מאמר שיטה

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי

DOI:

10.3791/57444

⸱

27 במרץ 2018

 ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא גרעין האקומבנס חיוני שהבהרת בתפקוד קולטן D1 בזמן מחלה במערכת העצבים המרכזית. ביצענו את הרומן RNA בחיי עיר הכלאה assay להמחיש מולקולות RNA יחיד באזור ספציפי במוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המרכזית, הקולטן סוג D1-אלפא (Drd1α) הוא הקולטן דופמין (DA) הנפוץ ביותר, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות עצביים צמיחה והתפתחות. עם זאת, המנגנונים חריגות קולטן Drd1α תיווכה תגובות התנהגותיות, להתכוונן פונקצית זיכרון העבודה הם עדיין לא ברור. באמצעות ה-RNA הרומן בחיי עיר הכלאה assay, המחקר הנוכחי מזוהה דופמין Drd1α קולטן טירוזין hydroxylase (ה) RNA והביטוי של המעגלים הקשורות DA גרעין האקומבנס (NAc) אזור ואזור הסובסטנציה ניגרה (SNR), בהתאמה. Drd1α ביטוי ה-NAc מראה "דיסקרטית נקודה" צביעת דפוס. מין ברורים ההבדלים בביטוי Drd1α נצפו. לעומת זאת, תאנון מציג תבנית מכתימים "אשכולות". לגבי ביטוי TH, חולדות נקבות מוצגים ביטוי האות גבוה יותר בכל תא יחסית חיות זכר. השיטות המובאות כאן מספקים טכניקה הכלאה הרומן בחיי עיר חוקרת שינויים בתפקוד מערכת הדופמין במהלך ההתקדמות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד לקוי של מערכת הדופמין striatal מעורב ההתקדמות של סימפטומים קליניים שנצפתה במספר מחלות נוירוקוגניטיבי. קולטני D1 דופמין נוכחים קליפת המוח הקדם חזיתית (PFC) והאזורים striatal של המוח ולהשפיע בכבדות תהליכים קוגניטיביים1, כולל עבודה זיכרון, עיבוד טמפורלית ו-2,קטר התנהגות3 , 4 , 5 , 6 , 7. מחקרים הקודם הובהר כי שינויים של קולטני דופמין D1 היו קשורים עם ההתקדמות של תשומת לב קשב (ADHD) הפרעת8, הסימפטומים נוירוקוגניטיבי סכיזופרניה9, 10 והלחץ הרגישות11. באופן ספציפי, בסכיזופרניה, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מחקרים ציינו כי היכולת מחייב של רצפטורים D1 דופמין cortices הקדם חזיתית היה מאוד קשור קוגניטיבית ואת נוכחותם של סימפטומים שליליים11. הגידול דנדריטים של נוירונים סינאפסות בתוך קליפת המוח הקדם חזיתית מוסדר על ידי רצפטור דופמין D1 מקלה על רגישות ללחץ. יתר על כן, נוקאאוט של קולטן D1 בנוירונים המדיאלי הקדם חזיתית בקליפת המוח (mPFC) יכול לשפר מפגינות הימנעות חברתית מפלה חברתית12.

כאן, אנחנו מציגים טכניקה הרומן של RNA בחיי עיר הכלאה להמחיש יחיד מולקולות RNA בתא עם דגימות רקמה מוקפאות. הטכניקה הנוכחית יש מספר יתרונות על פני שיטות הקיימות בתוך הספרות הנוכחי. ראשית, ההליך הנוכחי המשמרת את ההקשר המרחבי, מורפולוגיים של הרקמה, בוצעה על דגימות רקמה מוקפאות כך הליכים אחרים הדורשים טריים, רקמות-מוטבע יכול להיות משולב עם השיטות הנוכחי. נהלים דומים ברקמות פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע יש מאויר כי הרזולוציה שעתוק יחיד המתאפשר באמצעות של RNA בחיי עיר הכלאה טכניקה13. זיהוי של RNA ברמת שעתוק יחיד מספקת רגישות מעולה ביטוי מספר עותק נמוך, כמו גם את ההזדמנות להשוות ביטוי גנים ברמה של תאים בודדים, כי אינה יכולה להיות מושגת על ידי שיטות זיהוי חומצות גרעין אחרות, כגון טכניקות (PCR), תגובת שרשרת של פולימראז. בנוסף, השיטה הנוכחית שומרת על תמונות עם יחס אות לרעש גבוה דרך הגששים RNA ספציפי מאוד hybridized אל יעד בודד RNA תעתיקים, והוא מחויב ברצף עם מפל של מולקולות איתות הגברה זיהוי מערכת. לבסוף, הטכנולוגיה הנוכחי מספק הזדמנות להעריך את מספר מערכות ביולוגיות עם הגששים קניינית שלה במטרה, במקום להגביל את החקירה שלנו לכיתה אחת בלבד הקשורות למערכת סמנים כגון זיהוי חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה שיטות.

במחקר שלנו, השתמשנו הזה RNA הרומן בחיי עיר הכלאה להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc), טירוזין hydroxylase (ה) ביטוי הסובסטנציה ניגרה (SNR) של חולדות F344/N גם זכר וגם נקבה. RNA חדשני בחיי עיר הכלאה אפשרה לנו לחקור את המנגנונים המשפיעים על ספיגת DA והן שחרור דא בו זמנית, שיפור ההבנה שלנו של המורכבויות של המערכת striatal DA. כאן, אנו מתארים את ההליך עבור המוח קפוא טרי פרוסות ולספק שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: "dot דיסקרטית" או "אשכולות".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול נסיוני אושרה על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC)-מאוניברסיטת דרום קרוליינה (אבטחת פדרלי מספר: A3049-01).

1. הכנת חלקים במוח קפוא טרי

  1. להשתמש המתח F344/N עכברוש: חולדות שלושה מכל מין, גוף 13 חודשים של גיל, משקל כ 320 גרם.
  2. התאם את הריכוז sevoflurane 5% (יתר של sevoflurane). המשך החשיפה sevoflurane לאחר נשימה עוצר לרגע נוסף.
  3. לערוף את החולדה, מסירים את המוח.
  4. להטביע את המוח חולדה בחנקן נוזלי 15 s בתוך 5 דקות של רקמות הקציר.
  5. Equilibrate המוח ל-20 ° C ב- cryostat לשעה.
  6. לחתוך 30 מיקרומטר מקטעים ולהעביר אל מגלשות (ראה טבלה של חומרים).
  7. לבחור קטעים מתוך האזור גרעין האקומבנס, כ- 2.76 מ"מ עד מ"מ 2.28 והשתרשה עמוק בלבה Bregma14.
  8. ללא הרף פורסים את מוח עכברוש מן הנורה הריח דרך האזור גרעין האקומבנס על פי מבנה המוח stereotaxic של העכברוש.
  9. הר דוגמאות על השקופיות. שמור את הסעיפים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לייבוש.
  10. מיד לטבול שקופיות paraformaldehyde 4% צוננת מראש עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  11. מקם את השקופיות הצבע אתנול הגוברת בטמפרטורת החדר (RT): 50% EtOH במשך 5 דקות; 70% EtOH במשך 5 דקות; ל- 100% EtOH במשך 5 דקות.
  12. . אני חוזר עם טרי 100% EtOH.
  13. במקום שקופיות על נייר סופג, אוויר יבש.
  14. לצייר חיץ סביב כל מקטע עם עט מכשול (ראה טבלה של חומרים). תן את מחסום יבש לחלוטין עבור 1 דקות.

2. רעלני סעיפים המוח

  1. להדליק את התנור והגדר את הטמפרטורה 40 ° C.
  2. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של ריאגנט רעלני 4 (ראה טבלה של חומרים) על כל המוח מקטע (מקטע אחד לכל שקופית).
  3. דגירה הסעיפים למשך 30 דקות ב- RT.
  4. להטביע את השקופיות עבור 1 דקות ב- RT. חוזר עם PBS טרי 1 x 1 x PBS.
    הערה: שקופיות לא צריך להיות ב- PBS 1 x יותר מ 15 דקות.

3. RNA מולטיפלקס פלורסנט בחיי עיר הכלאה Assay

  1. החללית היעד עבור 10 דקות ב 40 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים חמים ולאחר מכן להצטנן עד RT.
  2. מקום הכימית RNA (למשל, כח 1-4 FL)-RT.
  3. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  4. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המכשיר Drd1α (C1) על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 2 h ב- 40 מעלות צלזיוס.
  5. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  6. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  7. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 1-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  8. להטביע שקופיות במאגר שטיפת 1 למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם מאגר 1wash טריים.
  9. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  10. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 2-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  11. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  12. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  13. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 3-FL על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  14. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  15. הסרת עודפי נוזלים משקופיות עם נייר סופג את המקום בחזרה על המדף שקופית (ראה טבלה של חומרים).
  16. להוסיף 3 טיפות (90 µL) של המגבר 4-FL-Alt A על הפרוסה הדגימה. תקופת דגירה של 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
  17. להטביע שקופיות 1 x שטיפת מאגר למשך 2 דקות ב- RT. חוזר עם טרי 1 x מאגר לשטוף.
  18. הסרת עודפי נוזלים משקופיות ומניחים מיד 2 טיפות של ריאגנט הרכבה (ראה טבלה של חומרים) על גבי כל מקטע.
  19. מקום coverslip 22 מ"מ 22 מ מ (ראה טבלה של חומרים) מעל כל מקטע המוח.
  20. לאחסן שקופיות בחושך ב 2-8 ° C עד יבש.
  21. הפעלת מיקרוסקופ קונפוקלי ולעבור מטרה X 60.
  22. להשיג תמונות Z-מחסנית עם מיקרוסקופ קונפוקלי. ראו את הוידאו משלימה לניתוח מפורט של הדמיה קונפוקלי.
  23. לרכוש תמונות של Drd1α עם התווית תאים באזור גרעין האקומבנס (עירור: 488 ננומטר; פליטה: 515/30 ננומטר).
    הערה: אל תתנו את המוח מקטעים לייבש בין השלבים הדגירה.

4. ניתוח נתונים

  1. באופן כמותי למחצה לנתח את התבנית מכתימים: "דיסקרטית נקודות".
    1. כדי לזהות את תא בודד מתוך התמונה, לבצע דאפי מכתים כסמן גרעינית. עם זאת, עדיין קשה לנתח חלקים מסוימים של רקמת המוח, שכן יש סוגים שונים של תאים עם צורה לא סדירה של גרעינים ו/או תאים. . הנה, שני חוקרים מנוסים להקצות בנפרד בכל תא מתמונות להגדרת אזור תא.
    2. מבחינה ויזואלית ניקוד לכל תא בתוך הדימויים קונאפוקלית ייצוגית המבוססת על מספר נקודות בכל תא באמצעות קריטריונים מסוימים (איור 1B).
    3. לקבוע את מספר התאים הכולל בכל קטגוריה ולחלק לפי מספר התא סך הכל x100 ליצירת גרפים התדירות היחסית המציגים את תדירות אחוז של תאים בתוך כל קטגוריה עבור כל מקטעי רקמת (איור 2 א) ועבור זכרים ונקבות בנפרד (2E איור).
    4. לחלק את הסכום של תאים בתוך כל הקטגוריות מוקדמת לפי מספר התא סך הכל x100 כדי לקבוע תדירות המצטברת של תאי רקמת כל המקטעים (איור 2B) ועל זכרים ונקבות בנפרד (2F איור).
  2. מבחינה סטטיסטית לנתח את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס (אופציונלי).
    1. בדוק את מספר הנקודות בכל תא לספק קטגורית משתנה זה סודר בטבע (קרי, מספר התאים אשר מתחלקים בכל קטגוריה דרגה תא הנמוך הביטוי (1) לביטוי תא הגבוה ביותר (9)) עבור ניתוחים סטטיסטיים נוספים.
    2. לאחר בדיקה של סטטיסטיקה תיאורית, להשתמש שלוש גישות עיקריות: סטטיסטיקה האח-Haenszel, מבחן מאן-ויטני U ו מבחן Kruskal-איי ווליס. למרות הגישה סטטיסטי מדויק יהיה תלוי השאלה ניסיוני, עיצוב ומחקר של עניין, עץ ההחלטה סטטיסטי (איור 4) עשויים לסייע בקבלת החלטות בנוגע לגישה האנליטית של אחד.
  3. לכמת את עוצמת האות באזור של הריבית (ROI) עבור צביעת דוגמת: "אשכולות".
    1. לחשב את עוצמת האות של כל תמונה באמצעות המשוואה הבאה:
      עוצמת אות = סה כ האינטנסיביות של רועי תמונה - (רקע ממוצע עוצמת × הכולל אזור בתמונה)
    2. לספור את המספר הכולל של תאים בתוך התמונה רועי כדי לחשב את הביטוי אות משוער בכל תא. קבוצה הבדלי עוצמת האות/תמונה, כמו גם את מספר התאים/תמונה יכול להיות מעניין לשקול מנגנונים שעשויים לתרום ההבדלים קבוצה ראיתי בתא/אות ביטוי (איור 3B-3D).
  4. מבחינה סטטיסטית לנתח את "אשכולות" צביעת דפוס (אופציונלי).
    1. לבחון את האות הביטוי/התא כדי לספק משתנה רציף לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף. שימוש שתי הגישות, כולל מבחן t מדגם עצמאית השונות (ANOVA), בהתבסס על מספר גורמים בין הנושאים הכלולים העיצוב. עץ החלטה סטטיסטי (איור 4) עשויים לסייע בקבלת החלטות לגבי הגישה הסטטיסטית המתאימה ביותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי בחן של "נקודות דיסקרטית" צביעת דפוס להבעה RNA קולטני D1-אלפא דופמין (Drd1α) של ה-NAc בחולדות F344/N (איור 1 א'). אותות פלורסצנטיות בודדים זוהו בקלות, ניתן לראות יחיד "נקודות", שכל אחד מהם מייצג תעתיק רנ א יחיד בתוך התא. עבור תמונות של ה-NAc המציגים את "הנקודות דיסקרטית" צביעת דפוס, אנחנו העריכו את הטווח הדינמי של ביטוי באמצעות ניתוח כמותי למחצה (איור 1A, איור 2A& 2B)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה הרומן של הכלאה בחיי עיר פרוסות המוח מוקפאות להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc) וביטוי hydroxylase (ה) טירוזין באזור הסובסטנציה ניגרה (SNR). כמו כן אנו מספקים שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: "dot דיסקרטית" או "אשכולות".

השלבים הקריטיים קרינה פלואורסצנטית מולטיפלקס מוצלחת RNA בחיי עיר הכלאה assay הינם כלולים. לאחר עריפת ראשו העכברוש והסרה של המוח, להקפיא את המוח של חנקן נוזלי בתוך 5 דק לשמור הסעיפים המוח ב-20 ° C עד 4% p...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודות הנוכחי נתמכו על-ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים HD043680, MH106392, DA013137 ו- NS100624. קרן חלקית סופק על ידי מענק הכשרה NIH T32 במדעים ביו-רפואית-התנהגותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת תנורים HybEZאבחון תאים מתקדם 310010
בדיקת RNAscope - Rn-Drd1aאבחון תאים מתקדם ערוץ צבע 317031 1,
בדיקת RNAscope ירוקה - Rn-Th-C2אבחון תאים מתקדם 314651-C2ערוץ צבע 2,
ערכת ריאגנטים פלואורסצנטיים של RNAscope, אבחון תאים מתקדם 320850
ImmEdge מעבדת וקטור עט מחסום הידרופוביH-4000
SuperFrost Plus שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-154% 
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt אספקה וטרינרית347075
Tissue-Tek אנכי 24 מתלה שקופיותפישר סיינטיפיקNC9837976
צלחת מכתים Tissue-Tekפישר סיינטיפיקNC0731403
דיוק אמבטיות לשימוש כלליThermoFisher ScientificTSGP28
טיפול מקדים 4אבחון תאים מתקדם 320850חלקי ערכות
ProLong Gold מגיב נגד דהייהLife TechnologiesP36930
אמפר 1-FLאבחון תאים מתקדם 320850חלקי ערכות
Amp 2-FLאבחון תאים מתקדם 320850חלקי ערכות
Amp 3-FLאבחון תאים מתקדם 320850חלקי ערכות
Amp 4-FL-Alt Aאבחון תאים מתקדם 320850חלקי ערכות
חבילת תוכנה EZ-C1Nikon Instrumentsגרסה 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,גרסה 9.4
כתום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ibr RNA in situZ StackMann Whitney U

מאמרים קשורים