ההליך ניסיוני-immunophenotyping של orthotopic מאתר PDAC homografts שמטרתה יצירת פרופיל חיסונית-microenvironment את הגידול. גידולים הם orthotopically מושתל באמצעות ניתוח. גידולים של 200-600 מ מ3 בגודל היו קוצרים, הפומבית להכין המתלים מתא בודד, שלאחריה יבוא ניתוח רב המערכת החיסונית סמן FACS באמצעות נוגדנים שונים עם התווית fluorescently.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
גידולים מאותו מין (syngeneic) הם סוס עבודה של מחקר פרה חיסונית-אונקולוגיה (i/O) של היום. הגידול microenvironment (טיים), במיוחד את החיסון-מרכיביו, חיוני הפרוגנוזה ותחזית של תוצאות הטיפול, בעיקר אלה של חיסוני. טיים החיסון-רכיבים מורכבים שונים קבוצות משנה של גידולים הסתננות התאים החיסוניים למהירים על ידי צבע רב FACS. אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) נמנית malignances הקטלני חסר אפשרויות טיפול טוב, ובכך קליניות ודחופים צורך רפואי. אחת הסיבות שלה ללא-ההיענות לטיפולים שונים (כימותרפיה-, ממוקד, קלט/פלט) חשוב כבר טיים שלו שופע, המורכב fibroblasts ו לויקוציטים להגן על תאים סרטניים של טיפולים אלה. Orthotopically מושתל PDAC הוא האמין יותר במדויק לשחזר את טיים ממקרי סרטן הלבלב האנושית מאשר קונבנציונאלי מודלים (SC) תת עורית.
גידולים מאותו מין (KPC) הם השתלות של העכבר ספונטנית PDAC שמקורם KPC-עכברים מהונדסים גנטית (KrasG12D / +/ /Pdx1-53- / -PCre) (KPC-GEMM). רקמת הגידול העיקרי הוא חתוך לחלקים קטנים (3~ 2 מ מ), מושתלים subcutaneously (SC) לנמענים syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 שבועות). Homografts היו אז בניתוח orthotopically מושתלים לתוך הלבלב של עכברים C57BL/6 חדשים, יחד עם SC-השרשה, אשר הגיעו הגידול כרכים של 300-1000 מ מ3 ימים 17. רק גידולים של 400 – 600 מ מ3 היו שנקטפו לכל הליך הנתיחה שאושרו וניקה להסיר רקמות הגידול שאינם סמוכים. הם היו הפומבית לכל פרוטוקול באמצעות dissociator של הרקמה לתוך תא בודד המתלים, ואחריו מכתים עם לוחות המיועדים שכותרתו fluorescently נוגדנים עבור סמנים שונים של תאים חיסוניים שונים (הלימפה, מיאלואידית ו NK, בקרי קבוצת מחשבים). הדגימות מוכתם נותחו באמצעות צבע רב FACS כדי לקבוע מספרים של תאים חיסוניים של שושלות שונות, כמו גם את האחוזים היחסיים שלהם בתוך גידולים. הפרופילים המערכת החיסונית של גידולים orthotopic הושוו לאלה של גידולים SC. המידע הראשוני הפגינו גבוהות באופן משמעותי שחדר הפדגוגי/תאמי גידולים של הלבלב, ושל חדירה B-cell גבוה יותר orthotopic מאשר גידולים SC.
מבוא
אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) גורמת כמעט חצי מיליון בהירושימה ברחבי העולם מדי שנה, אחד הרוצחים סרטן ראש 5. ישנם כמה אפשרויות טיפול יעיל, אין immunotherapies שאושרו; לכן, טיפולים חדשים נדרשים נואשות. הם יותר ויותר להכרה סרטן מחלות חיסוניות, כולל PDAC, בנוסף מחלות גנטיות כפי הידוע כיום. גורמים גנטיים אימונולוגי היה סביר לקבוע פרוגנוזה מחלת, כמו גם טיפול תוצאות. גידולים להתחמק מעקב המערכת החיסונית המארח, בסופו של דבר לקדם לגרימת מוות. רבים של תהליכים חיסוניים אלה מתרחשות בתוך microenvironment הגידול (טיים)1,2,3,4 איפה סוגים שונים של תאים חיס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הפרוטוקולים, amendment(s) או הליכים הכוללים את הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על-ידי הכתר Bioscience מוסדיים בעלי חיים והטיפול הוועדה להשתמש (IACUC) לפני התנהלות של מחקרים. הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים בדרך כלל תיעשה בהתאם להנחיות בינלאומיות AAALAC (האגודה הערכה וטיפול הסמכה של מעבדה חיה) כפי שדווח במדריך עבור טיפול ו להשתמש של חיות מעבדה, המחקר הלאומי המועצה (2011). כל ההליכים ניסויים בבעלי חיים יהיה בתנאים סטריליים במתקני SPF (ספציפי פתוגן-חופשית), שנערכו בהתאמה קפדנית עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מוסדות ממשלתיים שונים (למשל המכונים הלאומיים לבריאות). הפרוטוקול יהיה צורך באישור ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים במוסד מתקן (ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Orthotopic השרשה של PDAC הביא הגידול מהיר דומה כי ראיתי להשתלה SC. אחרי השברים הגידול התורם שהיו מושתלים לתוך עכברים הנמען, הן subcutaneously orthotopically לפי הפרוטוקולים שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, גידולים מאותו מין KPC מושתל הפגינו דומה צמיחה מהירה כפי שמוצג איור 1A . גידולים מאותו מין KPC שנקטפו בנקודות זמן שונות מוצגות באיור איור 1B , נציג H & E תמונות מוצגות באיור 1C. הנתונים שלנו הראו צמיחה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות מחקרים באמצעות גידולים SC מתנהלים יותר בקלות, orthotopically מושתל גידולים מודלים עלולה להיות רלוונטיים יותר ללימודי פרמקולוגיה פרה (במיוחד חקירות קלט/פלט) כדי לספק translatability משופר. דו ח זה מטרתו לעזור לקוראים/הקהל מעוניין להיות מסוגל לבצע את ההליכים טכני יכול לשמש במחקר שלהם בהתאמה. הפרוטוקולים שלנו להפגין את orthotopic השרשה של PDAC עלולה לגרום גדילת הגידול יעיל, הדומה SC השרשה. התצפיות שלנו נראה גם להציע את הנוכחות של פרופילים חיסוניים שונים של TMEs מ השתלות שונות. האתגרים הגדולים להסתגל orthotopic, בהשווא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים הם עובדים במשרה מלאה הנוכחי של הכתר Bioscience, inc.
תודות
המחברים מודים ד ר ג'ודי בארבו - קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד, ותודה ראלף מנואל לעיצוב יצירות אמנות. המחברים רוצה גם להודות את הכתר Bioscience אונקולוגיה חיסונית-אונקולוגיה סמן צוות וצוות אונקולוגיה Vivo ב , על מאמציהם טכני נהדר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכונת הרדמה | \ | SAS3119 | \ |
| טרוקר 20 | \ | \2 | מ"מ |
| צלחת פטרי | \ | 20 מ"מ | |
| 100x אנטיביוטיקה ואנטי-פטרייה | \ | \ | \ |
| ספוגיות יודופור | \ | רכישה יומית בבית מרקחת | |
| ספוגיות אלכוהול | \ | \ | רכישה |
| יומית בבית מרקחתחנקן נוזלי | אוויר כימי | \ | \ |
| קולט אדים בטיחות ביולוגית | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS מכונת LSR X-20 | BD | LSR פורטסה | \ |
| נוגדנים | BD | \ | |
| Trevigen MD או BD מטריג'ל מטריצת ממברנה מרתף ריכוז גבוה | BD | 354248 | \ |
| FACS מאגרים | BD | 554656 | מאגר טחינה |
| מאגר מכתים מבריק | BD | 563794 | \ |
| עכבר BD Fc בלוק | BD | 553142 | \ |
| מסנני תאים | BD-Falcon | 352350 | 70 ומיקרו; |
| m צינור דם שגרתי | BD-Vacutainer | 365974 | 2 מ"ל |
| קלוזה | בקמן | לעומת 1.5 | |
| צלחות 6 בארות | קורנינג | 3516 | |
| Foxp3 ערכת תיקון/סלסול | ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| צנטריפוגה | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| FlowJo תוכנה | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 מ"ל |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| אזמל חד פעמי, סטרילי | Jin zhong | J12100 | 11# |
| ידית סכין | Jin zhong | J11010 | |
| מספריים ופינצטה לעיניים | Jin zhong | Y00030 | מספריים לעיניים 10 ס"מ |
| מספריים ופינצטה | לעיניים Jin zhong | JD1060 | פינצטה לעיניים 10 ס"מ עם שיניים |
| מיכל חנקן נוזלי נייד | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic איזון | מטר טולדו | AL204 | 0-100 גרם |
| Miltenyi C-tubes Miltenyi | 130-096-334 | \ | |
| Miltenyi MACS עדין עם בלוקים לחימום | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| ערכת דיסוציאציה של גידול | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| מונה תאים | Nexcelom | Cellometer | Cellometer צינור |
| שימור הקפאה | Nunc | 375418 | 1.8 מ"ל |
| Cultrex ריכוז חלבון גבוה (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| מזרקים | שנחאי MIWA התעשייה הרפואית | \ | 1-5 מ"ל |
| תוכנת | Studylog Studylog | \ | תוכנה |
| Studylog-Balance ותמיכה ב- USB | OHAUS | SE601F | איזון ותמיכה |
| ב- USB Studylog-Data קו של קליפרים ורניר | סילבק | 926.6721 | קו נתונים של קליפרים ורניר |
| קליפר | סילבאק | 910.1502.10 | סילבאק S-Cal פרו |
| צינורות צנטריפוגה מעוקרים | תרמו | 339653 | 50 מ"ל |
| צינורות צנטריפוגה מעוקרים | תרמו | 339651 | 15 מ"ל |
| דלי קרח | תרמו | KLCS-288 | 4 ° C |
| דלי קרח | תרמו | PLF-276-20 | ° |
| C דלי קרח | תרמו | DW-862626-80 | ° C |
| RNAlater | תרמו | am7021 | \ |
מקורות
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
