הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 ואלקטרון Saos-2 תאים באמצעות שידור עם אנרגיה ואנליזת רנטגן Microanalysis

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57423

⸱

24 ביוני 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשוות את המצב של מינרלים שלפוחית שפורסמו על ידי שתי שורות תאים עצמות אנושיות: hFOB 1.19 ו- Saos-2. הפרופילים שלהם מינרליזציה נותחו על ידי Alizarin אדום-S (AR-S) מכתים, ויזואליזציה אור אולטרה סגול (UV), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה, אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX).

תקציר

וידאו זה מציג את השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים עם אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (TEM-EDX) כדי להשוות בין המדינה של מינרלים שלפוחית שפורסמו על ידי שתי שורות תאים עצמות אנושיות: hFOB 1.19 ו- Saos-2. שורות תאים אלה, לאחר הטיפול עם חומצה אסקורבית (AA) וβ-glycerophosphate (β-GP), עוברים transdifferentiation osteogenic מלאה של התפשטות כדי מינרליזציה ולייצר מטריקס שלפוחית (MVs) המפעילות אפטיט התגרענות ב מטריצה חוץ-תאית (ECM).

בהתבסס על Alizarin האדום-S (AR-S) צביעת וניתוח של ההרכב של מינרלים lysates תא באמצעות אור אולטרה סגול (UV) או שלפוחית באמצעות הדמיה TEM ואחריו EDX כימות ומיפוי יון, אנחנו יכולים להסיק אוסטאוסרקומה הזה Saos-2 ו- osteoblastic תאים hFOB 1.19 חושפים פרופילים נפרדים מינרליזציה. Saos-2 תאים mineralize ביעילות רבה יותר מאשר תאים hFOB 1.19 ומפיקים מחצבים גדולים אינם גלויים תחת אור UV, אך דומים היידרוקסיאפטיט (HA) כי יש להם תחליפים יותר Ca ו- F.

התוצאות המתקבלות באמצעות טכניקות אלה מאפשרות לנו להסיק כי התהליך של מינרליזציה משתנה בהתאם לסוג התא. אנו מציעים כי ברמה התאית, מקורו ואת המאפיינים של שלפוחית predetermine הסוג של מינרלים.

מבוא

עצם היא סוג של רקמת חיבור מורכב משני חלקים: אורגני (תאים ו סיבי קולגן) מינרלים (תרכובות סידן, פוספט). הרכיבים העיקריים המינרלים בעצמות הם apatites1. סוגים שונים של תאים המוסמכת-מינרליזציה עצם (תאי העצם), שיניים (odontoblasts), סחוס (chondrocytes) לווסת את השלבים הראשונים של מינרליזציה על ידי ייצור החלבונים של מטריצות (ECM) ושחרור מטריקס שלפוחית (MVs) (איור 1). MVs הם 100-300 ננומטר קוטר שלפוחית לצבור סידן, פוספט הקלת התגרענות אפטיט, לאחר מכן לאגד קולגן2,3. לאחר מכן, MVs מתפוררות לשחרר apatites למדיום חוץ-תאית. Apatites ממשיכים לגדול עם סיבי קולגן טופס המטריקס העצם. מינרליזציה הוא נגרם על ידי אספקה מתמדת של Pאני ו- Ca2 + במדיום חוץ-תאית. נתונים שפורסמו לאחרונה מסוימים תומכים שלנו4,דגם5. רקמות רכות mineralize לא בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, הסתיידות חוץ רחמי עלולה להתרחש בתנאים פתולוגיים כגון הסתיידות כלי הדם3. תאי הדם לרכוש את פנוטיפ אוסטאובלסט יכול לייצר MVs זירוז התגרענות של apatites, ליזום מינרליזציה המדיאלי, intimal בשכבות של הקיר של כלי הדם. מאז הסתיידות חוץ רחמי דומים endochondral נורמלי מינרליזציה3, הבנת המנגנונים המולקולריים של מינרליזציה של תאים osseous, chondrocytes צריך לספק רמזים על הסתיידות חוץ רחמי של רקמות רכות, כי הם נוצרו.

ההתפתחות ברקמות השלד מוסדר על ידי אנזימים שונים, גורמי גדילה, ואת היזמים או מעכבי של מינרליזציה. בפעולה עוינת של הרקמה-ספציפי אלקליין פוספטאז (TNAP) (איור 1), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase אני (NPP1), יחד עם ankyrin (תודה), שולטת ריכוז רב-תכליתי אי-אורגנית (PPאני) 6. PPאני, מעכב חזק של היווצרות HA, זה הידרוליזה על ידי TNAP; NPP1 הידרוליזה נוקלאוטיד triphosphates כדי ליצור עמודיםאני בזמן תודה מייצאת PPאני מהתא ECM. היחס Pi/PPi יכול לווסת אפטיט היווצרות7,8 עם תוצאה פתולוגית אפשרית9.

קרום MV מועשר בחלבונים תחבורה יון המאפשרים את המשקעים הראשונית של סידן, פוספט בתוך MVs במהלך תהליך התגרענות (איור 1). המשגר פוספט 1 (בור) מסייעת לשלב Pאני שנוצר בחלל perivesicular לתוך MVs10,11. עשויים להיות מעורבים Annexins האיגוד לבין התחבורה של Ca2 + , תהליך biophysical יוזם מינרליזציה MV לומן12,13. . אנחנו מעדיפות את ההשערה, הציעה קודם לכן, עבור מינרליזציה בתוך שלפוחית לתוך הביצית של התגרענות פנימי של אפטיט פנימה MV לפני הפצת שלה ב- ECM ה-14,15. מידול במבחנה אישר את אינדוקציה של Ca2 +/ Pאני מתחמי-צורה proteoliposomes זני PS ו- AnxA516. ייתכן שהדבר מצביע על הצטברות הזה של Ca2 +, Pאני, AnxA5 ו- PS מתחמי ליפיד רפסודות של microvilli כמו membranesrepresent הליבה התגרענות (NC) של אפטיט בתוך מ'לעומת Annexins, TNAP גם מחזיקים מחייב קולגן קיבולות שעשוי להיות שימושי הצבת MVs לאורך סיבי קולגן ו, ב מגרה על התפשטות של מינרליזציה ב- ECM. Fetuin A ו- osteopontin (OPN)17, מכונים מעכבי היווצרות אפטיט עשוי להאט את התפשטות של מינרליזציה על הגרדום סילוק. התגרענות והתפשטות אירועים נפרדים, לשעבר שלפני האחרון, גם עשוי להיות רלוונטי עבור תהליך פתולוגי מינרליזציה.

לגלות איך הכימיה של סידן פוספט מתחמי עשויים להשתנות מינרליזציה פיזיולוגיים, הסתיידות חוץ רחמי, יש צורך לזהות את המינרלים המיוצר על ידי תאי. Apatites הם קבוצה של סידן, פוספט המכיל מינרלים עם קריסטל כללי יחידת התא נוסחה Ca10(PO4)6X2, שבו X = קלרנית, F, OH. הם מסווגים כדלקמן18: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2,10(PO4) קה chlorapatite (CA)6Cl2 ו- Ca היידרוקסיאפטיט (HA)10(PO4 )6(OH)2.

הבחירה של שורות תאים אוסטאובלסט לזירוז היווצרות מינרל חיוני, מאז כל שורה תא תערוכות פרופיל ברורים של מינרליזציה. בדו ח זה, השווינו את התגרענות של מינרלים על-ידי שני דגמים שנבחרו התא האנושי של מינרליזציה: osteoblastic hFOB 1.19 תאים ותאים אוסטאוסרקומה Saos-2. אוסטאוסרקומה, נגזר תאים משמשים כמודלים osteoblastic ו Saos-2 תאים נשתמרו של תו osteoblastic הכי בוגרת19 בזמן מובחן hFOB העובר האנושי תאים נמצאים בשימוש נרחב כמודל עבור רגילה osteoblastic בידול20. הפרופילים שלהם מינרליזציה נותחו על ידי שיטות שונות: צביעת Alizarin אדום-S (AR-S), אולטרה סגול (UV) אור ויזואליזציה, הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה, אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX) כימות ופתוח יון מיפוי. היתרון של TEM-EDX על טכניקות חלופיות השתמשו במחקרים קודמים הוא נותן תוצאות כמותיים ואיכותיים של יון החלפת אפטיט קריסטלים4,5,21. המטרה הכוללת של שימוש TEM-EDX היתה למצוא שיטה פשוטה עבור הדמיה וכימות של ההתפלגות של יונים Ca, F ו- Cl ב מינרלים שונים מסוגים שונים של תאים בשלבים שונים של תהליך מינרליזציה. שיטה זו בהצלחה שימש, לדוגמה, עבור ניטור האינטראקציה של אבץ חלקיקים עם כימיקלים coexisting והשפעתם משולב על אורגניזמים ימיים22. במחקר אחר, photocatalyst נחושת טיטניום החומרים בתמיסה המימית התאפיינה בהרחבה על-ידי פלזמה inductively בשילוב ספקטרומטר פליטה אופטי (ICP-OES), N2 physisorption (ב'), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, ראמאן ספקטרוסקופיה, TEM-EDX ו- photoelectrochemical מידות23. המטרה שלנו הייתה להשוות את מקור והמאפיינים של שלפוחית ומינרלים בשתי שורות תאים כדי להבין את המנגנון השולט מינרליזציה במהלך התמיינות osseous.

figure-introduction-1
איור 1 . ערכה של השלבים הראשונים של מינרליזציה בתאים osseous מעורבים הסינתזה של חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) ושחרור של מטריקס שלפוחית (MVs) של הקרום. MVs לצבור סידן דרך הפעולה של סידן מחייב חלבונים, annexins ופוספט, דרך הפעולה של טרנספורטר פוספט אי-אורגנית (בור) ואחריו את הפעילות של רקמה שאינם ספציפיים אלקליין פוספטאז (TNAP), אשר dephosphorylates PPאני כדי Pאני, ובכך להקל התגרענות אפטיט. לאחר מכן, MVs להתפרק ולשחרר apatites למדיום חוץ-תאית. מינרליזציה הוא נגרם על ידי אספקה מתמדת של Pאני ו- Ca2 + ב חוץ-תאית בינוני4,5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תא תרבות וטיפול

  1. לשים את כל החומרים הדרושים מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית ולחטא אותם תחת אור UV. התרבות והתקשורת: תערובת 1:1 של ירך חזיר של F12 ומדיה DMEM עם 2.5 מ מגלוטמין בתוספת פניצילין U/mL 100, 100 U/mL סטרפטומיצין, 0.3 מ"ג/מ"ל G418 ו 10% סרום שור עוברית (FBS) (v/v) כי עובר אנושי hFOB 1.19 SV40 גדול T אנטיגן transfected תאי העצם, 5A בינוני מקוי עם 1.5 מ מגלוטמין שיושלם עם פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין U/mL 15% FBS (v/v) עבור תאים אנושיים אוסטאוסרקומה Saos-2.
  2. תרבות hFOB 1.19 תאים ב 34 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2 ותאים Saos-2 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2- העבר תרביות תאים, גם hFOB 1.19 או Saos-2 תאים, החממה מכסה המנוע זרימה שכבתית ושנה המדיום 10 מ"ל של מדיום תרבות טריים עם FBS.
  3. דגירה תאים בלי תכשירים (resting תאים) או לעורר אותם עם µg 50/מ"ל חומצה אסקורבית (AA) ואחריו 7.5 מ מ β-Glycerophosphate (β-GP), שהוכן קודם לכן במים הנדסה גנטית, מסונן דרך 0.22 מיקרומטר סביבונים. להוסיף תכשירים של צינורות פלסטיק microcentrifuge על גבי המשטח של המדיום תרבות. בעדינות מוסיפים את המנה תרבות, תקופת דגירה של 7 ימים.

2. זיהוי של מינרלים סידן

  1. לשטוף את תרביות תאים עם פוספט מאגר מלוחים (PBS: 125 מ"מ NaCl, 5 מ מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 1 מ מ ח'2PO4, pH 7.0).
  2. הוסף 5 מ של 2% (g:100 מ"ל) AR-S ב- PBS, pH 5.0 דגירה הלוחות למשך 30 דקות להכתים את המינרלים.
  3. לשטוף 3 פעמים עם PBS. בזהירות להוסיף PBS לקיר מאכל, נסה לא להרוס את המינרלים.
  4. להתבונן סידן מינרלים תחת מיקרוסקופ אור הפוך, תמונות.

3. הדמיה של הגששים תחת אור UV

  1. עבור תא lysates, התייחס תרביות תאים, נח או מגורה במשך 7 ימים, על פי פרוטוקול עיכול collagenase24.
  2. לאסוף את המדיום של תרביות תאים ולשטוף את התאים עם PBS.
  3. לעכל את התאים עם 3 מ"ל של 500 collagenase U/mL בפתרון של 0.25 M סוכרוז, 0.12 M NaCl, 0.01 M אשלגן כלורי, ומאגר 0.02 נקודות מ' טריס-HCl, pH 7.45, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  4. מכנית לגרד את התאים, להעביר אותם צינורות פלסטיק microcentrifuge, ולהעביר אותם 10 פעמים באמצעות מזרק 1 מ ל 40 U עם 0.5 × 16 המחט.
  5. Centrifuge את הדגימות ב 500 g × במשך 5 דקות.
  6. למחוק את תגובת שיקוע והשהה בגדר תא ב- 500 µL הסחוס סינתטי הלימפה (SCL, 100 מ מ NaCl, 12.7 מ"מ אשלגן כלורי, מ מ 0.57 MgCl2, מ מ 1.83 NaHCO3, מ מ 0.57 NaH2PO4, 5.5 מ מ D-גלוקוז, 63 מ מ סוכרוז, 16.5 מ מ Hepes, pH 7.4).
  7. להעביר את היידרוקסיאפטיט (HA), fluorapatite (FA) ואבקות chlorapatite (CA) הבקבוקים על transilluminator UV עם מרית, להשתמש כפקדים.
  8. להעביר את lysates תא צינורות פלסטיק עם טיפים פלסטיק ומניחים בזהירות על transilluminator UV.
  9. קח תמונות תחת גלוי ו- UV אור.

4. הכנת זונדי TEM-EDX

  1. הכנה של מינרלים מכתים שלילי
    1. להשעות 2.5 מ"ג לאכסון המיוצר HA, CA ו- FA מינרלים25 ב- 500 µL של מים יונים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2 לשעה.
    2. לקחת את Formvar/פחמן 300 Mesh ני רשתות מהתיבה עם מלקחיים בתמיסה, מניחים על צלחת פורצלן רב טוב ושחרר 10 µL של המתלים HA, CA, הפא על הרשתות.
    3. יבש את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הכנה של נח, המרצת תאי להטבעת 26
    1. לאסוף בינוני מן התרבויות תא ולשטוף את התאים הקהיה פיזיולוגיים (PD) בינונית (125 מ"מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ NaHCO3, 1 מ מ ח'2PO4, גלוקוז 10 מ מ, 20 מ מ HEPES, pH 7.4).
    2. לתקן את התאים עם 5 מ של תערובת של 3% (g:100 מ"ל) paraformaldehyde/1% (g:100 מ"ל) גלוטראלדהיד במאגר סודיום פוספט 100 מ מ, ה-pH 7.2, לשעה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע fume.
    3. לשטוף את התאים 5 מ ל 100 מ מ סודיום פוספט מאגר ולהסיר בעדינות את המאגר לאחר הרחצה.
    4. בחדר חשוך, postfix הדגימות עם 2 מ של 1% (g:100 מ"ל) אוסמיום ארבע-חמצני במאגר סודיום פוספט 100 מ מ, ה-pH 7.2, למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע fume.
    5. הסר אוסמיום ארבע-חמצני, לנצל את זה.
    6. לשטוף את התאים 5 מ ל 100 מ מ סודיום פוספט המאגר.
    7. לאחר מכן, מייבשים את הדגימות ב 5 מ ל aliquots סדרה פתרון אתנול מדורגת בטמפרטורת החדר: 25% (על-ידי כרך) במשך 5 דקות, 50% (על-ידי כרך) במשך 10 דקות, 75% (על-ידי כרך) למשך 15 דקות, 90% (על-ידי כרך) במשך 20 דקות. לבסוף להשתמש אתנול מוחלטת פעמיים, תקופת דגירה של 30 min ו- 12 שעות.
    8. לגרד את התאים מן התרבות פטרי פלסטיק, לאסוף לתוך צינורות פלסטיק microcentrifuge, centrifuge את הדגימות-g x 130 עבור 1 דקות.
    9. הסר את supernatants, להשעות את התאים 1 מ"ל של תערובת של שרף לבן LR, אתנול מוחלטת ביחס נפח של 1:2.
    10. מערבבים היטב את התוכן של צינורות זכוכית לפני השימוש, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    11. Centrifuge את הדגימות-g x 130 עבור 1 דקות.
    12. להסיר את supernatants, חזור על השלב הקודם באמצעות 1 מ"ל של תערובת 1:1 של שרף לבן LR ואתנול מוחלטת.
    13. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    14. Centrifuge את הדגימות-g x 130 עבור 1 דקות.
    15. להסיר את supernatants.
    16. לבסוף להוסיף 1 מ"ל של שרף LR לבן טהור הדגימות פעמיים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר צינורות פלסטיק.
    17. להכניס 500 µL של כל מדגם בתוך קפסולות ג'לי מוצקות.
      הערה: הדגימות מסומנות באמצעות גיליון קטנות של נייר ועיפרון כך השרף אינו הורס את התוויות.
    18. סגור את קפסולות ג'לי מוצקות, להכניס אותם לתוך צינורות פלסטיק microcentrifuge, צנטריפוגה-g 130 x עבור 1 דקות ברוטור והזזה.
    19. הסר את הכמוסות צינורות פלסטיק באמצעות משאבה ואקום.
    20. להעביר את הדגימות אל התנור, פולימריזציה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
    21. הכן את אבני על ידי הרכבה אותם לתוך למחזיק, זמירה אותם לפירמידה.
    22. להכניס את המחזיק ultramicrotome, לצרף את הסכין אולטרה 45° יהלום ולמלא אותה עם מים יונים; זכור לנקות את הלהב של בועות אוויר נלווים.
    23. ואז חותכים למקטעים (700 Å) בעזרת סכין יהלום לתוך האמבט יונים מים.
    24. הגדר פיסות הנייר באמצעות עפעף שור ומקום שאותם על הצד המבריק של 300 Formvar/פחמן mesh ני רשת, לייבש אותם.
    25. להכין אצטט uranyl 2.5% (על-ידי כרך) אתנול מוחלטת בחושך תחת ברדס fume. לשמור את אצטט uranyl במיכל עופרת ולזכור לא לאסוף את המשקע.
    26. בחדר חשוך, counterstain את הרשתות של apatites סינתטי ודוגמאות תא עם אצטט uranyl 2.5% (על-ידי כרך) אתנול במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע fume.
    27. לשטוף את הרשתות באתנול 50% (על-ידי כרך), ואז במים יונים ויבש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לבסוף, שים את הרשתות לתוך התיבה.

5. TEM-EDX ניתוח

  1. TEM הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מצוידים עם טווח מלא אנרגיה ואנליזת רנטגן microanalysis (EDX) ומערכת 11 מגה פיקסל מצלמה
    1. היכונו בעל בריליום התצפית של מינרלים ותאים. השתמש בכלים בתמיסה.
    2. הסר את שני הברגים והרם את צלחת בריליום, בריליום דסקית משאר הפלטה.
    3. הר על הרשת, הצד המבריק, על המחזיק.
    4. בזהירות המקום בריליום דסקית וצלחת בריליום, לדפוק בחוזקה את הברגים הצמדה.
    5. מכניסים את המחזיק תא ואקום והפעל את משאבת ואקום.
    6. ברגע ואקום מושגת, בעדינות להכניס בעל תא הדמיה והפעל את הקרן.
    7. על המסך פלורסנט, להגדיר את הפרמטרים הצמצם במיקרוסקופ. לבצע תיקון אסטיגמציה תמונה; הגדר את זום, פוקוס, ומסגרת; ולקחת TEM תמונות בהגדלה גדולה של 50, 000 X.
  2. גזע הדמיה ו- microanalysis רנטגן לצורך ניתוח ספקטרלי ואת ההלחנה
    1. הכנס את גלאי רנטגן (EDX) ואנליזת אנרגיה החדרה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (גזע) הדמיה.
    2. לכוון את החדות של התמונה במצב פוקוס.
    3. לקחת גזע תמונות בהגדלה גדולה של 15, 000 X.
    4. בחר נקודת המדגם עבור microanalysis רנטגן ולאסוף ספקטרה.
    5. לקבל נתונים על-ידי סיכום כל המשקלים עבור כל מרכיבי הטבלה המחזורית המדגם (כ- 100%), המסמלת את התוכן של הרכיבים הנבחרים: Ca, F, קלרנית ו P (לפי % האטום). לאחר מכן, לחשב את היחס של Ca, F או קלרנית כדי P עבור כל דגימה.
  3. מיפוי יון
    1. בחר רכיבים כגון סידן, פלואור, כלור וזרחן לבצע מיפוי יון ולבצע EDX מפות של הרכיבים שנבחרו הדגימות.
    2. לקבל נתונים על-ידי המציין הלוקליזציה של אלמנטים שנותחה: Ca, F, קלרנית ו P (לפי % אטומי) ולחשב לוקליזציה שיתוף (ב %) של Ca, F או קלרנית עם P עבור כל דגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

TEM-EDX מאפשר במבחנה ההדמיה של מטריקס שלפוחית (MVs) שפורסמו על ידי mineralizing תאים ושל מינרלים המיוצר על ידי מ'לעומת התוצאות המתקבלות בעזרת טכניקה זו להדגים התהליך של מינרליזציה רשאי להמשיך בצורה שונה סוגים שונים של תאים. הקווים תא שני קיבל את אותו הטיפול osteoblastic transdifferentiation, עדיין מגורה Saos-2 תאים על בסיס מינרלים מן ביעילות רבה יותר מאשר hFOB 1.19 תאי העצם, כפי שמעידים AR-S מכתים (איור 2). ייתכן שהדבר נובע פנוטיפ אוסטאובלסט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעיתון הנוכחי, אנו המתואר הפרוטוקולים עבור AR-S מכתים, זיהוי אור UV של fluorapatite, TEM-EDX במבחנה הדמיה של MVs שפורסמו על ידי mineralizing תאים ושל מינרלים בהפקת MVs. זה אפשרי להתייחס כל השיטות שהוזכרו לעיל על-ידי ביצוע שלבים לפתרון בעיות נפוצות מסוימות. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, מספר שלבים קריטיים צריכה להתבצע בקפידה. ראשית, עדיף להוסיף AA (שהוא חומצי) ואחריו β-GP (וזה אלקליין) כדי לשמר את ה-pH 7.4 של המדיום תרבות. שנית, לאחר AR-S מכתים, ההפקדות סידן מוכתמים הם מאוד שבירים, התאים יש לחפוף כדי למנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.

תודות

ח"כ ו- ASK ביצע פעולות ידניות, ספ להכין ציורים ואת יצר את הסרט. שאל כתב היד, ליברות כתבה את התסריט, ח"כ הכנו את השולחן. SM, RB ו- SP באורח קשה לקרוא את הטבלה, ה-script, כתב היד. המחברים רוצה להודות חנה Chomontowska על הסיוע מעולה עם ultramicrotomy וכן שמעון Suski של הנריק בילסקי לסיוע שלהם מעולה עם ניתוח TEM-EDX. המחברים רוצה להודות ד ר פטריק מטעי לתיקון מקצועי בשפה האנגלית, ברברה Sobiak עבור הקלטה לפי ההוראות.

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 140639 N401 N ממשרד הפולני של מדע והשכלה גבוהה לשאול, על ידי מענקים מן המרכז המדע הלאומי, פולין 2016/23/N/NZ4/03313 ליברות ו- 2016/23/N/NZ1/02449 אל ח"כ, האיחוד האירופי האיחוד FP7 פרויקט BIOIMAGINE : הדמיה חדשנות במחקר ובחינוך, GA מס 264173, ועל ידי את הכספים סטטוטורי של Nencki המכון של ניסיוני הביולוגיה, האקדמיה למדעים של פולין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט
חזיר' s DMEM/F12 תערובת מדיהPAAE15-8131:1, לעובר אנושי hFOB 1.19 SV40 אוסטאובלסטים גדולים של אנטיגן T (ATCC CRL-11372)
McCoy' s 5A בינוניPAAE82312-0025לאוסטאוסרקומה אנושית תאי Saos-2 (ATCC HTB-85)
תערובת אנטיביוטיקה (פניצילין/סטרפטומיצין)SigmaP0781-100ML100 U/mL כל אחד
G-418Sigma681680.3 מ"ג/מ"ל
FBSGibco1027010% עבור hFOB 1.19 ו-15% עבור Saos-2
AASigmaA-596050 ומיקרו; g/mL
ß-GPSigmaG9422-100G7.5 מ"מ
ביו-ג'ל HTP ג'לBio-Rad130-0420עבור HA
FAמסונתז על ידינו
CAמסונתז על ידינו
מאגר נתרן פוספט Na2HPO4/NaH2PO4 תערובתSigmaS7907/S82820.1 M, pH 7.2
PBSpH 7.0, הוכן על ידינו
AR-S ב-PBSSigmaA5533-25G0.5 גרם/100 מ"ל, pH 5.0
קולגנאז מסוג IASigmaC2674500 U/mL
SCL מאגר שהוכןעל ידינו
נטול יוניםהמיוצר על ידינו
אתנולPOChBA6480111אבסולוט 99.8% ופתרונות 25, 50, 75, 90%
אורניל אצטט ב-50% אתנולPolysciences Inc.21447-250.25 גרם/10 מ"ל
PD pH בינוני7.4, הוכן על ידינו
תערובת קיבוע (פרפורמלדהיד/גלוטרלדהיד)Sigma158127/G-62573%:1%
לאחר קיבוע OsO4Sigma756331%
LR שרף לבן באתנולPolysciences Inc.17411-MUNC 500 גרם1:2, 1:1, 100%
אצטוןCHEMPUR111024800בקבוקונים טהורים
<חזקים>כלי
קריוגנייםקורנינג בע"4304871.2 מ"ל
צלחות תרבית פטרי מפלסטיקפלקון353003 100 מ"מ
צינורות פלסטיקפלקון352096 ו-35207015 ו-50 מ"ל
פיפטות סרולוגיותפלקון ו-VWR357521 ו-612-37001 ו-10 מ"ל
צינורות מיקרו-צנטריפוגות פלסטיקסיגמאZ688312 ו-Z6280341.5 מ"ל שחור ו-2 מ"ל טיפים שקופים
מפלסטיקVWR613-0364, 613-0239 ו-613-10500.1-10 ומיקרו; L טבעי, 1-200 ומיקרו; L צהוב ו-200-1000 ומיקרו; מדפי
פלסטיק כחוליםL מעבדות אורA-7055-Z, A-7053-Cירוק לצינורות, כתום למיקרו צינורות וכחול לבדיקות TEM
Laminar Hera SaveThermo Scientific Co.מסנן KS12HEPA (H14 על פי DIN EN 1822)
חממות Hera CellThermo Scientific Co.15034° C עבור hFOB 1.19 ו-37° C עבור
קולט אדיםPOLONWCS-2עבור כתמי TEM
בקבוקי זכוכיתSIMAX1632414501050 ו-163241450110050 ו -100 מ"ל
צינורות זכוכית קוורץSIMAX638422010100Ø 10 מ"מ, L 100 מ"מ
משאבתIBS Integra Biosciencesנוחות VACUSAFEלתנור ואקום
MemmertUNE 40056° C
פלטת פורצלן רב בארותרוזנטל טכניק229/1212 בארות
כוסות זכוכיתSIMAX63241701002525 מ"ל
בקבוקי זכוכיתPocordDIN2210 מ"ל
קופסת פלסטיקאגר סיינטיפיק בע"מלחושך
Snap Fit קפסולות ג'לטיןאגר סיינטיפיק בע"מG3741גודל 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni רשתות בקופסהAgar Scientific Ltd.S162N3בצד המבריק
מגרד תאי סיליקוןסיגמאSIAL0010-100EAגודל 1.8/25 ס"מ
מזרק עם מחטBogMark0071 מ"ל 40 U, מחט 0.5 x 16
מזרקChiranaCH005L5 מ"ל
צנטריפוגהMPW מכשירים רפואייםMPW-350R130 x g ו-500 x g
transluminatorUV UVPM-20לאור נראה ואור UV
UltramicrotomeLKBNOVA700Å חלקים
מחזיק בלוקLKBE6711צורה עגולה
סכין יהלוםDiATOMEUltra 45°מידה 3
בקר מחזיק, הוכן על ידינו
מלקחייםROTH2855.1אנטי סטטי לרשתות
סט מריתROTHE286.1אנטי סטטי לאבקות
<חזק>הדמיה
מיקרוסקופ אור הפוךZeiss עם CanonAxioObserver Z1 מצויד ב-PowerShot G9ניגודיות פאזה, אור מועבר, 20 x אובייקטיבי, מסנני RGB
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורTEM Jeol Co. עם Oxford Instruments ו-SiS-OlympusJEM-1400 TEM מצויד במערכת מיקרואנליזה של קרני רנטגן מפזרות אנרגיה (EDX) בטווח מלא ו-11 מגה-פיקסל MORADA G2הגדלה של מצלמת 50,000X עבור TEM ו-15,000X עבור
גוף ועדשות מצלמה STEM ו-EDXNikonNikon D7100
Nikkor AF Micro 105 מ"מ f/2.8D
Nikkor AF-S 50 מ"מ f/1.8G
Nikkor AF 28 מ"מ f/2.8D 		להקלטות סרטים
מיקרופוןMXLMics Tempoלהקלטות קול
מאגר מ Saos-2 סרט מזרק ריסים

מקורות

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

hFOB 1 19
ניתוח של מינרלים המיוצר על ידי hFOB 1.19 ואלקטרון Saos-2 תאים באמצעות שידור עם אנרגיה ואנליזת רנטגן Microanalysis
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.