מאמר שיטה

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

DOI:

10.3791/57451

⸱

9 באפריל 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו לתאר בדיקות מכניות בו זמנית, 3D-הדמיה של העורקים בדופן מבודדים, לחיות ההתנגדות האנושית העורקים, וניתוחים פיג'י, Ilastik התמונה עבור כימות של אלסטין וקולגן המרחבי הארגון ונפח צפיפות. נדון השימוש של נתונים אלה במודלים מתמטיים של קיר עורקי מכניקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התרומה פתוגניים של עמידות העורק שיפוץ מתועדת חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, התסמונת המטבולית. חקירות ופיתוח מודלים מתמטיים microstructurally מוטיבציה להבנת התכונות המכאניות של העורקים ההתנגדות האנושית מחלה ובריאות יש פוטנציאל לסייע להבין כיצד מחלות וטיפולים רפואיים להשפיע את microcirculation אנושי. כדי לפתח מודלים מתמטיים האלה, זה חיוני כדי לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, בו זמנית ללא תווית תלת מימדי הדמיה של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים לכימות תנועת i) לחץ-induced שינויים זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי וכן קולגן adventitial יושר באמצעות פיג'י צפיפויות כרך ii) קולגן ואלסטין נקבע באמצעות תוכנת Ilastik. רצוי כל המדידות מכני, דימות מבוצעות על העורקים בשידור חי, perfused, עם זאת, גישה חלופית באמצעות לחץ וידאו-מיקרוסקופ רגיל myography בשילוב עם קיבוע שאחרי הדמיה של כלי מווסת מחדש דנו. זו שיטה חלופית מספק למשתמשים עם אפשרויות שונות עבור ניתוח הגישות. ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר עורקי הנדונה, פיתוח עתידי ותוספות בפרוטוקול מוצעים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התרומה פתוגניים ואת ההשפעות של עמידות העורק שיפוץ מתועדים חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, תסמונת מטבולית1,2,3,4,5. לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular חיוני לפיתוח מודלים מתמטיים של עמותה זו. מודל שכזה לשפר את הבנת תהליך שיפוץ, יתמוך ההתפתחות במודלים silico שימושי לבדיקת אסטרטגיות תרופתי מיקוד מחלות הקשורות שיפוץ של הקיר עורקי.

מחקרים קודמים התמקדו בהבנת המיקרו-ארכיטקטורה של הקיר עורקי מתייחס מכניקה קיר העורק על ידי שילוב אמצעים מכניים וכיצד המיקרו-ארכיטקטורה של מטריצות (ECM) מבוצעות באופן כמעט בלעדי על גדול , צינור גמיש העורקים של עכברים או חזיר6,7,8,9,10,11. הדמיה של מזערים הקיר מתבצעת בדרך כלל באמצעות טכניקות אופטית לא-ליניאריות, מנצל autofluorescence של אלסטין, הדור השני הרמונית על ידי קולגן. פעולה זו מאפשרת הדמיה זמן-מרחבי של שני מרכיביה העיקריים של מטריצה חוץ-תאית, אלסטין קולגן, ללא צורך מכתים. הדמיה של הקיר עורקי בעובי מלא הוא אתגר בתוך צינור גדול עורקים עקב פיזור של האור בתקשורת tunica עבה. עם זאת, כדי לקבוע כיצד המיקרו-ארכיטקטורה של הרכיבים המבניים של הקיר עורקי להתייחס התכונות המכאניות נצפתה, יש להשיג מידע תלת מימדי במהלך הבדיקה מכני. עבור עורקים גדולים כמו העורקים אנושי, זה דורש הרכבה biaxial, מכני בדיקות הדמיה של אזורים עניין ב- 1-2 ס מ2 חתיכות של עורקי קיר7,9,10, 12. רק חלק הקיר יכול להיות עם תמונה ונבדק באופן מכני.

עבור עורקים קטנים יותר של כל מין (למשל, סביב הלב האנושי13, ריאתי14 ותת עורית15 העורקים, עכברוש העורקים מצע המעי העליון16,17,18, 19 , 20, העכבר cremaster, מצע המעי העליון, מוחי, הירך ואת עורק21,22,23,24,25,26, 27) הדמיה של עובי קיר שלם הינה אפשרית, יכול להיות משולב עם בדיקות מכניות. דבר זה מאפשר הקלטה בו זמנית של תכונות מכאניות, הסידורים מבניים בתוך הקיר. עם זאת, מידול מתמטי ישירה של יחסי הגומלין בין השינויים שנצפו במבנה תלת מימדי של ECM שהשתנו תכונות מכניות של הקיר עורקי ההתנגדות, לפי מיטב ידיעתנו רק דווחה על לאחרונה, ההתנגדות האנושית העורקים13,15.

בעבודה זאת, מתוארת שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, הדמיה תלת מימדי בו זמנית של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים להשגת למדידת זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי, יושר קולגן adventitial13 באמצעות פיג'י28. צפיפות האחסון קולגן ואלסטין נקבעים באמצעות תוכנת Ilastik29 ונדון בסופו של דבר, ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר העורק.

מטרתו לתאר את הבדיקות לדימות ותמונה טכניקות בשילוב עם מודלים מתימטיים היא לספק החוקרים בגישה שיטתית כדי לתאר ולהבין נצפו שינויים בלחץ המושרה ה-ECM של התנגדות העורקים. השיטה המתוארת מתמקדת ב לכימות השינויים ECM מגרגרי בזמן לחץ, על-ידי השוואת מבנה ה-ECM-20, 40 ו- 100 מ מ כספית. הלחצים הללו נבחרו לקביעת המבנה של החומה העורקים שלו תואם יותר (20 מ מ כספית), נוקשה (100 מ מ כספית) ומצב ביניים (40 מ מ כספית), בהתאמה. עם זאת, כל תהליך בדופן כלי הדם העורקים בשידור חי, כולל שינויים המושרה על ידי רכיבים vasoactive, היסטרזיס וזרימה, ניתן לכמת, בהתאם ההשערה במחקר המדובר על-ידי החוקר.

השימוש של שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (TPEM) בשילוב myograph לחץ לשינויים לומד לחץ (או השני) הנגרמת ב- ECM העורקים בשידור חי מודגשת. קודם כל, כי זה מאפשר רכישת סימולטני של מבנה תלת-ממדי הכולל של החומה עורקי (קוטר וקיר עובי) יחד עם רכישת תלת-ממדי ללא תווית של איכות גבוהה, מפורט תמונות של קולגן, אלסטין microarchitectures כמו שמתואר13 על-ידי ניצול של autofluorescence של אלסטין, קולגן השני דור הרמונית אות (SHG)30. שנית, TPEM מאפשר שימוש של אור אנרגיה נמוכה-סגול עירור, מזעור נזקי של רקמות, לפיכך, הדמיה חוזרות ונשנות-בדיוק באותה התנוחה בתוך קיר וסקולרית מותרת, המתיר ניתוח מדידות חוזרות של שנצפו שינויים.

השימוש בגישה אלטרנטיבית באמצעות הדמיה קונאפוקלית של לחץ קבוע העורקים נדון כדי לאפשר למשתמשים ללא גישה TPEM הזדמנות להשתמש בשיטה המתוארת גם כן. גם ניתן יהיה לאחזר מידע על צפיפות במבנה ונפח ECM מניתוחי דו-ממדית של רקמות למחלקה של יציאה טורית, למשל כפי שמתואר על ידי31,32. עם זאת, בשל היעדר אפשרות לאחזר נתוני מבנה תלת-ממדי על המאזניים אורך של העורק, כמו גם במהלך שינוי תנאי השימוש בשיטה זו, זה לא מומלץ שימוש בגישה זו החקירות של לחץ, טיפול המושרה תלת מימדי לשינויים ECM.

הדרישה המינימלית עבור החוקר להחיל את שיטת המתוארים במסמך זה היא הגישה אל מלכודת תעלות, לחץ עורקי בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית. ההגדרה תיאר בפרוטוקול הבא תהיה myograph לחץ לפי הזמנה עם מתמר כוח האורך, שנבנה כדי להתאים מיקרוסקופ פלורסצנטיות עירור מותאם אישית שני הפוטונים בנוי הפוכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסף של ביופסיות של הכפורת הקודקוד אנושיים לשימוש בעבודה זו בוצעה לאחר בכתב הסכמה מדעת, כפי שתואר לעיל33. המחקר של רקמות לציית העקרונות המתוארים בקוד הצהרת הלסינקי34 , אושרה על ידי ה ועדות אתיקה במחקר בריאות דרום דנמרק (S-20100044 ו- S-20140202), הסוכנות להגנת נתונים דנית.

1. לאסוף את רקמת עורק התנגדות בידוד (האדם)

  1. לאסוף דגימות רקמה עניין מיד לאחר הכריתה במהלך ניתוח. העברת הרקמה עד 4 ° C HEPES buffered פיזיולוגיים תמיסת מלח (HBS) מיד על אוסף ואחסן אותו ב- HBS.
    הערה: ברקמות אנושיות רק נאספים לאחר אישור על ידי ועדות אתיות המוסדיות הרלוונטיים, כמו גם הסכמה בכתב של המטופלים. קומפוזיציה HBS במ מ: NaCl 144, אשלגן כלורי 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, ח'2PO4 1.2, HEPES 14.9, גלוקוז 5.5. להתאים את ה-pH 7.4 עם NaOH, לסנן את המסנן למרות 0.2 µm פתרון.
  2. השאירו את הרקמה שנאספו HBS סטרילי ב 4 ° C לילה לשטוף הרדמה.
    הערה: כל השפעה של אחסון לילה על תקינות כלי ופונקציונליות צריך להיבדק על ידי המעבדה מחקר אישיים.
  3. בזהירות לבודד ההתנגדות בגודל העורקים (± 200 מיקרומטר לומן קוטר) באמצעות זוג חד-טיפ מלקחיים ומספריים ניתוח מיקרו.
  4. לאחסן את העורקים ב 4 ° C כקרח HBS תוך הטרמה תא הדמיה/לחץ.

2. הר העורק מבודדים ב Myograph הלחץ

  1. הר כגון זכוכית עם עצה קטרים של מיקרומטר ~ 80 על מחזיקי גליליים. מקם את מיקרומטר טיפים כ 150 מעל החלק התחתון זכוכית קאמרית.
    הערה: 45° עצה גהר גליליים עשוי לאפשר מיקום מדויק של כלי השיט מעל רצפת הזכוכית.
  2. למלא גם כניסה וגם שקע אבובים עם HBS עם 1% BSA וחבר מערכת הלחץ.
    הערה: BSA הינו כלול כדי לשמר את תפקוד תאי אנדותל.
  3. לטעון את העורק מבודדים בעזרת שני תפרים קשר כפול לכל בצינורית.
    הערה: קשרים יכול להיות מוכן מראש ומאוחסנים על סקוטש כפול עד שהוא נדרש.
  4. למלא את החדר עם HBS ומניחים שני קשרים כפולים על כל בצינורית זכוכית.
    הערה: בעת שימוש העורקים הצגת צליל myogenic, HBS צריך להיות מוחלף עם סידן ש-HBS בחינם בתוספת 3 מיקרומטר EGTA ו 3 מיקרומטר חמצן.
  5. החזק בעדינות את העורק בקצה אחד באמצעות שני זוגות של מלקחיים קצה חד. פתח לומן של העורק והחלק בעדינות אותו על גבי הצינורית. תקן על הצינורית באמצעות שני קשרים.
  6. החל בלחץ של 5 מ מ כספית לשטוף בעדינות לומן עם HBS / 1% BSA.
  7. נקרר את הקצה השני של העורק ואבטח אותו על הצינורית באמצעות שני קשרים כפולים.
  8. להעביר את myograph על הבמה מיקרוסקופ ואת תתאימי את העורק עד 5 מ מ כספית (כניסת הלחץ = לחץ outlet), ואז מחממים עד 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  9. אופציונלי: כיילו מתמר כוח האורך לפי הוראות היצרן (1 גרם = 9.81 mN).
    הערה: זה חיוני כדי לכייל את מתמר כוח לאחר חימום כפי שהוא רגיש לטמפרטורה.

3. לבצע ניסוי: הדמיה של קוטר העורקים, עובי הקיר, קולגן, אלסטין המיקרו-ארכיטקטורה באמצעות TPEM

  1. סריקה מהירה את העורק cannulated מווסתת 5 מ מ כספית באמצעות X 20 אובייקטיבי (מפתח נומרי (NA) ≥ 0.8) צריכת חשמל נמוכה עירור אור כדי להעריך את עובי קוטר וקיר כלי ב- 5 מ מ כספית.
    הערה: עבור מיקרוסקופים הפוכה, השתמש מטרה טבילה במים; לשימוש מיקרוסקופים זקוף, מים טובלים אובייקטיבי. אם המטרה אין קולר תיקון לתיקון מכסה עובי, הקפד להתאים בתגית כיסוי בשימוש עם המטרה בשימוש. הגדרות התוכנה והתיאורים עשוי להשתנות בהתאם למשתמש-לאטמוספרה, מיקרוסקופ והתוכנות בהם נעשה שימוש.
    1. תוכנית ההתקנה את הנתיב אופטי.
      1. להפעיל את הלייזר שני הפוטונים מאי טאי ולהגדיר אותו אור 820 של עירור ננומטר.
        זהירות: הימנעו כל חשיפה לאור לייזר גלוי, כמו גם בלתי נראה.
      2. לאסוף את פליטת במקביל בשני ערוצים. לפצל את פליטת אור בין photomultipliers באמצעות nm מעבר ארוך מראה ודיקרואיק זוהר 460 פליטת איסוף באמצעות 30-60 ננומטר bandpass רחב מסננים מרוכז בכל 520 nm (אלסטין) ו 410 nm (קולגן), בהתאמה.
    2. הפעל סריקה רציפה עם 10 µs לייזר להתעכב זמן לפיקסל ו 512 × 512 פיקסלים עבור 100% שדה ראייה.
    3. סרוק באופן ידני דרך העורק כדי לקבוע את העומק שבו נצפית מאקסימאלי.
    4. בחרו פרוסה מלבני מכסה קוטר הרחבה של העורק ולסרוק מסגרת אחת עם פיקסל גודל ≤ 300 ננומטר לפיקסל (איור 2C). כדי להשתמש כוח האור עירור נמוכות פיקסל זמן להתעכב ככל האפשר להימנע photodamaging את העורק בשידור חי.
      הערה: מומלץ להשיג מלבני, למשל., 100 × 1024 פיקסלים בתמונה, יותר מאשר תמונה ריבועית בעמדה זו כדי לחסוך זמן, להגביל את החשיפה פוטון של רקמות (איור 2C).
    5. שמור את התמונה עבור בהמשך מנתח.
  2. לקבוע את עובי קוטר וקיר לומן-הקוטר המרבי של העורק.
    1. טען את התמונה בפיג'י.
    2. קבע את קנה המידה על-ידי לחיצה על תפריט ראשי | לנתח | לקבוע קנה מידה והזן יחס לפיקסל מיקרומטר, פיקסל (מומלץ מאוד לשמור על היחס פיקסל 1:1).
    3. בחר בכלי קו פיג'י, למתוח קו ברור בין שני סחוס אלסטי פנימי בכל צד של לומן עורקים ולחץ ctrl + M. פיג'י אורך דוחות כברירת מחדל בטבלת התוצאות.
    4. באופן דומה, לצייר קווים יותר למדידת עובי של כל אחד מהקירות, לחץ על ctrl + M כדי למדוד את הסימונים הבאים.
    5. שמור את המידות.
  3. התמונה קולגן ואלסטין המיקרו-ארכיטקטורה-5 מ מ כספית על-ידי סריקת כל עובי הקיר עורקי, קבלת אוספי תמונות תלת-ממד עם איכות טובה עבור 1-3 אזורים מעניינים לאורכו של העורק.
    1. להשיג את אוספי תמונות דרך קיר שלם של העורק באמצעות 60 X אובייקטיבית, ≥ 1 נה, מידות פיקסלים ממוטבת, z-ריווח.
      1. לחשב את התנאים הדמיה אופטימלית (מידות פיקסלים ו- z-צעד ריווח) לפי מסלול אופטי, טבילה בינוני ולטעום מדדי השבירה באמצעות המחשבון המדעי אמצעי הדמיה נייקוויסט (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        הערה: נא לשים לב כאן ההבדל בין גודל הפיקסל אופטימלית z-המרווח לעומת העצה בסעיף 3.4. מעל על השימוש של גודל פיקסל מרבי .
    2. להשתמש באותן עירור, פליטה ההגדרות כמו לעיל (3.1.1.).
    3. סריקה מהירה הקיר כלי כמתואר לעיל כדי לקבוע את העובי של הערימה-z.
    4. להגדיר את z-מחסנית ההתחלה סוף עומק, z-צעד ריווח ואת צפיפות פיקסלים (מחושבת באופן 3.3.1.1.) ולבצע את z-הסריקה. שמור כל ערוץ בנפרד.
      הערה: התמונות צריך להיות קטן מספיק למשל 30 x 30 מיקרומטר או 50 × 50 מיקרומטר בהתאם לגודל הכלי כדי למנוע השפעה של עקמומיות של הניתוחים תמונות עוקבות.
  4. לקבוע קוטר העורקים, עובי הקיר, המיקרו-ארכיטקטורה אלסטין וקולגן ב לחצים הנותרים של פרוטוקול.
    1. חזור על 3.1-3.2-לחצים 10 ו- 20 מ מ כספית, לחזור 3.3-לחץ 20 מ מ כספית.
    2. חזור על 3.1 ו- 3.2-לחץ 40 מ מ כספית.
    3. 3.1-3.2-לחצים 60, 80 ו 100 מ מ כספית חוזר וחוזר 3.3-100 מ מ כספית.
      הערה: 3.1-3.3 יכול לחזור על כל הלחצים, שילובים של לחצים (למשל סדרת/שילוב של לחצים גם כמו הפחתת הגוברת), בהתאם ההשערה להיבדק. אאוזין בריכוז 0.3 - 1 מיקרומטר עשויים להתווסף כדי לשפר את אלסטין autofluorescence במקרה של photobleaching. ניתן להימנע Photobleaching על-ידי החלת כמו צריכת חשמל נמוכה עירור קלים ככל האפשר.
    4. להחליף את המאגר בבית הבליעה myograph טריים 37 ° C HBS לאחר כל שלב לחץ. לאפשר את העורק להסתגל במשך 5 דקות לפני הדמיה בעקבות כל שינוי בלחץ.
  5. לאחסן ערוץ ערימות עבור ניתוח תמונה בנפרד.
  6. בדיקת הכדאיות של העורק.
    1. החלת 10 מיקרומטר U46619 בבית הבליעה myograph ואחריו התוספת של 10 מיקרומטר bradykinin בעת כיווץ יציב נצפית.
    2. להקליט קוטר ו הקיר עובי כמתואר לעיל בסעיף 3.1 בעקבות היישום של כל אחד של תרכובות.
    3. להוסיף 3 מיקרומטר חמצן כאשר העורק הוא לא מורחבים לגמרי בעקבות התוספת של עובי קוטר וקיר bradykinin ולהקליט.
      הערה: בהתאם תכונות פרמקולוגיות של העורק עניין (מיטה כלי דם ו מינים) אחרים מצר את כלי הדם וחיבורים מרחיב כלי דם (תלויי-אנדותל) יכול לשמש.
  7. אופציונלי: לתקן את העורק בלחץ או להמשיך עם הדמיה של קולגן ואלסטין עבור אמצעי האחסון צפיפויות (שלב 7).
    1. להוסיף 4% פורמלדהיד 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 37 מעלות לשעה.
    2. לשטוף את העורק קבוע 3 פעמים ב- PBS 1 x והחלק בעדינות את העורק מחוץ גליליים, נוגע רק את החלקים של העורק בחוץ הקשרים. לא להסיר את הקשרים, להשתמש בהם עבור מחזיק את העורק בעת העברת צינור אחסון.
    3. חנות 1 x PBS / 0.05% אזיד הנתרן ב 4 ° C עד הדמיה אלסטין וקולגן צפיפות האחסון או למטרות אחרות.
      הערה: עורקים קבוע ניתן לאחסן במשך 3 חודשים לפחות 1 x PBS / 0.05% אזיד הנתרן ב 4 º C.

4. חישוב מתח מתח מערכות יחסים וקשיחות קיר פנימי

  1. נא בצע את הנוסחאות ואת צעדי החישוב לחישוב מדגיש, זנים, קשיחות קיר כפי שתואר על ידי Bloksgaard, מ. et al. 13 , הפניות במסמך זה.

5. ניתוח - (פרופריה אלסטית פנימית) אישור IEL מסעף זוויות תמונה

  1. אוסף תמונות פתוח בפיג'י. עבור אל קובץ | תמונה פתוחה לבחור אוסף תמונות.
    הערה: מקס תחזיות בעוצמה סעיפים 2-7 ברציפות z-מכסה את אישור IEL (1-2 מיקרומטר עובי) משמשים לקביעת אישור IEL אלסטין סיבים מסעף הזוויות בעזרת הכלי זווית פיג'י28,35. עיין 4A איור להמחשה.
  2. ללכת תמונה | ערימות | פרוייקט z. לבחור את התמונות ואת "הטלה בעוצמה מקס".
  3. שמור את הטלה בעוצמה מקסימלית כקובץ TIFF.
  4. לבחור נקודות הסתעפות סיבים אישור IEL רבות ככל האפשר באמצעות הכלי"זווית" ולעבוד באופן שיטתי באמצעות התמונות. לחץ על ctrl + M כדי למדוד כל זווית.
  5. שמור את הגיליון תוצאות פיג'י.

6. ניתוח - קולגן Adventitial Waviness תמונה

  1. אוסף תמונות פתוח בפיג'י. עבור אל קובץ | פתח תמונה לבחור אוסף תמונות.
    הערה: מקסימום עוצמת תחזיות סעיפים 2-7 ברציפות z-כיסוי קולגן ממש מחוץ חיצוני הנדן אלסטי (צלופח, עובי 1-4 מיקרומטר) משמשים לקביעת קולגן waviness באמצעות תוסף פיג'י NeuronJ36 כפי שתואר על ידי Rezakhaniha, R . ואח. 37 (איור 4B).
  2. קבע את קנה המידה. עבור אל לנתח | לקבוע קנה מידה להזין מידות פיקסלים.
  3. ללכת תמונה | ערימות | פרוייקט z. לבחור תמונות כדי לעבוד עם "מקס הטלה בעוצמה".
  4. לשנות סוג תמונה 8 bitt TIFF על-ידי לחיצה על תמונה | סוג | 8 bitt ולשמור את הטלה בעוצמה מקסימלית כקובץ TIFF.
  5. למדוד יושר סיבי הקולגן באמצעות התוסף J נוירון פיג'י.
    1. לפתוח את התוסף NeuronJ על ידי לחיצה פיג'י | תוספים | נוירון J.
    2. פתח את 8 סיביות TIFF ב NeuronJ על ידי לחיצה טען תמונה | בחר בקובץ.
    3. לחץ על הוסף לשרטוטיםובחר סיבים כדי לנתח על ידי לחיצה על ההתחלה והסוף של כל סיב.
    4. לחץ על מדד לשרטוטים, בחר להציג מעקב (Lf) ומדידות קודקוד בתיבת הדו-שיח.
  6. לחשב מיזוגי L0/אם ב- excel (או דומה) ולשמור את התוצאות.
    1. העתק והדבק לשרטוטים פיג'י נוירון J פלט קודקודים להצטיין (או דומה) ולחשב מיזוגי L0 באמצעות המשפט של פיתגורס מן המדידות קודקוד. הנקודה הראשונה והאחרונה בקו מציינים את העמדות של קצות היתר במערכת קואורדינטות 2D.
      הערה: מיזוגי L0/אם [צרור סיבי קולגן end-to-end אורך באמצעות קו ישר (מיזוגי L0) / מלא אורך (Lf)] קרוב 1 מציין של סיבי קולגן כמעט ישר.

7. הדמיה קולגן, אלסטין נפח צפיפות

  1. לשטוף את העורק (קבוע) 1 x ב- PBS כתם זה למשך 15 דקות 1 מיקרומטר אאוזין ב- 1 x PBS בחושך. עבור קבוע העורקים, לבצע שלב זה בטמפרטורת החדר.
    הערה: אאוזין משפר את אלסטין זריחה. אאוזין אכתים מבנים אחרים כגון קולגן, הציטופלסמה תא אם המדגם הושארה הפתרון מכתימים במשך זמן ממושך. אם צביעת מבנים אחרים היא חזקה מדי, להוריד את ריכוז אאוזין מיקרומטר 0.3 או לחזור על הכביסה.
  2. לשטוף את העורק 3 ב PBS 1 x-x
    1. עבור קבוע עורקים: לטעון את העורק עבור הדמיה.
      התראה: הדמיה של כלי שיט שאינו מווסת אינו מאפשר באחזור מידע כמותי גיאומטריים. כאשר מוחלט כמויות נדרשות, אלה תמיד ניתן להגיע על חיים, מווסת את העורקים. נפח-יחסי ניתן להשיג על העורקים שאינם מווסתת באמצעות שיטה זו.
      1. במקום שתי חתיכות של דבק כפול קלטת 1-1.5 ס מ זו מזו על הזכוכית האובייקט. סקוטש כפול הוא עבה כ 100 מיקרומטר. החלת אחד או יותר שכבות של נייר דבק כדי להתאים את הקוטר של העורק שיש לטעון.
      2. מקום 10-20 µL ל- PBS על הזכוכית במרכז הכיכר ולמקם את העורק בתיבה הנפתחת PBS.
        הערה: הירידה צריך להיות כמו קטנים שטוחים ככל האפשר כדי להימנע דוחף את העורק התפקיד בעת התקנת בתגית כיסוי.
      3. מקם את coverslip והקש על סקוטש כפול.
      4. מילוי המאגר בין coverslip לבין האובייקט זכוכית עם 1 x PBS. למלא כל שעה כדי למנוע ייבוש של המדגם.
  3. לקבל תמונה-ערימות של קולגן ואלסטין צפיפות האחסון באמצעות מטרה X 20 עם נה > 1 כדי לכסות כל כך הרבה של הקיר העורקים ככל האפשר אך עדיין עם רזולוציה אופטית טובה (איור דו-ממדי, 2 G ו- 2 H).
    הערה: השתמש מטרה טבילה במים עבור הדמיה של העורקים קבוע תחת coverslip, והשתמש מים טובלים המטרה עבור הדמיה של העורקים החיוניים. אם המטרה אין קולר תיקון לתיקון מכסה עובי, הקפד להתאים את coverslip אל המטרה. רצוי להשתמש z ריווח וגדלים פיקסל אופטימלית. לחשב את אלה באמצעות המחשבון נייקוויסט (שלב 3.3.1.1.). לחלופין, השתמש גודל הפיקסל המזעריות של 300 ננומטר ו- z-מרווח של 1 מיקרומטר. מומלץ לקבל שלוש תמונות לאורכו של העורק כדי לאפשר למשתמש לקבוע אינטרה-assay השתנות.
  4. אלסטין התמונה באמצעות 820 nm עירור אור ולסנן באמצעות פליטת איסוף 30-60 ננומטר bandpass רחב ממורכז-520 ננומטר.
  5. קולגן תמונות באמצעות אור עירור ננומטר 990 כדי למנוע כל עירור של אלסטין וחלבונים אחרים autofluorescent ולאסוף פליטה באמצעות מסנן 10-30 ננומטר bandpass רחב ממורכז-495 ננומטר.
  6. שמור אוספי תמונות של כל ערוץ בנפרד כקובצי TIFF

8. התמונה ניתוח לחילוץ וסיבי קולגן צפיפות האחסון באמצעות Ilastik

  1. להמיר אוספי תמונות TIFF כדי HDF5 באמצעות פיג'י28,35 על-ידי לחיצה על בחר קובץ | שמירה בשם... HDF5.
  2. ליצור שתי תיקיות בקובץ הנתונים על הכונן הקשיח של המחשב, עבור אלסטין, אחד עבור אוספי תמונות קולגן, בהתאמה. העתק אוספי תמונות רלוונטיות אל התיקייה הרלוונטיים.
  3. ליצור שני פרויקטים חדשים של Ilastik התוכנה Ilastik, אחד של אלסטין, אחד עבור קולגן, בהתאמה.
    1. פתח Ilastik | ליצור פרוייקט חדש | סיווג פיקסל | פרוייקט חדש | להוסיף נתונים בחר תמונת התיקיה שנוצר בשלב 8.2.
      הערה: בצע את אשף Ilastik.
  4. לייבא מחסנית אחת תמונה תלת-ממדית כדי לאמן את התוכנה.
    1. בחר את היישומון קלט נתונים | סביבת העבודה המרכזי באזור | הכרטיסיה נתונים גולמיים | הוספת חדש... | להוסיף כתמונות נפרד ובחרו את נתוני התמונה הרצוי
  5. בחר באפשרות ' תכונות רלוונטיות התוכנה.
    1. יישומון בחירת תכונות פתוח | בחר תכונה אשר פותח תיבת דו-שיח חדשה. לפרטים, ראה איור 5A .
  6. להוסיף לפחות שתי תוויות באמצעות לחצן הוסף תווית מתחת יישומון ה הכשרה.
    הערה: בכל תווית יתאים את סוג אובייקט זה צריך להיות מופרדים. בעבודה זאת, תוויות שלושה משמשים אלסטין: אלסטין עצמה, כתמים בהירים (כדי להיות נכלל), ואת הרקע (כדי להיות נכלל).
  7. צייר תוויות על גבי הערימה תמונת raw שימוש במברשת צבע מנוסח כלי ביאור.
    1. בחר בתווית המתאימה: לחץ על הכלי מברשת ולהתחיל ציור.
  8. מנחה Ilastik לנתח של אוסף התמונות ולחפש תכונות דומות על ידי לחיצה על הפעל עדכון חי.
  9. בדוק היטב את המפה חיזוי (איור 5D).
    הערה: התהליך מתמונת raw, מפת חיזוי מלא מוצג באיור5. Ilastik שימושים מחסנית המפה חיזוי כדי לחלק את התמונה על פי איזה לייבל פיקסל יש סבירות גבוהה יותר להיות קשורה (איור 5D).
  10. החל סף.
    1. בחרו קביעת סף יישומוןלבחור בשיטה המתאימה למקרה, תווית קלט, חלקה, סף, גודל סינון פרמטרים, ולבסוף לחץ על החל.
      הערה: זה segregates את חלקי התמונה באופן דומה שכותרתו לעצמים נפרדים. רקמת מאוד מחובר, כמו אלסטין וקולגן אינו צריך להיות הפרדה, לכן, הסף של 0.4 מוחל (ברירת המחדל היא 0.5). איור 5E ו- 5F להדגים התוצאה של החלת סף.
  11. חזור על ההכשרה של Ilastik עד התוצאה הוא משביע רצון (רק אלסטין, בהתאמה קולגן מזוהה עבור הבדיקות המתאימות).
    1. לעתים קרובות מעבר בין האימונים, פילוח (לפעמים גם את קביעת סף) יישומוני בתהליך זה. דוגמא להשפעה של מאמן Ilastik מוצג באיור 6.
  12. אצווה לנתח את נתוני תמונה דומה: לבחור בחירה קלט של חיזוי אצווה ולהוסיף את הקבצים הרלוונטיים.
    הערה: Ilastik פלט הוא אוסף של אוספי תמונות 3D מדומה - סיבית (במסיכות תמונה) עם 0 (אפס) המציין היעדר אלסטין (או קולגן) ו- 1 (אחד) המציין את הנוכחות ב (עומק הסיביות בפועל הוא 8 סיביות).
  13. ודא את התוצאות עבור כל אוסף תמונות על-ידי השוואת באופן חזותי את המסכות תמונות וקבצי ה-raw התמונה.
  14. למטב את המסכה Ilastik (שלבים 8.4-8.9) ולנתח מחדש את כל אוספי תמונות עם תוצאות לא מספקות.
  15. חישוב צפיפות האחסון אלסטין וקולגן מ Ilastik במסיכות תמונה בתוכנת MATLAB
    1. פתח MATLAB.
    2. בחר את התיקיה עם ilastik במסיכות תמונה ב- MATLAB "תיקיה נוכחית" חלון.
    3. להעתיק את התסריט MATLAB 1 קובץ משלים למערכת MATLAB ושמור את הקוד volumeCalculator.m MATLAB תיקיה בכונן הקשיח המחשב.
    4. הזינו מידות פיקסלים וגובה פיקסל בשורות ה-script
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; מיקרון % * מיקרון
      pixelHeight = 0.9; % מיקרון
    5. שמור את קובץ ה-script.
    6. עבור אל חלון הפקודה MATLAB והזן "volumeCalculator (" נתיב-כדי-נתונים ') "כדי לטעון את קובץ ה-script.
    7. לחץ על הזן. כל מסכה התמונה עכשיו סיכם, מוכפל האחסון פיקסל (ידוע) / voxel (הממדים הפיזיים של פיקסל כפול הרזולוציה ציר z). הפלט של MATLAB הוא הנפח הכולל של אלסטין וקולגן בערימה כל תמונה.
  16. שמור את התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myograph לחץ לפי הזמנה עבור הדמיה להשתמש בעבודה זו מוצג באיור1. תשומת לב מיוחדת לעיצוב myograph הוקדשה i) קאמרית עם נפח קטן (2 מ"ל) ואפשרות ii) כדי למקמם את גליליים מקרוב ומקבילי עם תחתית זכוכית (איור 1B). החלק התחתון של החדר מתאים של 50 × 24 מ מ #1.5 זכוכית coverslip (להחלפה). הבקר לחץ נבנה בין בקבוק זכוכית 1 ליטר סטנדרטי של מד לחץ דם (השרוול הוסר). מלכודת myograph עם דרישות הזרימה, מומלץ השימוש בקר לחץ servo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מייצגת את ההצעה שלנו עבור סטנדרטית בשילוב הדמיה ואת הלחץ myography גישה, יקר עבור הערכה בו זמנית של התכונות המכאניות של התנגדות העורקים ושינויים הקשורים ללחץ במבנה של העורקים קיר על טווח הלחץ בין 0 ל- 100 מ מ כספית. הגישה הציג פותחה תוך שימוש בציוד בנוי מותאם אישית, עם זאת, כל myograph לחץ מתאים במיקרוסקופ שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש, כאשר העיצוב של שניהם חסכון מאפשר הדמיה של הקיר עורקי. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם צורה, רוחב, ומרחק עבודה של המטרה, ואת התנאים שבהם יבוצעו ההדמיה. מיקרוסקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה דנית מולקולרית ביו-רפואית במרכז-הפקולטה למדעי הטבע, באוניברסיטת דרום דנמרק, לשימוש של מעבדות ומיקרוסקופים. כריסטופר Rosenstand, אולה מלכיאור הם הכירו לסיוע טכני מעולה עם הלחץ myography, הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כלי מדע עדינים15401-12
כלי מדע עדינים11251-23
ניקוןSMZ800N
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.761028למטרת
Vitrex Medical A/S, הרלב, דנמרק1.63, 2.13, 210 מ"מ
Smiths Medical Intl, UK
Ethiloon 11-0
CustomDK פטנט מספר 201200167, אוניברסיטת דרום דנמרק, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.B3259
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.A7030
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.C5670
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.G7021
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.E3889
Merck Millipore, Hellerup, דנמרק1.00496.9010פוספט חומצי (pH 6.9) תמיסת פורמלדהיד 4% 
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.H3784
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.עמ' 9666
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.עמ' 5655
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.M2643
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.S2002
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.S5886
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.S5761
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.PHR1423
  סיגמא-אולדריץ', Brø ndby, דנמרק.Z370525
  Tocris Bioscience, בריסטול, בריטניה538944
NikonCustom
built Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, דנמרקH7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tü בינגן, גרמניה).ChromaET 460 ננומטר מעבר ארוך
AHF analysentechnik AG (Tü בינגן, גרמניה).Semrock FF01-520/35-25 מסנן
AHF analysentechnik AG (Tü בינגן, גרמניה).כרומה ET402/15X 
Scotch TM
צריך להתאים למטרה המשמשת במיקרוסקופ (#1 או #1.5), לחלופין, הגדר את צווארון הכוונון כך שיתאים לכיסוי
דיסקציה built BrightLine עובי הכיסוי של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001(2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108(2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022(2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285(2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058(2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998(2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760(2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111(2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Collagen Elastin MicroarchitectureResistance Artery MechanicsLabel free Fluorescence MicroscopyTwo photon Excitation ImagingElastin AutofluorescenceCollagen Second Harmonic GenerationFiji Image AnalysisIlastik Software AnalysisPressure induced Vascular ChangesExtracellular Matrix Quantification

מאמרים קשורים