל 3% BSA ל- 0.05% Tween-20), קיבוע הפתרון (Paraformaldehyde 3% + סוכרוז 2% ב- PBS 1 x) חרוט צינורות פוליפרופילן.
    הערה: עבור microslide יחיד 8-ובכן, 10 מ של טרום/פוסט-extraction פתרון, 50 מ של כביסה פתרון, 10 מ של פתרון חסימה ו 5 מ של קיבעון פתרון הינם נדרשים.
    1. להכין את הפתרון קיבעון.
      1. ברדס כימי, מערבבים 400 מ ל מים מזוקקים-כפול (ddH2O) עם 15 גרם של paraformaldehyde ו- µL 30 של 10 N NaOH בבקבוקון Erlenmeyer 1 ליטר.
      2. סגור את מיכל וחום -65 מעלות צלזיוס על פלטה חמה פגים תוך כדי ערבוב כדי solubilize את paraformaldehyde לחלוטין.
      3. בעזרת פיפטה של 25-mL, להוסיף 50 מ של 10 X PBS, מערבבים, מסנן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר.
      4. להוסיף 10 גרם של סוכרוז ולהשלים עד 500 מ"ל עם ddH2O.
      5. Aliquot הפתרון צינורות חרוט 15 מ"ל; לאחסן ב-20 ° C עד השימוש.
    2. להכין גרעינים מכתים פתרון על ידי דילול פתרון מניות של 1 מ"ג/מ"ל של 4, 6-Diamidino-2-phenylindole 1:1,000 (דאפי) ב 1 x PBS.
  2. שימוש של micropipette, הסר בזהירות את המדיה מן הבארות של שקופיות מיקרוסקופ רב טוב או צלחות ולשטוף מיד עם 500 µL של אם הכביסה פתרון על-ידי שינוי הפתרון פעמיים ללא המתנה.
    הערה: אם הנתונים המובאים כאן התקבלו באמצעות תאים גדל שקופיות מיקרוסקופ 8-ובכן היו נשטפים, מודגרות ב 500 µL של כל הפתרונות. צריך להיות מותאם אמצעי אחסון בהתאם המכולות תרבות תא בשימוש על ידי ניסויים. בנוסף, ביצוע בפרוטוקול אם בזהירות מרבית כמו תאים ניתן לנתק בקלות מהחלק התחתון זכוכית/פולימר. השתמש micropipette של כל פתרון שינויים כדי למזער את איבוד תאים.
  3. דגירה על קרח במשך חמש דקות עם 500 µL של קרח אם פתרון טרום/פוסט-extraction ו מערבולת בעדינות ביד עבור 15-30 s לבצע את החילוץ קדם צעד זה מסיר ביותר חלבונים cytoplasmic ו nucleoplasmic ומגדיל את האיתות כרומטין / גורמים הקשורים הדנ א.
  4. לשטוף פעמיים עם 500 µL של אם הכביסה פתרון.
  5. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר 500 µL של אם הקיבעון פתרון. לחלופין, השתמש פתרון paraformaldehyde מוכנות מראש (3-4%) לשלב קיבוע.
  6. לשטוף פעמיים עם 500 µL של אם הכביסה פתרון.
  7. דגירה על קרח למשך 5 דקות ב- 500 µL של קרח אם קדם/פוסט-extraction פתרון ו מערבולת השקופית בעדינות ביד כדי לבצע את השלב permeabilization.
  8. לשטוף פעמיים עם 500 µL של אם הכביסה פתרון.
  9. דגירה לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר עם 500 µL של פתרון אם החסימה.
  10. הסרת חסימה פתרון באמצעות micropipette של, דגירה ללון בתוך תא humidified ב 4 ° C עם 250 µL הראשית נוגדנים מעורבבת עם חסימת פתרון.
    הערה: זה תרגול טוב כדי לבצע הדגירה עם ראשי נוגדנים באופן רציף כדי למנוע בחפצים שונים לוקליזציה שותף פוטנציאלי. הפקדים המתאימים פעם בוצעו, בו זמנית דגירה נוגדנים הראשי כדי להאיץ את התהליך.
  11. רחץ ארבע פעמים במשך 5 דקות ב- 500 µL של אם הפתרון כביסה עם עצבנות עדין (60 rpms ב rotator).
  12. תקופת דגירה של h 1 ב 37 ° C עם 250 µL של נוגדנים משניים מדולל בפתרון חסימה בתוך תא humidified.
    הערה: להגן על הדגימות אור על תוספת של נוגדנים משניים עם התווית fluorescently.
  13. יש לשטוף ארבע פעמים כל אחד עבור 5 דקות ב- 500 µL של אם הפתרון כביסה עם עצבנות עדין.
  14. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב- 500 µL ל- PBS x 1 המכיל 1 µg/mL דאפי כתם גרעינים.
  15. לשטוף פעמיים עם µL 500 ל- PBS 1 x ולהשאיר בתאים µL 500 1 x PBS פתרון דימות.
  16. באמצעות שקופיות gridded או שלב רשום עמדות, לחפש את התאים מוקרן מיקרו באמצעות סמן נזק DNA מאופיין היטב (למשל, γ-H2A.X, RPA32, וכדומה).
  17. תמונה של תרבות רב טוב שקופיות או הצלחות כל הערוצים הרלוונטיים באמצעות ההגדרות המתאימות על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
    הערה: על מערכת הציג, ההדמיה נעשתה עם 63 X / 1.4 שמן אובייקטיבית באמצעות זמן להתעכב של 8 µs לפיקסל, רזולוציה 1,024 x 1,024, 1 X זום, חישוב ממוצע של 2. שימו לב כי הפרמטרים האלה אולי צריך להיות אופטימיזציה עבור מערכות אחרות ו/או ניסויים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות מיקרו-הקרנה, תאים מותר להתאושש במשך תקופה מסוימת של זמן בהתאם לאופי הגנום תחזוקה חלבונים1,12. DSBs תטופל על ידי nucleases, באופן מקיף ביותר במהלך שלבי S ו G2 של מחזור התא, כדי ליצור אזור מוגבל ssDNA שהטיחה במהירות על-ידי RPA אחרים גורמים תחזוקה הגנום9. אזור ssDNA זה מוקף כרומטין אשר בהרחבה משתנה במהלך DDR לווסת את גיוס ו- exchange של גורמים אחרים DDR13. ניתן לנטר חלבון גיוס לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

באמצעות השיטות שפורטו לעיל, 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה של תאים טרום רגיש עם BBET או BrdU מאפשר הדור המותאמות לשפות אחרות של נגעים DNA לרבות DSBs בתחום הגרעינים של תאים אנושיים חסיד. קינטיקה של DDR-DSBs אלה דומים לאלה שנוצר עם שיטות אחרות התאים האיקריוטים9,18,19. כריתה DSB באתרים מוקרן מיקרו מוביל ssDNA הדור אשר יכול לבוא באמצעות נוגדן של פילוח RPA32 או היתוך של RPA32-GFP. גורמים הקשורים כרומטין, מצד שני, יכול להיות ממוקם באמצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה [גילוי מענק 5026 התעוררנו] ועל ידי של הדור הבא של מדענים מלגה מן האגודה לחקר סרטן [21531 כדי לפנות בוקר. השכל]. אנו מודים ז'אן פרנסואה Lucier על מתן בקרת איכות מעולה של סקריפטים פיתון פיג'י, עצות על ניתוח סטטיסטי. אנו מודים ד ר סטפני א Yazinski על המתכון פתרון אם קיבוע. אנו מודים פול-לודוויק Karsenti על העזרה עם מדידות חשמל לייזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אולימפוס FLUOVIEW FV3000 מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר תהודהOlympus
FluoView FV3000 (גרסה 2.1)אולימפוס
405 ננומטר לייזרמקור קרינהקוהרנטי
חממת מיקרוסקופ AIO-UNO-OLYUS-1OkolabOKO-UNO-1
60X /1.4 שמןאולימפוס מטרת טבילה
שקופיות תרבית 8 בארות על כיסוי זכוכית (X-well)Sarstedt94.6190.802
U2OS אוסטאוסרקומה קו תאים אנושייםATCCHTB-96קווי תאים יציבים 
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)ThermoFisherD1306זהירות רעיל
5-ברומו-2&פריים;-דאוקסיורידין ( BrdU) סיגמא-אולדריץ'59-14-3
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'30525-89-4זהירות
ביסבנזמיד רעיל H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
אלבומין בסרום בקר (BSA)ThermoFisherBP1600-100
טריפסין EDTA 0.1% תרמו-פישר15400-054
טריטון X-100 BioShopTRX777.100
Tween-20 ThermoFisherBP337-500
סוכרוז BioShopSUC507
JetPRIME מגיב טרנספקציה תושבת Polyplus114-07
ProLong Diamond Antifade עם DAPI ThermoFisherP36962
DMEM 1X, + פנול אדוםWisent 319-005-CL
DMEM 1X, - פנול אדוםWisent319-051-CL
סרום בקר עוברי (FBS)Wisent 080-150
נוגדן עכבר נגד RPA32Abcamab21751:500 עבור IF
ארנב אנטי-&גמא;-H2A. איתות תאי נוגדן X 9718S1:500 עבור IF
ארנב אנטי-53BP1 נוגדןאיתות תאים 4937S1:500 עבור IF
ארנב אנטי-PRP19 נוגדןAbcamab276921:500 עבור IF
עז אנטי-ארנב IgG Alexa Fluor 647איתות תאים 4414S1:250 עבור IF
עז נגד עכבר  IgG Alexa Fluor 488 איתות סלולרי 4408S1:250 עבור תוכנת
קוד פתוח לניתוח תמונות פיג'י https://fiji.sc
מד כוח 1918-K  עם חיישן 918D-SL-0D3ניופורט
תוכנת אובייקטיבי

מקורות

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237(2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תגובה לנזקי DNAמיקרוסקופיה קונפוקליתהיסטון H2AXחלבון שכפול Aניתוח ב-ImageJמודול FRAPפרוטוקול אימונופלואורסצנציה
חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.