הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

16.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57467

⸱

13 באפריל 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 2Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטהר exosomes פלזמה והן בסרום בטהרה שיתוף מופחתת של חלבוני דם בלתי-exosomal. פרוטוקול ממוטבת כולל אולטראפילטרציה פרוטאז לטיפול, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. טיהור משופרת של exosomes הטבות במורד הזרם ניתוחים, לרבות כימות מדויקת יותר של שלפוחית ואפיון פרוטיאומיה מבנית.

תקציר

Exosomes, סוג של nanovesicle שוחררו כל סוגי תאים, יכול להיות מבודד בכל נוזלי. התכנים של exosomes, כולל חלבונים RNAs, הן ייחודיות על התאים שמהם הם נגזרים, יכול לשמש אינדיקטורים של המחלה. מספר פרוטוקולים העשרה נפוצות, כולל ultracentrifugation, תשואות exosomes עמוסות חלבון מסיס מזהמים. באופן ספציפי, מצאנו כי החלבונים הנפוץ ביותר בתוך דם לעיתים קרובות לטהר בשיתוף עם exosomes, יכולים לבלבל מחקרים פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, שסיכל את הזיהוי של שפע נמוך סמן מועמדים. חשש נוסף הוא irreproducibility של exosome כמת חלבון עקב ייצוג לא עקבי של רמות החלבון הלא-exosomal. פרוטוקול מפורט כאן פותחה כדי להסיר חלבונים שאינם exosomal לטהר במשותף יחד עם exosomes, הוספת הקשיחות לתהליך טיהור exosome. חמש שיטות הושוו באמצעות לזווג פלזמה וסרום מתורמים חמש. ניתוח באמצעות ננו-חלקיק מעקב ניתוח ואת וזמינותו חלבון חומצה bicinchoninic מיקרו גילה כי פרוטוקול משולב ניצול כרומטוגרפיה הדרה אולטראפילטרציה וגודל הניב את שלפוחית אופטימלית העשרה והסרת חלבונים מסיסים. סופג המערבי שימש כדי לאמת החלבונים בדם שופע הצפוי, כולל אלבומין, apolipoproteins, היו דלה.

מבוא

Exosomes הם nanovesicles (החל בגודל של 30 ננומטר ל-150 ננומטר) שפורסמו על ידי כמעט כל התאים בגוף האדם כדי להקל על התקשורת לתא מעבד1,2. מעניין, ההרכב של exosomes משתנה בהתאם התאים של המקור, כמו גם מצב בריאותו של הפרט3,4,5. בנוסף, exosomes ניתן לאחזר מ נוזלים ביולוגיים כמה כגון: רוק, שתן, דם2. בשל תכונות אלה, exosomes נחשבים מקור טוב של סמנים למחלת. למרבה הצער, יש שיטה סטנדרטית עבור בידודו של exosomes. כמה מעבדות שקול צנטריפוגה רב-שלבי, בצעד מהיר הסופי ב g 100,000 x באמצעות מעברי צבע צפיפות כמו השיטה תקן הזהב exosome בידוד. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-ultracentrifugation הזה גורם צבירה של exosomes עם חלבונים מסיסים ו exosomes אחרים, בנוסף כדי להשפיע את exosome שלמות, אשר שניהם עשויים ה"בלתי יישומי הזרם6,7 . שיטות נפוצות אחרות של בידוד exosome כוללים, אך אינם מוגבלים: משקעים על ידי מסחרי פוליאתילן גליקול (PEG) מבוסס ריאגנטים אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות). ריאגנטים מסחרי באמצעות פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG) להעשיר exosomes על ידי גורם להם לזרז ויוצרים גלולה. מגבלות שימוש הפולימר הזה הם זיהום, עם פולימר פג שיורית, שפע של חלבונים מסיסים שאינם-exosomal במוצר הסופי. אולטראפילטרציה מנצל צנטריפוגה לטהר ולרכז שלפוחית באמצעות קרום תאית; exosomes נשמרים מעל המסנן, בזמן זיהומים קטנים וחלבונים אחרים עוברים הממברנה7,8. בדיוק כמו שיטות אחרות, אולטראפילטרציה צנטריפוגלי בעל קיבולת מוגבלת לטהר exosomes עקב השמירה של רמות גבוהות של חלבונים שאינם exosomal, כולל חלבון קומפלקסים אגרגטים. לבסוף, טיהור שניה משתמש שרף נקבובי כדי להפריד בין מולקולות לפי גודל. שניה הראתה תוצאות מבטיחות, להתגבר על רוב הבעיות מנוסה עם שיטות אחרות על-ידי לכידה הרוב המכריע של חלבונים מזהם של שמירה על שלמות exosomal, מאז בידוד מבוסס על כוח המשיכה או מערכות בלחץ נמוך7, 9. עם זאת, הבידוד שותף גדול יותר חלבון lipoproteins אגרגטים10 במהלך שניה משפיעה על הטוהר של הכנת exosome הסופי. בעוד כמה שיטות נבדקו לטיהור exosome supernatants התרבות תאים, פלזמה7, או רק פלזמה9,11, אין מידע על הביצועים של שיטות ישירות השוואת הדם פלזמה, סרום של אותו אדם.

כאן, אנו מתמקדים הטיהור של דם exosomes על-ידי השוואת מגוון של זרימות עבודה כדי לקבוע אם שלפוחית העשרה טכניקות לתרגום בין פלזמה לסרום. ננו-חלקיק מעקב אחר ניתוח תספיג שימשו כדי לכמת את ההבדלים בהרכב exosome, טוהר לריכוז החלבון במוצרי הקצה. שיטת הסופי, מפורט של פרוטוקול זה, מגביר את המספרים שלפוחית ומפחית רמות החלבון הלא-exosomal. חשוב, הפגינו ירידה דרסטית של חלבונים גורם משותף נפוץ כולל אלבומין, apolipoproteins. שפע גבוהה אלה שני חלבונים בדם ואת התדירות שבה הם שיתוף לטהר עם exosomes גורם חוסר עקביות בין דגימות "מזוכך", הטיית הניתוחים במורד הזרם. פרוטוקול זה כולל את השימוש שרף שניה זמינים מסחרית; השרף מורכב חרוזים נקבובי שבו חלבונים קטנים יותר 700 kDa באפשרותך להזין את החרוזים. פעם אחת בפנים, החלבונים נשמרות על-ידי ליגנד octylamine. Eluate מורכב exosomes של מולקולות גדולות יותר מ 700 kDa12. בנוסף, על מנת להפחית את אגרגטים חלבון ואת apolipoproteins אשר להתחמק חרוז השמנה, אנו כוללים צעד עיכול פרוטאז בזרימת העבודה. כיום, אין שום טכניקה יחיד מסוגל למקסם את התשואה exosome תוך צמצום שיתוף טיהור החלבונים הלא-exosomal. מחקר זה מראה כי פרוטוקול טיהור המשלב רעלני עיכול של פרוטאז עם שחזור מרובים ושיטות טיהור יכול לשמש כדי להגדיל את התשואה exosome וטוהר נסיוב הדם, פלזמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבודה זו הייתה נחושה לא להיות ניסויים בבני אדם מסקירה הראשונית של המוסדיים סקירת לוח (IRB של קולורדו סטייט), כמו כל דוגמאות האנושי התקבלו כפי שזוהו מבטל את דגימות biorepository Bioreclamation IVT והיו אסף תחת IRB אושרו פרוטוקולים.

1. הכנת המדגם גולמי (פלזמה או סרום) מאת Pelleting שלפוחית גדול ופסולת הסלולר

הערה: שיקול הבטיחות: פלזמה, סרום ונוזלים ביולוגיים אחרים הם חומרים ותברואה, חייבים להיות מטופלים עם טיפול מיוחד, כשאתה לובש בסיסי ציוד מגן אישי, כולל כפפות חלוק המעבדה. מומלץ מאוד כי דגימות ביולוגיות מעובדים של אבטחה בארון; אם לא זמין, מומלץ השימוש של העין-הגנה.

  1. Equilibrate סרום או מדגם פלזמה על ידי הנחת הצינור בתנאים שאינם מנער במקרר 4 ° C בלילה (מ-20 או או אחסון-80 ° C).
  2. Aliquot µL 250 המדגם לתוך צינור microcentrifuge באמצעות פיפטה של 1,000 µL.
  3. Centrifuge הדגימה ב g x 18,000 למשך 30 דקות ב 4 º C.
  4. באמצעות פיפטה 200 µL, להסיר µL 200 של תגובת שיקוע שנוקה ולהוסיף אותו צינור microcentrifuge. הימנע כל חומר pelleted בעת העברת את תגובת שיקוע. להשליך את החומר pelleted.
  5. לכמת את תכולת החלבון של המדגם על ידי חומצה (BCA) bicinchoninic assay, באמצעות הפרוטוקול של היצרן. כדי לבצע את הבדיקה, לדלל את דוגמה 1:50 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לבחון כל מדגם כפילויות.
    הערה: השתמש PBS x 1 לאורך כל הפרוטוקול אלא אם צוין אחרת. בממוצע, 200 µL של סרום מובהר או פלזמה (לאחר 18,000 x g) תניב 15 מ ג של חלבון הכולל. סוגי דגימה אחרים, עם תכולת החלבון נמוכה יותר או גבוהה יותר, עשוי לדרוש דילולים BCA נוספים.
  6. Aliquot 10 מ ג של המדגם לתוך צינור microcentrifuge. להשתמש את הריכוז מתקבל בשלב 1.5 לחישוב כמות הדגימה המתאימה. Aliquot הדגימה באמצעות פיפטה 200 µL.
    הערה: מומלץ לאחסן המדגם הנותרים ב-80 מעלות צלזיוס. Aliquot השתמש המדגם צינורות שונים-10 מ ג למחזור כדי להימנע ההקפאה מרובים-הפשרה מחזורים עתידיים.

2. העיכול של חלבוני דם בלתי-exosomal

הערה: הצעד עיכול נועד להפחית את החלבונים הלא-exosomal אשר יכולים לטהר בשיתוף עם exosomes. אם שימור של חלבונים משטח exosome נדרשת עבור ניתוחים במורד הזרם, יש לקחת בחשבון כי שלב זה יש פוטנציאל להפריע בניתוח זה. זיהוי exosomal CD63, חלבון tetraspanin השטח החשופים, היה משמעותי שהמועמדים אינם מושפעים תהליך זה.

  1. להכין proteinase פתרון K-ריכוז של µg/mL 500 ב- PBS. להוסיף את כמות proteinase K צינור חרוטי. לאחר מכן להוסיף את המאגר ואת מערבולת ב-30 s, x 3 בטמפרטורת החדר.
  2. להוסיף 50 µL של פתרון proteinase K המדגם 10 מ ג aliquot ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 200 µL.
  3. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך 30 דקות במקום הצינור במעמד צינור לצוף ולהימנע טבילה מלאה צינור באמבט מים כדי למנוע דליפה פוטנציאליים.
  4. להעביר את הדגימה ואת מתלה צינור צף באמבט מים 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי להשבית את proteinase ק.

3. הסרת של חלבונים קטנים, פפטידים על ידי צנטריפוגה אולטראפילטרציה

  1. לשטוף התקן אולטראפילטרציה המכיל מסנן ניתוק (MWCO) משקל מולקולרי kDa 100 עם PBS לפני השימוש. לעשות זאת על-ידי הוספת µL 500 ל- PBS למסנן, באמצעות פיפטה של 1,000 µL. לסובב המכשיר ב 3,700 x g עבור 5 דק להשליך כל retentate הנותרים, כמו גם את eluate.
    הערה: קיבולת נפח דגימה של המכשיר אולטראפילטרציה חייב להיות 0.5 מ ל mL - 4 כדי לוודא כי הנפח הסופי מדגם מופחתת של 50 µL הוא בר השגה.
  2. לקחת את הדוגמה מהצעד 2.4 ולהגדיל את עוצמת הקול כדי 500 µL על-ידי הוספת PBS. Pipette המדגם לתוך המכשיר אולטראפילטרציה שטופים מראש.
    הערה: בממוצע, שאמצעי האחסון מדגם מהשלב 2.4 µL 185 (120 עד 150 µL מדגם ו- 50 µL של פתרון proteinase K).
  3. למקם את המכשיר אולטראפילטרציה צנטריפוגה benchtop זווית קבועה ב g 3,700 x ב 4 ° C עד הדגימה יש להפחית את נפח של 50 µL.
    התראה: בעת שימוש בהתקני אולטראפילטרציה עם עצרה נפח, יש לנקוט כדי למנוע יובש מוחלט של קרום מסנן במהלך השלבים צנטריפוגה.
  4. להוסיף 500 µL ל- PBS ישירות לתוך ממברנה מסנן פיפטה לאורך 5 פעמים. צנטריפוגה כמו שלב 3.3. לבצע שלב זה שטיפת סך של 3 פעמים.
  5. להעביר את retentate הסופית µL 50 microcentrifuge צינור חדש.
  6. לשטוף את הקרום מסנן עם 200 הציבורית µL, pipetting לאורך 10 פעמים, ולהעביר לשטוף את הצינור מהשלב 3.5.
  7. המקום בעל מסנן במצב הפוך צינור חדש. הפעל החלמה ספין הפוך עבור 5 דקות ב g 2,000 x לאחזור מדגם הנותרים הקרום. בריכה הדגימה עם הדוגמה מהצעד 3.5.

4. טיהור של שלפוחית על ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות)

  1. הוסף µL 850 של slurry שניה, עם חרוזים שיש MWCO של kDa 700, לתוך עמודת זרימת הכבידה ריקה, רצ'ט באמצעות פיפטה של 1,000 µL. מקם את העמודות בגודל של ארון תקשורת המתאימה מצוידים עם מגש לנוזלים.
  2. הפקק התחתון של העמודה ולתת את ניקוז נוזלי במשך 5 דקות. ברגע רוקן, להוסיף 10 מ של PBS לשטוף השרף. לאפשר 20 דקות בשביל הכביסה לנקז מן העמודה.
  3. במקום מרוכז, proteinase K מטופלים הדוגמה מהצעד 3.5 לתוך צינור חרוטי 15-mL, להגדיל את נפח דגימה עד 5 מ"ל הוספת PBS עם פיפטה סרולוגית. לערבב את הצינור בעדינות במוזיקת עבור 1 דקות ולאחר מכן החל לאט את הדגימה אל העמודה מוכן בשלב 4.2 עם פיפטה סרולוגית.
    הערה: לאחר הסרת הכיפה של העמודה, המדגם יזרום דרך השרף על ידי הכבידה; המדגם 5-mL יזרום לחלוטין באמצעות העמודה תוך עשר דקות.
  4. לאסוף את הזרימה בצינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. בעזרת פיפטה סרולוגית, להחיל את החומר שנאסף שרף שוב כדי להסיר את כל חומר הנותר מתחת 700 kDa.
  6. לאסוף את הזרימה בצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את השרף פעמיים הוספת 1 מ"ל ל- PBS. לאסוף את הזרימה בצינור מהשלב 4.5; הנפח הסופי הכולל יהיה בערך 7 מ.
    הערה: לאחר שלב 4.6, המדגם להיות מדולל כ- 35 פעמים מאמצעי האחסון מדגם המקורי; השלבים הבאים להפחית את נפח ולרכז את הדגימה exosome מטוהרים.

5. ריכוז של Exosomes מטוהרים, חלבון הכולל כמת

  1. לשטוף את התקן אולטראפילטרציה עם מסנן MWCO 3 kDa עם PBS לפני השימוש, כפי שמתואר בשלב 3.1.
  2. להוסיף את הדגימה מהשלב 4.6 אולטראפילטרציה ההתקן ואת צנטריפוגה ברוטור דלי החוגגת ב g x 3,700 ב 4 º C. מאגר יעבור דרך המסנן, יכול להיות מושלך. Exosomes מרוכז יישמרו מעל המסנן. Centrifuge הדגימה עד האחסון מעל המסנן (retentate) מופחתת ל- 200 µL.
  3. להעביר את retentate צינור microcentrifuge.
  4. לשטוף את הקרום מסנן עם 200 µL PBS מאת pipetting מעל הקרום 10 פעמים ולהעביר לשטוף את הצינור מהשלב 5.3. זה יאפשר האוסף של דוגמה exosome שיורית.
  5. להביא נפח דגימה עד 500 µL על-ידי הוספת PBS. מערבבים על-ידי pipetting באיטיות לאורך 10 פעמים.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. דוגמאות יש לאחסנו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב- 20 /-80 ° C לאחסון לטווח ארוך.
  6. לכמת את תכולת החלבון של המדגם על ידי assay BCA, באמצעות הפרוטוקול של היצרן. לדלל את דוגמה 1:10 ו- 1:50 ב- PBS. להפעיל כל מדגם כפילויות.
    הערה: החל מ- 10 מ ג של חלבון הכולל של סרום או פלזמה, התשואה הכוללת חלבון ב exosomes מטוהרים מהשלב 5.6 הוא, בממוצע, 150 µg. נוספים דילולים עשוי להיות נחוץ אם הדוגמאות סרום או פלזמה משמשים; התשואה עשוי להשתנות עם סוג הדגימה.

6. כמת ושינוי של Exosomes על ידי ננו-חלקיק מעקב ניתוח (נ)

  1. להוסיף 5 µg של exosomes מטוהרים (כפי לכמת ב- 5.6) 1 מ"ל של PBS ו מערבולת 15 s על מהירות נמוכה-בינונית.
    1. מקם את הדגימה מזרק חד פעמיות 1 מ"ל. אם הוא זמין, להגדיר את המזרק משאבת מזרק אוטומטי מוגדר להזריק את הדגימה exosome מדולל בקצב של 30 µL/min.
    2. לבצע מדידות נ באמצעות הגדרות לכידת וידאו: מסך רווח של 3-4 ורמת המצלמה של 12-13.
    3. הגדרת קובץ ה-script עבור ניתוח לרוץ שלושה טכני משכפל למשך תקופה מינימלית של 30 s שימוש שוטף עבור כל שכפול. הניתוח, להגדיר את הסף לכידת-5.
      הערה: פרטים בנוגע לשימוש מזרק אוטומטי, ואת ההגדרות עבור לכידת וידאו זמינים הפניה13. הגדרות לכידת וניתוח עבור נ חייב להיות עקבי מדגמים שונים כדי להבטיח comparability.

7. קביעת הפחתת חלבון מסיס

  1. להוסיף 1-10 µg של exosomes מטוהרים למאגר דגימה מרחביות ולבצע לזיהוי בג'ל (עמוד) באמצעות Bis-טריס 4-12% ג'ל במרחביות x MES 1 הפעלת מאגר עבור 35 דקות ב- 200 העברה (פ') נפתרה חלבונים ניטרוצלולוזה 0.2 µm קרום על-ידי החלה של o מתח f 50 V עבור ה 1-1.5 לבצע ניתוח תספיג כדי להעריך את הנוכחות של אלבומין, apolipoproteins A, B ודה מרקר exosome CD 63 בעקבות מתודולוגיות סטנדרטי.
    הערה: פרוטוקולים מלאים עבור פעולות השירות ב- 7.1 ניתן למצוא אסמכתא14; באופן ספציפי, SP007: פועלת לזיהוי ג'לים, SP011: תספיג פרוטוקול.
  2. להפריד בין 10 µg של exosomes מטוהרים באמצעות דף כמו שלב 7.1, כתם הלהקות חלבון באמצעות צבע coomassie, המלצות התקן הבאים, כדי להמחיש חלבון וריאציה וצמצום בין דגימות.
    הערה: פרטים נוספים על הגדרות הפרוטוקול עבור ספיציפית CD63 המערבי שהכלים מתוארים על ידי דיאז ואח. 15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנתונים המוצגים להלן התקבלו באמצעות דגימות פלסמה וסרום לזווג מתורמים בדם בריא חמש. כדי לקבוע את ההשפעות של כל שלב העיבוד, בוצעו 5 וריאציות של פרוטוקול שהוצגו ולאחר התאוששות exosome והסרת חלבונים שאינם exosome הושוו. השיטות trialed כללו: 1) kDa שניה 700 + kDa אולטראפילטרציה 3; 2) אולטראפילטרציה 100 kDa; 3) proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100; 4) שניה kDa 700 + kDa אולטראפילטרציה 100, ו-5) Proteinase K + kDa אולטראפילטרציה 100 + kDa שניה 700 + אולטראפילטרציה 3 kDa.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה ממוטבת כדי להגביר את הטוהר ואת התשואה של exosomes מדם תגדיל את היכולת שלי במדויק שלפוחית חוץ-תאית כמקור של סמנים ביולוגיים עבור מחלות מספר. בשיטות הרגילות, המשמשים כעת כדי לבודד exosomes, ליתר דיוק, ultracentrifugation ושיטות משקעים, יש מספר חסרונות כולל צבירת exosome, pelleting של חלבונים מסיסים7,17, 18. לחלופין, השימוש שניה הראו שיפור משמעותי בבידוד exosome, מגן על exosomes מפני צבירת ושיפור להסרת נפוצות מזהם הלא-exosoma...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרנות פנימי של CSU (כדי kmd ב), בקרת האוויר החוזה #2016-0550-0002 (קריעת של NIAID HHSN272201600013C), ו- ביל ומלינדה גייטס (OPP1039688) (כדי kmd ב/NKG). אנו מודים החוויה מחקר ה-NSF עבור תוכנית הקיץ סטודנטים (REU) באוניברסיטת קולורדו תמיכה נוספת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NanosightMalvernNS300
מיקרוצנטריפוגה ספסלית Legend Mico21
nbsp;בקמן קולטראלגרה 6R
Waterbath BenchmarkB2000-4
קורא מיקרופלייטBIOTEKEpoch
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןTHERMO23227
ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCATHERMO23235
פוספט חוצץמלח קורנינג21-040-CV
96 צלחת בארקורנינג15705-066
Amicon Ultra-0.5 צנטריפוגלי סינון יחידה עם Ultracel-100 ממברנהEMD-MilliporeUFC510096
Amicon Ultra-4 יחידות סינון צנטריפוגליEMD-MilliporeUFC800324
Capto Core 700GE Healthcare17548103
Poly-Prep  עמודות כרומטוגרפיהBIORAD7311550
NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריסTHERMONP0323BOX
קרום ניטרוצלולוזה, גליל, 0.2 ומיקרו; מBIORAD1620112
פרוטאינאז K,  Tritirachium albumEMD-Millipore539480
SimplyBlue SafeStainTHERMOLC6065
SIGMAFAST  BCIP/NBTMillipore-SIGMAB5655
4-Chloro-1-naphtholMillipore-SIGMAC6788
Anti-CD63 נוגדן (ארנב אנטי-אנושי) עם עז אנטי-ארנב נוגדן HRP משניSYSTEM BIOSCIENCESEXOAB-CD63A-1נוגדנים ראשוניים ומשניים
ALB נוגדן (F-10)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.sc-271605נוגדן
ראשוני apoB נוגדן (C1.4)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.sc-13538נוגדן ראשוני
apoA-I נוגדן (B-10)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.sc-376818נוגדן ראשוני
צנטריפוגה ספסלית Thermo &

מקורות

  1. Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
  4. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
  5. Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
  6. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
  7. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  8. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).
  9. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269(2015).
  10. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316(2016).
  11. de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378(2015).
  12. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561(2017).
  13. Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
  14. Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
  15. Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975(2016).
  16. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  17. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  18. Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
  19. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  20. Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
  21. Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Proteinase KBCANTAWestern Blotting
עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.