מאמר שיטה
אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.
Inflammasomes הם פלטפורמות איתות המערכת החיסונית מולדת אשר נדרשים עבור הפקד מוצלחת של אורגניזמים פתוגניים רבים, אלא גם לקדם דלקתיות ומחלות autoinflammatory. Inflammasomes מופעלים על ידי רצפטורים זיהוי דפוס cytosolic, כולל בני משפחת קולטן (NLR) כמו במנוד ראש. רצפטורים אלו oligomerize על הגילוי של גירויים מיקרוביאלי או נזק-הקשורים. גיוס עוקבות של החלבון מתאם ASC טפסים מורכבים, inflammasome ברמה המיקרוסקופית הגלויים שמפעיל קספאז-1 דרך הפעלה אוטומטית קרבה-induced. לאחר ההפעלה, קספאז-1 cleaves pro-IL-1β ו- pro-IL-18, שמוביל ההפעלה ואת הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים אלה. קספאז-1 שמתווכת גם הצורה דלקתיות של מוות של תאים הנקרא pyroptosis, אשר כולל האובדן של קרום התא של תקינות פירוק. קספאז-1 cleaves gasdermin D, שחרור השבר N-מסוף המהווה קרום פלזמה נקבוביות, שמוביל osmotic פירוק.
חוץ גופית בתוך, ההפעלה של קספאז-1 יכול להיקבע על ידי תיוג מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם החללית קספאז-1 פעילות FAM-YVAD-FMK ועל ידי תיוג התאים עם נוגדנים נגד החלבון מתאם ASC. טכניקה זו מאפשרת זיהוי inflammasome גיבוש והפעלה קספאז-1 בתאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ זריחה. מוות של תאים Pyroptotic ניתן להבחין באמצעות מדידת שחרורו של לקטט דהידרוגנאז cytosolic לתוך האמצעי. ההליך זה פשוט, חסכוני, שבוצעו בתבנית צלחת 96-ובכן, ומאפשר הסתגלות להקרנה. כתב יד זה, אנו מראים כי הפעלת inflammasome NLRP3 על ידי nigericin מוביל לוקליזציה שיתוף של מתאם חלבונים ASC ו קספאז פעיל-1, המוביל pyroptosis.
דלקת בתיווך Inflammasome הוא מרכיב קריטי של ההגנה נגד אורגניזמים פתוגניים1, אך גם ביסוד האטיולוגיה של מחלות רבות2. התגובה דלקתית למגוון רחב של זיהומים המופעלת על-ידי זיהוי cytosolic של פתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) או נזקים הקשורים דפוסי מולקולרית (DAMPs). דפוס זיהוי קולטנים (PRR), כולל בני משפחת במנוד ראש דמוי קולטן (NLR), oligomerize על הגילוי של אלה PAMPs ו- DAMPs. פעולה זו מפעילה את היווצרות קומפלקס חלבונים מרובה כינה את inflammasome, אשר מכיל את PRR, החלבון מתאם אפופטוזיס-הקשורים כמו גרגר חלבון המכיל תחום גיוס קספאז C-מסוף (כרטיס) (ASC), פרו-בצורת קספאז-1-3,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל ההליכים בבעלי חיים היו שאושרו, שנערך תחת אוניברסיטת וושינגטון אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש בהנחיות.
1. הקציר של מח העצם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כדי לזהות קספאז-1 הפעלת בעקבות החשיפה של nigericin, התאים עובדו כמתואר בסעיף פרוטוקול. שילבנו בין FAM-YVAD-FMK והן ASC נוגדן תיוג על מנת להראות כי ASC ו קספאז פעיל-1 שיתוף לשפה בעקבות הפעלת בתיווך NLRP3 inflammasome. איור 1A מראה פראי סוג מקרופאגים נחשפים 5 μM nigericin יש היווצרות המוקד ASC באזור perinuclear. מוקדים אלה מכילים גם קספאז פעיל-1 כפי שנראה לוקליזציה שיתוף של שמ ת עם המשפחה-YVAD-FMK. התאים הם חיוביים עבור קספאז פעיל-1 יש גרעיני התעבות מראה כי תאי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כתב יד זה, הוצגו שתי שיטות לבחון inflammasome ההפעלה ואת התוצאה של הפעלת קספאז-1 בעקבות גירוי NLRP3 ב מקרופאגים מאתר הנגזרות מח עצם. הטכניקה הראשונה מאפשרת החוקר לקבוע את רמת ההפעלה קספאז-1 על בסיס הסלולר באמצעות הכתבת פלורסנט FAM-YVAD-FMK. הכתב הוא מאוד ספציפי מחייב את המשפחה קספאז-1 של אנזימים, כפי שניתן לראות בגלל היעדר מכתים ב מקרופאגים לקוי קספאז-1/11. ירידה לפרטים הוצג גם על ידי לה-רוק ואח. בכתב היד שלהם המתאר את התפקיד של החלבון Yersinia YopM על ההפעלה קספאז-1. בכתב היד שלהם, הם מראים כי FAM-YVAD.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף
מיקרוסקופ כל נעשה במרכז וו מ קק מיקרוסקופ עם תמיכה של נתנאל פיטרס, עם תמיכה של NIH פרס S10OD016240. S.L.F. נתמך על ידי NIH K08AI119142 ו- R21AI130281. אנו מודים ד ר ריצ'רד קיבל ד ר קוקסון בראד עבור עכברים לקוי קספאז-1/11, ואת ד ר קוקסון בראד לשיתוף מעבדה מתקנים וציוד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | לגידול תאי L929 |
| שיבוט NCRC 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| ערכת קיבוע/פרמיביליזציה | BD Biosciences | 554714 | כולל תמיסת קיבוע וחדירה, ומאגר כביסה. ניסוחים קנייניים. מכיל 4.2% פורמלדהיד |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית | Fisher Scientific | PR-G1780 | כולל תערובת מצע ומאגר בדיקה; ניסוחים קנייניים. תמיסת העצירה היא 1 M חומצה אצטית |
| FAM-YVAD-FMK | טכנולוגיות אימונוציטוכימיה | 98 | |
| DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, ללא פנול | אדום Invitrogen | 31053028 | |
| PBS של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום | Invitrogen | 14190144 | |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, ממוצא ארה"ב | Invitrogen | 26140079 | חום מושבת ב-55 מעלות; C למשך 50 דקות |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | ניסוח קנייני. מדיום הרכבה מרפא. מתקשה לאינדקס עקשן של 1.46 |
| ALEXA555 נגד עכברים עיזים | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (טהור במיוחד) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 21051024 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 יודיד | Invitrogen | T3605 | פלואורסצנטי אדום רחוק כתם חומצת גרעין |
| C57BL/6J עכבר | מעבדת ג'קסון | 000664 | |
| קספאז-1/11-/- עכבר | מעבדת ג'קסון | 016621 | |
| Leica SP8X מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | ||
| Ultrapure LPS מסלמונלה מינסוטה R595 (Re) | רשימה ביולוגית | 434 | |
| שיבוט אנטי-ASC 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| בטא-מרקפטו-אתנול | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 קורא צלחות | מכשירים מולקולריים | 5000414 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה