פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae
במאמר זה
סיכום
תקציר
רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר. תאים decidual, המורכב בעיקר תאי סטרומה decidualized של תאים חיסוניים, אחראים הפרשת גורמים הורמונליים דלקתית אשר הם קריטיים עבור הבלסטוציסט מוצלחת השרשה, פיתוח היפרדות לשחק תפקיד חניכה של העבודה לטווח, לידה מוקדמת. רבים הריון לסיבוכים לפליטת של איזון עדין של אוכלוסיות תאים שונים הכוללת רותמי. שינויים ביחס של סוגי תאים decidual מסוים עשוי לשבש תהליכים חיוניים אלה ולהגביר את הסיכון לפתח סיבוכים חמורים של ההריון, כגון כשל השרשה של העובר, פיגור גדילה תוך רחמי, רעלת, צירי. פרוטוקול שמפורטות כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידודו של התאים decidual העיקרי של האדם שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. על ידי שילוב עיכול אנזימטי ובהפסקות מכני עדין של הרקמה decidual, הושג תשואה גבוהה של תאים decidual עם כמעט ללא זיהום chorion. חשוב, מאופיינים מבודד תאים decidual (תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (% 1) או trophoblast (0.01%) תאים) ומתוחזק הכדאיות גבוהים (80%) אשר אושר ע י ססגוניות assay cytometry זרימה הדמיה. פרוטוקול זה ספציפית parietalis רותמי, ניתן להתאים בשליש הראשון והשני placentae. מבודדת בעבר, תאים decidual יכול לשמש עבור מספר רב של יישומים ניסיוני במטרה להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא decidual שונים של סיבוכים בהריון.
מבוא
רירית הרחם, אחד הפעילים ביותר למבוגרים נקבה ברקמות, עובר שיפוץ דרמטי בכל מחזור הוסת בתגובה לגירוי על ידי השחלה הורמונים, אסטרוגן (E2) ופרוגסטרון (P4). רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר שנוצר עד לסוף השלב postovulatory כתוצאה מונחה P4 בידול בעקבות השלב proliferative E2-הדומיננטי. תאים decidual אחראים הפרשת ההורמונים גורמים הבלסטוציסט מוצלחת השרשה ועל פיתוח של הממשק עם רחם-היפרדות לשמירה על סובלנות אימהי להשתלת העובר.
Decidualization נדרש השרשת ובניה עוקבות של העורקים ספירלה decidual. תאי סטרומה רירית הרחם עוברים decidualization, תחת השליטה של P4, מחנה, במהלך שלב luteal מאוחר של המחזור החודשי1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
Placentae נאספים מהסמסטר בריא, לא בנשים העבודה שעברו קיסרי אלקטיבי. איסוף, עיבוד, חד פעמית של דגימות האדם לדבוק הקווים המנחים של הלוח הר סיני החולים אתיקה. בכתב מתקבל של כל מטופל. מחקר זה אושרה על ידי מועצת המנהלים של אתיקה מחקר בבית החולים הר סיני.
1. תכשירים
הערה: כל השלבים להתבצע תחת ברדס fume, כל ציוד כירורגי חייב להיות מעוקר דרך החיטוי לפני השמה בשכונה fume. כל חומר אחר (בקבוקים, צינורות 50 מ ל, וכו ') חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול פתרון. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת בעת עבודה עם פסולת ותברואה (חלוק, כפפות, שיער ארוך אסוף, וכו ').
- פתרון עיכול אנזימטי (הפתרון הסופי: 200....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לאמת את היעילות ואת הכדאיות של תאים מבודדים, אופיינו על ידי שתי שיטות: flow cytometry, immunocytochemistry (ICC). אוכלוסיות תאים 4 ממוקדים; decidualized תאי סטרומה אותרו על ידי הנוגדן אנטי-vimentin, פן-ליקוציט סמן CD45 שימש כדי לזהות תאים חיסוניים decidual, cytokeratin שימש כדי לזהות תאים אפיתל אנדותל, בסופו של דבר, cytokeratin 7 שימש כדי לזהות כל trophoblast פוטנציאליים (chorion או היפרדות) זיהום.
על אפיון באמצעות מיכשור הד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידוד תאים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח האנושיות placentae כי הוא מאוד נגיש וברור. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בשני גורמים קריטיים, (1) יעילות של גירוד decidual מהשכבה chorion בקרום עוברי וטיפול (2) שבה התאים decidual מטופלות לאורך כל הפרוטוקול. זה חשוב כי זיהום רקמות chorion נשלטת על-ידי הבטחת כי לא נכלל בטעות במהלך גירוד decidual, על-ידי זיהוי והסרה של כל זיהום במהלך השלבים כביסה (ההבדל מורפולוגיה רותמי, chorion מאפשר הסרה קלה של chorion אשר שיי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף
תודות
המחברים רוצה להודות התורמים, את BioBank RCWIH, ואת ביה ח הר סיני/UHN המחלקה למיילדות גינקולוגיה עבור דגימות האנושי השתמשו במחקר זה. ברצוננו להודות לחברים של המעבדה בורית, במיוחד ד ר קרוליין דאנק עזרה עם פיתוח השיטה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן ברוכים הבאים בורוז (גרנט #1013759).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| האנק' תמיסת מלח מאוזנת עם סידן ומגנזיום | מוכן במתקן (LTRI) | ||
| Hank' s תמיסת מלח מאוזנת ללא סידן ומגנזיום | מוכן במתקן (LTRI) | ||
| רפידות חיתולים | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| מספריים כירורגיות גדולות | AL Medical | 2018-12-20. | |
| מלקחיים כירורגיים גדולים | Fine Science | Tools 11000-18 | |
| מגרד תאים חד פעמי מפלסטיק (25 ס"מ) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 מ"מ (גודל 60 רשת) מסננת מתכת | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| אזמל חד פעמי עם ידית פלסטיק (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| צלחת פטרי סטרילית מפלסטיק (קוטר 10 ס"מ) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| מיכל דגימה סטרילי (כוס שתן, 4.5 אונקיות) | VWR | 25384-146 | |
| מסנן ניילון (70 מ"מ) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| מאגר ליזה אריתרוציטים | Qiagen | 79217 | |
| טריפאן כחול, תמיסה 0.4% | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| המוציטומטר | Reichert | 1490 | |
| מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 אמצעי תרבות | Invitrogen | 11835-055 | |
| סרום בקר עוברי | Wisent | 080-150 | |
| נורמוצין (50 מ"ג/מ"ל) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| יחידת סינון עליונה מפלסטיק (ממברנה 0.22 מ"מ, 500 מ"ל) | Millipore | SCGPT05RE | |
| קולגנאז 2, אבקה ליופילית | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| מעכב טריפסין פולי סויה, אבקה | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| אבקת DNase | בקר Roche | 10104159001 | |
| (אבקת BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| ציטומטר זרימת הדמיה - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| תוכנת IDEA | Millipore Sigma | ||
| APC מצומד נוגדן וימנטין | R& D Systems | IC2105A | |
| נוגדן CD45 מצומד APC H7 | 641399 | ||
| נוגדן ציטוקרטין מצומד FITC | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -מצומד ציטוקרטין 7 נוגדן | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 צבע כדאיות לתיקון | תרמו פישר סיינטיפיק | 65-0863-14 | |
| נוגדן ראשוני וימנטין | סנטה קרוז | sc-7558 | |
| CD45 נוגדן ראשוני | Dako | M0701 | |
| נוגדן ראשוני ציטוקרטין | Dako | M0821 | |
| ציטוקרטין 7 נוגדן ראשוני | Dako | M7018 | |
| עכבר IgG | סנטה קרוז | sc-2025 | |
| עז IgG | סנטה קרוז | sc-2028 | |
| נוגדן משני Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 נוגדן משני | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
מקורות
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidual....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
