הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 במרץ 2018

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

במאמר זה

סיכום

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

תקציר

המעגל retinotectal של ראשן צפרדע רפואית מורכבת של תאי גנגליון (RGCs) בעיניים איזו תבנית synapses ישירות על גבי נוירונים בריכוזים tectum סיב אופטי, הוא מודל פופולרי ללמוד את המעגלים העצביים איך להתחבר בעצמם. היכולת לבצע כל תא הקלטות מלחציים תיקון הנוירונים tectal ואליהן הרשומה מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות, גם אין ויוו או באמצעות הכנה כל המוח, יצר גוף גדול של נתונים ברזולוציה גבוהה על המנגנונים שבבסיס נורמלי , חריג, מעגל היווצרות ואת הפונקציה. כאן נתאר כיצד לבצע ויוו ההכנה, הכנת כל המוח המקורי, ופיתח יותר לאחרונה המוח אופקי פרוסה לקראת קבלת התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות של נוירונים tectal. בכל אופן ההכנה יתרונות ייחודיים ניסיוני. הכנת ויוו מאפשר ההקלטה של התגובה הישירה של הנוירונים tectal לגירויים חזותיים מוקרנת העין. הכנת כל המוח מאפשר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר להיות מופעל בצורה מאוד מבוקרת, הכנת פרוסה אופקי המוח מאפשר הקלטה של-פני כל שכבות של tectum.

מבוא

המעגל retinotectal הוא המרכיב העיקרי של מערכת הראייה דו-חיים. הוא מורכב RGCs בעיניים, אשר פרויקט אקסונים שלהם כדי tectum אופטיים שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים tectal postsynaptic. המעגל retinotectal ראשן צפרדע רפואית הוא מודל התפתחותי פופולרי ללמוד מעגלים עצביים היווצרות ותפקוד. ישנן תכונות רבות של מעגל retinotectal של ראשן הזה להפוך אותו דגם ניסיוני עוצמה1,2,3. תכונה אחת הגדולות, המוקד של מאמר זה, היא היכולת לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, בתוך vivo או באמצעות הכנה כל המוח. עם מתקן קידוח אלקטרופיזיולוגיה לבוש עם מגבר התומך מתח, זרם-להדק מצבי הקלטה, הקלטות מלחציים תיקון כל התא לאפשר אלקטרופיזיולוגיה של נוירון להיות מאופיין ברזולוציה גבוהה. כתוצאה מכך, התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal ברחבי השלבים המפתח של היווצרות מעגל retinotectal סיפקו הבנה מפורט ומקיף של ההתפתחות ואת הפלסטיות של מהותי4,5 , 6 , 7 וסינפטית8,9,10,11 נכסים. שילוב כל התא תיקון קלאמפ נוירון tectal הקלטות, היכולת לבטא את הגנים או morpholinos עניין הנוירונים האלה12, שיטה להערכת התנהגות מודרכים חזותי באמצעות בדיקה הימנעות חזותי הוקמה13 מקדמת זיהוי של קישורים בין מולקולות, מעגל פונקציה התנהגות.

חשוב לציין כי הסוג ברזולוציה גבוהה נתונים שנרכשה מן התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות אינה אפשרית באמצעות גישות הדמיה חדשות יותר כמו מחוון סידן גנטית GCaMP6, כי למרות באמצעות מחווני סידן מתירה ההדמיה של סידן dynamics על פני אוכלוסיות גדולות של נוירונים בו זמנית, לא ישיר או דרך ברור כי הפרמטרים חשמלי מסוים יכולה להיות מושגת על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית דלתא, somata, אין שום דרך מתח מלחציים נוירון כדי למדוד זרם-מתח מערכות יחסים. ברור אלה שתי גישות שונות, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה, בעלי עוצמות שאינם חופפים, ליצור סוגים שונים של נתונים. לפיכך, הגישה הטובה ביותר תלויה השאלה ניסיוני ספציפית נותרים ללא מענה.

כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו לרכישת כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectum אופטיים ראשן, שימוש ויוו הכנה, הכנה כל המוח, ושינית וחדש יותר הכנה כל המוח שפותחה במעבדתנו14 . במקטע תוצאות נציג, נדגים את היתרונות ניסיוני של כל הכנה, סוגים שונים של נתונים שניתן להשיג. הגבולות ואת החוזק של תכשירים שונים, כמו גם עצות לפתרון בעיות, כלולים במקטע דיון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ויומינג. כל ההליכים, כולל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, מתבצעות בטמפרטורת החדר, כ 23 ° C. כל השיטות המתוארות כאן ממוטבים עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15).

1. הכנה in Vivo

  1. עזים ומתנגד את הראשן.
    1. מקם את הראשן בצלוחית קטנה המכילה הפתרון של שטיינברג עם 0.01% MS-222 במשך כ 5 דקות.
      הערה: MS-222 aka "Tricaine" הוא דגים, דו-חיים הרדמה נפוץ. הראשנים מגודלים בפתרון של שטיינברג במ מ: 0.067 אשלגן כלורי, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES.
    2. ודא הראשן עמוקות מרדימים (לא מגיב ולא שחייה) לפני שתמשיך לשלב 2.
  2. אבטח את ראשן anesthetized על בלוק המשוקע סיליקון על הרצפה של המנה לנתח/הקלטה.
    1. השתמש פיפטה של העברה חד פעמיות כדי לעבור הראשן anaesthetized תבשיל דיסקציה/הקלטה שיש פתרון הקלטה חיצוני (115 מ מ של NaCl, 2 מ מ של אשלגן כלורי, 3 מ מ של CaCl2, 3 מ מ של MgCl2, 5 מ"מ של HEPES, 1 מ מ גלוקוז; להתאים את ה-pH באמצעות 7.25 10 N של NaOH, mOsm osmolarity 255).
      1. כדי למזער את השריר ספונטנית מפרכס, להוסיף חוסם קולטן של אצטילכולין, tubocurarine (100 מיקרומטר) לפתרון חיצוני. (בדרך כלל, הדבר נעשה באמצעות פיפטה µL 200 להוסיף 100 µL מניה tubocurarine 10 מ מ 10 מ"ל של פתרון חיצוני).
    2. באמצעות סיכות חרקים, אבטח את ראשן, בצידו הגבי, לבלוק המשוקע סיליקון אלסטומר (כגון Sylgard 184, ראה טבלה חומרים לפרטים), אשר היה דבוק הרצפה מאכל ויבתר.
      הערה: המיקום של הפינים הוא קריטי: למקם אותם משני צידי המוח, מספיק סימטרית כדי להימנע משפדים האקסונים מהרשות לשיקום האסיר מביא הפרויקט מהעין ו להזין את המוח רק והשתרשה עמוק בלבה tectum אופטיים (איור 1א').
  3. פילה המוח לאורך הקו האמצעי.
    1. תצוגה ברורה של המוח, להסיר את העור המכסים את המוח על ידי ביצוע חתך שטחי לאורך הקו האמצעי באמצעות מחט סטרילית 25-G.
    2. פילה המוח לאורך קו האמצע באותו הציר על ידי החדרת המחט לתוך הצינור העצבי ומושך בעדינות כלפי מעלה (dorsally) כגון החלק הגבי של הצינור נקיה שנחתך (קטועה) תוך השארת הצלחת קומה שלמה (איור 1B).
      הערה: חשוב במשטח הרצפה של הצינור העצבי להישאר שלם כי הקלט החושי מביא להזין את tectum באמצעות לוח קומה.
  4. הסר את הקרום חדרית שקוף שמכסה את הנוירונים tectal.
    1. להעביר את המנה הקלטת התכנית אלקטרופיזיולוגיה ולהשתמש טיפ פיפטה זכוכית שבורה להסרת קרום חדרית המכסים את הגופות התא של נוירון tectal. שבור את הקצה על-ידי גרירתו בקלילות על פני קידמית המשימה העדינה.
    2. להבריג את פיפטה המחזיק פיפטה, להוריד אותו למטה tectum סיב אופטי דרך micromanipulator.
    3. השתמש את פיפטה שבור לקלף קרום חדרית הרחק tectum.
      הערה: אין צורך להסיר את הקרום tectum כולו; חלון קטן יספיק ומספקים גישה שפע של נוירונים.
  5. להשיג כל התא הקלטות מלחציים תיקון.
    הערה: הגישה מרגע זה והלאה היא דומה בביצוע כל התא תיקון קלאמפ הקלטות מ פרוסות המוח העכבר כפי שמתואר שגב, et al. 16 (איור 1C).
  6. שיא התגובות נוירון tectal כל השדה הבזק של אור מוקרנת הרשתית.
    1. להקרין כל השדה הבזק של אור על הרשתית, מקום של סיבים אופטיים סמוך לעין של הראשן. בקצה השני של סיבים אופטיים הוא LED בקנה אחד עם הנגד המשתנה המאפשר בוהק האור להיות נשלט. מפעילים את ה-LED, פלט דיגיטלי של המגבר. בדרך זו, כל השדה הבזקי משתנות בין עוצמות האור יכול להיות מוקלט (איור 4א).

2. כל המוח הכנה

  1. בצע שלבים 1.1-1.3.
    הערה: יש צורך tubocurarine בפתרון חיצוני עבור הכנת.
  2. לבודד את המוח.
    1. שימוש במחט 25-G לנתק את hindbrain (איור 2א).
    2. כדי לבודד את כל המוח של הראשן, בעדינות להפעיל את המחט מתחת המוח, כיוון סימטרית-על-rostral לנתק את כל רקמת חיבור לרוחב ו הגחון של סיבי עצב.
  3. לאבטח למוח בלוק של אלסטומר סיליקון.
    1. שוחרר לחלוטין, לאחר לאבטח למוח בלוק של אלסטומר סיליקון על-ידי הצבת סיכה אחת דרך אחת הנורות הריח וסיכה עוד דרך hindbrain (איור 2B). זוהי התצורה האופטימלית עבור הקלטה של נוירונים tectal.
  4. להעביר את המנה הכוללת הכנת מוצמדים כל המוח מהטווח ויבתר התכנית אלקטרופיזיולוגיה. הסר את הקרום חדרית באמצעות פיפטה זכוכית שבורה כפי שמתואר בשלב 1.4.
  5. במקום של הפרעה דו קוטבית אלקטרודה מגרה על הצנטר (איפה האקסון נרחבים מכל עין קרוס-המוח האמצעי) ישירות להפעיל את האקסונים מהרשות לשיקום האסיר.
    1. המקום האלקטרודה גירוי דו קוטבית rostral, ובצמוד כמעט, החדר האמצעי גדול. תצלובת ממוקם מיד rostral את החדר האמצעי גדול (איור 2B).
      1. בעדינות נמוך יותר האלקטרודה מגרה על גבי הצנטר כך שקע קטן נוצר בתוך הרקמה. האלקטרודה דו קוטבית מונעת על ידי ממריץ את הדופק אשר מאפשר את עוצמת גירוי בדיוק להיות תחת פיקוח.
  6. ביצוע ההקלטה מלחציים תיקון התא כולו (איור 2C) כפי שתואר על ידי שגב, et al. 16

3. אופקי המוח פרוסה הכנה

  1. בצע שלבים 2.1 ל 2.3.
  2. השתמש סכין גילוח לסלק הרביעי הכי לרוחב (אילו ויוו המתאים ביותר הגבי הרביעי) של צד אחד של אחד tectum סיב אופטי. החתך הזה מתבצע במקביל למישור rostral-סימטרית כפי שמוצג באיור 3א.
  3. מחדש להצמיד את המוח לצד אלסטומר סיליקון עם פרוס צד פונה כלפי מעלה (כך somata ואת מורכב ניתן לגשת ישירות עבור הקלטה) והמשטח חדרית של המוח פונה לרחוב elastomer סיליקון (איור 3 B) (כך אלקטרודה דו-קוטבי יכול להיות ממוקם על הצנטר).
  4. לבצע את כל התא תיקון קלאמפ או המקומי הגישו הקלטה פוטנציאליים (איור 3C) כפי שתואר על ידי שגב, et al. 16

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להקליט אור-עורר תגובות כל השדה הבזק של אור מוקרן על הרשתית בזמן התגובה מתועד של נוירונים בודדים tectal (איור 4א). פרוטוקול מסוים זה תוכנן כדי למדוד את התגובה של הנוירון אל האור מגרה ("על" תגובה), ואז ביטול 15 s מאוחר יותר כדי למדוד את "את התגובה." הנוירונים tectal בדרך כלל מוצג חזקים תגובות לסירוגין (מצב קלאמפ שמוצג כאן מתח שהוקלט ב, עם הנוירון כשכרטיס ל- 60mV כדי למדוד זרם סינפטית (איור 4B))...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כל השיטות המתוארות בעבודה זו אופטימיזציה עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15). ובבמה 42, הראשנים הם גדול מספיק ולא מספיק מפותח כך ניתן למקם את הסיכות חרקים משני צידי המוח להקלטות ויוו , שבצעתי את הקרע כל המוח. בשלבים מוקדמים יותר, כאשר הראשנים הם בעצם דו מימדי (קרי, שטוח), הגישות המתוארים כאן אינם מיטביים.

בשל הקלות שבה הנוירונים tectal ניתן לגשת להקליט ולצפות בתצורת התא כולו, היה מעגל זה מודל חמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

נתמך על ידי המענק-NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סטמי סטריאו 508זייס495009-0006-000 ניתוח מיקרוסקופ
MS-222 "Tricane"FinquelARF5Gדו-חיים הרדמה כללית
נתרן כלורי (NaCl)Fisher ScientificS271-3משמש להכנת התמיסה של שטיינברג והתמיסה החיצונית
אשלגן כלורי (KCl)Fisher ScientificP217-500משמש להכנת התמיסה של שטיינברג והתמיסה החיצונית
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGמשמש להכנת התמיסה של שטיינברג והתמיסה החיצונית
סידן חנקתי טטרהיראט (Ca(NO3)• 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500Gמשמש להכנת התמיסה של Stienberg   
מגנזיום גופרתי (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04משמש להכנת תמיסת שטיינברג
סידן כלוריד (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500Gמשמש להכנת תמיסת הקלטה חיצונית
מגנזיום כלוריד (MgCl2)J.T. Baker2444-01משמש להכנת תמיסת הקלטה חיצונית
D-גלוקוז נטול מיםMallinckrodt כימיקלים6066-04משמש להכנת תמיסת הקלטה חיצונית
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379אנטגוניסט קולטן אצטילכולין ניקוטיני
סיכות חרקיםFine Science Tools26002-10סיכות נירוסטה בקוטר 0.1 מ"מ
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning761028ערכת מונומר וחומר ריפוי בשקילה מראש
צלחת פטרי פוליסטירן סטרילית - 60x15 מ"מפישר סיינטיפיקAS4052צלחות פטרי קטנות
מחט PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0.5 מ"מ X 16 מ"מ)305122מחטי מזרק
1 מ"ל קצה החלקה מזרק טוברקולין BD309659מזרקים חד פעמיים, סטריליים
בורוסיליקט פיפטה זכוכיתסאטר מכשיר SUTTERBF150-86-10HPנמשך למפרט הרצוי באמצעות מכונת משיכת פיפטה
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter InstrumentsP-97מייצר מיקרופיפטות להקלטת אלקטרופיזיולוגיה מגבוני
Kimwipes KimtechKimberly-Clark34120עדין מגבים נטולי מוך משימה
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7Bהתקנים מולקולריים1-CV-7Bמהדק זרם ומהדק מתח
MP-285 מניפולטור ממונע עם בקר שולחןסאטרMP-285/Tבקרת ראש על מתקן אלקטרופיזיולוגיה
LED מצמד סיבים (ירוק)ThorlabsM530F2כבל סיבים אופטיים בשילוב עם LED ירוק
אלקטרודה דו-קוטבית של אשכול (25µ קוטר מ')FHC30207אלקטרודה מגרה דו-קוטבית
ISO-Flex סטימולטורA.M.P.I. (ישראל) צור קשר עם יצרןמבודד גירוי גמיש
Axon Instruments 700B Multipatch Ampliifierהתקנים מולקולריים2500-0157מגבר להקלטת מהדק מתח וזרם 
Digidata 1322A דיגיטייזרמכשירים מולקולריים2500-135מערכת רכישת נתונים לרישום אלקטרופיזיולוגיה
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 מיקרוסקופ לאלקטרופיזיולוגיה
שולחן מעבדה מיקרו-gTMC63-533שולחן אוויר למיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה
Inspiron 620 מחשב שולחני אישי עם Windows 7 64 סיביותDellD06D001מחשב הפועל תוכנת אלקטרופיזיולוגיה
c2400 מצלמת CCDHamamatsu70826-5מצלמת מכשיר מצמד טעינה להדמיית אלקטרופיזיולוגיה
O'Clock סופר פלטינה סכיני גילוח אל חלדג'ילטCMM01049סכיני גילוח אל חלד מצופים פלטינום
צנרת העברה פישרסיינטיפיק13-711-7Mצינורות העברת פוליאתילן חד פעמיים
BD מכשיר 7

מקורות

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In VivoOptic Tectum
ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.