הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

סיכום

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

תקציר

חלבון misfolding, צבירת לתוך עמילואיד הייצורים החיים קשורה עם התחלתה של התקדמות של מספר מחלות ניווניות. עם זאת, יש עדיין מעט מידע על חלבונים מסיסים איך אגרגטים להפעיל את ההשפעות הרעילות שלהם בתוך vivo. אורגניזמים פשוטים prokaryotic ו האיקריוטים מודל, כגון חיידקים, שמרים, תרמו משמעותית להבנתנו הנוכחי של המנגנונים מאחורי היווצרות עמילואיד תאיים, הפצת אגרגטים, רעילות. ב פרוטוקול זה, השימוש של שמרים מתואר כמודל לנתח את הקשר בין היווצרות של אגרגטים חלבון והשפעתם על הסלולר סטרס חמצוני. השיטה משלבת את הגילוי של המדינה מסיסים/המצטברים תאיים החלבון amyloidogenic עם כימות של נזק חמצוני הנובע ביטויה באמצעות cytometry זרימה (FC). גישה זו היא פשוטה, מהירה, כמותית. המחקר מדגים את הטכניקה על-ידי התאמת את הסלולר עקה הנגרמת על ידי קבוצה גדולה של עמילואיד-β משתנים פפטיד עם שלהם מספק שלעצמו צבירת מהותי בהתאמה.

מבוא

פרוטוסטאזיס הוא דטרמיננטה הבסיסית של כושר תא ותהליכי הזדקנות. תאים, חלבון הומאוסטזיס נשמר על ידי בקרת איכות החלבון המתוחכם רשתות שנועד להבטיח את נכונות refolding של חלבונים misfolded conformers מלווים ו/או proteolysis יישוב שלהם עם מספר מנגנונים שנשמרת היטב^{1 ,2,3,4,5}. מספר רב של מחקרים מספקים תמיכה לקשר בין התפתחות והתקדמות של מגוון רחב של מחלות האדם וכישלון פרוטוסטאזיס, המוביל אל חלבון misfolding, צבירת. למשל, הנוכחות של חלבון פיקדונות נחשב סימן היכר פתולוגי של הפרעות ניווניות רבים, כמו אלצהיימר, פרקינסון, ו הנטינגטון מחלות^6,7,8, מחלות prionogenic, amyloidoses ניוונית⁹. הוצע כי הרכבות oligomeric, protofibrillar מוקדמת בהתגובה צבירת הן elicitors הראשי של cytotoxicity, הקמת aberrant אינטראקציות עם חלבונים אחרים חצרו הסלולר צפוף¹⁰. בנוסף, חלבון הכללות (PI) יכול להיות מועבר בין תאים, הפצת שלהם השפעה רעילה^11,12. לכן, זה יכול להיות כי היווצרות של PI אולי אכן מהווה מנגנון בעלת מגבילה את נוכחותם של מינים צבורים מסוכן למיקומים ספציפיים בתא, היכן ניתן לעבד או שנצבר ללא תופעות לוואי משמעותיות ^{13 , 14}.

תקן במבחנה גישות הביוכימי סיפקו תובנות חשובות מינים שונים that לאכלס את צבירת תגובות ו^15,שלהם מאפיינים¹⁶. עם זאת, תנאי שימוש אלה מבחני בבירור שונות מאלו המתרחשים בתוך התא ולתשאל, לכן, מאבדים רלבנטיות פיזיולוגיים. בגלל השימור הבולטים של מסלולים סלולריים כגון בקרת איכות חלבון, autophagy או ברגולציה של הסלולר חמצון-חיזור המדינה^17,18 בין פרוקריוטים^{19,20,21 ,22,23}, שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) התפתחה מיוחס מודל הסלולר פשוט ללמוד על גורמים מולקולרית של צבירת חלבון והשפעתו המשויך ציטוטוקסיות סביבות ביולוגית רלוונטית^24,25,26.

חלבון צבירת הנטייה היא תכונה מטבעו מקודד ברצף העיקרי. לפיכך, היווצרות עמילואיד-מבני ניתן לחזות המבוסס על זיהוי, הערכה של עוצמת קידום צבירת אזורים polypeptides²⁷. עם זאת, למרות ההצלחה של אלגוריתמים bioinformatic כדי לחזות את המאפיינים צבירת במבחנה של רצפי חלבונים, הם עדיין רחוק מלהיות חיזוי איך לתרגם אלה מספק שלעצמו ויוו ציטוטוקסיות ההשפעה. מחקרים כתובת הקישור בין המדינה צבורים של חלבון נתון שלה נזק תאי המשויכים בצורה שיטתית עשוי לעזור כדי לעקוף מגבלה זו חישובית. חיבור זה הוא התייחס במחקר הנוכחי, ניצול של סט גדול של גרסאות של פפטיד עמילואיד-β Aβ42 שונות רק ב משקע יחיד, אך הצגת טווח רציף של צבירת מספק שלעצמו ויוו²⁸. בפרט, מתואר גישה מבוססת-FC לזהות את הזן הסתגלותי החשבונאי נזק חמצוני שהפיק צבירת נוטה חלבונים בתאים שמרים. המתודולוגיה מספק יתרונות רבים כגון פשטות, תפוקה גבוהה יכולת מדידה כמותית מדויקת. גישה זו אפשרו לאשר את PI לשחק תפקיד מגן מפני עקה.

פרוטוקול

1. תרבויות cerevisiae ס וביטוי חלבונים

הערה: גרסאות Aβ התערוכה מספק שלעצמו צבירת היחסי שונה עקב מוטציה בגן משקע אחד במיקום 19 (Phe19) של פפטיד Aβ42 (איור 1 א'). גרסאות פפטיד אלה מתויגות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), אשר משמש כתב (איור 1) צבירת²⁹.

1. להפוך פלסמידים קידוד עבור 20 Aβ42-GFP משתנים לתוך תאי שמרים עם BY4741 רקע הורים (מאטה שלו3Δ1 leu2Δ0 פגש את15Δ0 ura3Δ0)³⁰. כל פלסמיד מקודד עבור מוטציה Aβ42 דבוקה GFP באמצעות מקשר GSSGSSG. פלסמידים הינם pESC(-URA) וכוללים דה מרקר לבחירה URA3²⁹.
   1. להכין המדיום מלאה סינתטי ללא אורציל (SC-עורה) עם הרכיבים הבאים: 1.9 גרם/ליטר חנקן שמרים בסיסי ללא אורציל, 5 g/L אמוניום סולפט, 900 מל של ddH₂O בשילוב עם 100 מ של גלוקוז 20% (w/v).
   2. מכניסים המושבה אחד של תאי שמרים טרנספורמציה 20 מ"ל של המדיום SC-עורה המכיל 2% גלוקוז ולגדול התרבויות בין לילה ב 30 ° C תחת עצבנות-210 סל ד.
2. למחרת, לגדול תרבויות חדשות של תאי שמרים מאת לחסן 100 µL של התרבות לילה לתוך מ של מדיום SC-עורה צח.
3. יתר₅₉₀ של 0.5, centrifuge התרבויות ב x 3000 g למשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים באותו אמצעי אחסון בינוני SC-עורה צח המכיל 2% raffinose.
4. דגירה ב 30 ° C תחת עצבנות-210 סל"ד למשך 30 דקות. לאחר מכן, centrifuge את התאים ב 3000 g x במשך 4 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend התאים במדיום SC-עורה צח המכיל 2% גלקטוז לזירוז הביטוי חלבון רקומביננטי.
5. לאחר ה' 16 של גרימת ביטוי חלבון במדיום SC-עורה המכיל 2% גלקטוז, קציר 1 מ"ל של התאים המושרה צינורות סטרילי microcentrifuge על ידי צנטריפוגה ב 3000 g x במשך 4 דקות.
   הערה: ההבדלים הרלוונטיים ביותר להתרחש לאחר תקופה אינדוקציה של תאי שמרים המושרה ה 16 לבטא Aβ42-GFP משתנים, ניתן לאבחן על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי לקבוע את התפלגות חלבון רקומביננטי בתוך התאים (איור 2B).

2. התא מכתים

הערה: תאים שאינם-induced טריים נדרשים כפקד שלילי כדי לקבוע סף פלורסנט במהלך ניתוח FC.

1. לוקחים תאי שמרים h-induced 16 ולקבוע שלהם צפיפות אופטית-590 nm (OD₅₉₀)_. לדלל אותם בתוך תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) יתר₅₉₀ של 0.1.
   1. להכין 1 x buffered פוספט תמיסת מלח כדלקמן: להוסיף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה₂HPO₄, ולמלא 0.24 גר'₂פו ח'₄ 800 מ של ddH₂O. הפתרון עד 1 L של ddH₂O לאחר התאמת רמת ה-pH ל 7.4 עם HCl. לסנן את המאגר דרך מסנן 0.2 µm.
2. להעביר את המתלים תא לביטוי כראוי שכותרתו צינורות (פוליסטירן 12 ממ עגול-התחתון × 75), להגן עליהם מפני אור. ודא כי הם מוכנים להיות טעון על cytometer זרימת לניתוח, יחד עם תאים שאינם-induced ו שאינו מוכתם.
3. להוסיף החללית סטרס חמצוני (למשל, אדום עמוק CellROX) כל דגימה-ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר, דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
4. לאחר דגירה, לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 x PBS, resuspend אותם באמצעי האחסון באותו מאגר לפני ניתוח שלהם על ידי מועדון הכדורגל.

3. לזרום Cytometry ניתוח

הערה: השתמש התקנה FC עם לייזרים המתאים ומסננים כדי לזהות GFP ושידור פלורסצנטיות בדיקה סטרס חמצוני. Cytometer זרימה מצוידים 488 ננומטר כחול בלייזר איתור GFP, לייזר nm אדום 635 איתור סטרס חמצוני בדיקה קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש. רכישת פליטת קרינה פלואורסצנטית GFP, סטרס חמצוני בדיקה מבוצע עם 530/30 ננומטר BP מסנן, מסנן BP 660/20, בהתאמה (טבלה 1).

1. לחץ על פתיחת החלונית ' גליון עבודה חדש וליצור החלקות נקודה הרכישה הבאה.
   1. בחר את פיזור כלי מגרש מסרגל הכלים וליצור מגרש עם המשתנים לצד פיזור-אזור (האס-A) על ציר ה-y לעומת קדימה פיזור-אזור (FSC-A) בסרגל ליניארי של בציר ה-x.
   2. לחץ על פיזור כלי מגרש מסרגל הכלים וליצור מגרש עם המשתנים באזור FL1 (FITC)-ציר ה-x vs. FL3-האזור (APC) ב לוגריתמי בציר ה-y.
2. לחץ על הסמל הגדרות מכשירים . לחץ על הכרטיסיה פיצויים וקבע בכל רמות הפיצוי. לחץ על הכרטיסיה ייבוא , בחר את המספר הכולל של אירועים 20,000 שיירשמו.
3. לחץ על הסמל קצב הזרימה כדי לעבור את קצב זרימה נמוכה.
4. לחץ על הכרטיסיה ייבוא להתחיל לרוץ את התאים הלא-induced, מוכתם ולהתאים את המתח הגדרות המכשיר פארווערטס ואת פיזור בצד עד האוכלוסייה מופץ ברבע השמאלי האמצעי.
   1. לחץ על הסמל ' מצולע ' כדי להגדיר אזור R1 סביב האוכלוסייה תא למעט שאריות תאים, ולהשתמש אוכלוסייה מגודרת זו P1 = R1 עבור כל נקודה פלורסנט חלקות וייצוגי היסטוגרמה (איור 3).
5. כדי להתאים את המתח PMT של האות פלורסצנטיות, להפעיל את התאים מוכתם העלילה נקודה FL1-FL3, כוונון של הרווח בכרטיסיה כלי ההגדרה , עד התאים מופצים ברבע השמאלי התחתון.
6. לשנות את דגימת התאים המושרה למדידת קרינה פלואורסצנטית GFP. בכרטיסיה כלי ההגדרה , להגדיר את רווח FSC-A נ' FL1 (FITC) כאשר האוכלוסייה מופץ ברבע הימני התחתון. הגדרת האוכלוסייה תא חיובית עם שער (שער P2).
7. שינוי הדוגמית להוכיח אי-induced מוכתם לתאים כדי להציג סטרס חמצוני זריחה על FSC-A נ' FL3 (APC) נקודה מגרש. מנגינה של הרווח עד האוכלוסייה תא מופץ ברבע השמאלי-עליון. שער אוכלוסיית תאים חיוביים P3.
8. לעשות שני מגרשים היסטוגרמה עם סמל היסטוגרמה לייצג את פלורסצנטיות תא. כדי לייצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ודא FL1 (FITC) המייצג את פלורסצנטיות GFP ב ציר ה-x, FL3 (APC) המייצג את זריחה בציר ה-y, החלת P2, P3 אוכלוסיות בקנה מידה לוגריתמי, בהתאמה.
   הערה: כיסויי היסטוגרמה הם דרך טובה כדי להמחיש את ההבדלים בין הפרופילים זריחה של תאים לבטא את Aβ וריאציות שונות.

4. Immunodetection חלבון רקומביננטי

1. כדי לקבוע רמות ביטוי החלבון, לקצור את התרבויות שמרים המושרה עבור 16 h על ידי צנטריפוגה-g 4,000 x עבור 6 דקות ואחסן את כדורי תא ב- 80 ° c
   1. Resuspend התאים שנאספו ביטוי חלבון רקומביננטי עבור 16 h ב- PBS. להכין 200 המתלים תא µL של כל מוטציה Aβ42-GFP יתר₅₉₀ של 20.
2. לניתוח שבר מוחלט חלבון, לקצור 100 µL של כל מוטציה על ידי צנטריפוגה ב g 14,000 x במשך 20 דקות, resuspend כדורי תאים באותו אמצעי אחסון שמרים פירוק מאגר Y-לכל (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1% דימתיל סולפוקסיד, 200 מ"מ NaCl, המכיל 10 מ"ג/מ"ל (myr 14-SB3 EDTA 1 מ מ istyl sulfobetaine) בתוספת 1 מ"מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF)).
   1. דגירה הדגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות קלה.
3. לקבוע את הריכוז תמצית חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד. לטעון עד 5 µg של חלבון תמצית של כל מדגם on a ג'ל אלקטרופורזה מרחביות-דף 15% אקרילאמיד כתם על גבי קרום polyvinylidene difluoride (PVDF) ב- 100 וולט עבור 60 דקות.
   1. הכן של ברדפורד מגיב עם 100 מ ג של G-250 כחול מבריק Coomassie התפרקה ב 50 מ של 95% אתנול, להוסיף 100 מ של חומצה זרחתית 85% (w/v). לאחר מכן, כאשר לצבוע התפרקה לחלוטין, לדלל את התערובת עם ddH₂O עד 1 ליטר, דרך נייר סינון תאית רק לפני השימוש.
      הערה: הכימית ברדפורד צריך להיות חום בהיר.
   2. להכין תקן של שור אלבומין (BSA) הנע בין 5 ל- 100 µg של חלבון ב- 1,000 µL מהתרכובת ברדפורד.
   3. להוסיף 1-10 µL של חלבון תמצית 1 מ"ל מהתרכובת ברדפורד, דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   4. למדוד את ספיגת תקנים ולחלץ החלבון דגימות-OD₅₉₅.
   5. לניתוח, הופכים מגרש עם הערכים ספיגת שהתקבלו עבור הסטנדרטים vs. µg של חלבון. בהתבסס על העקומה סטנדרטי, לקבוע את ריכוזי הדגימות המקורי כמות של חלבון, בהתחשב בכך את נפח ואת דילול, אם בכלל.
4. לשטוף את הקרום עם 1 x באגירה טריס תמיסת מלח (TBS), 0.1% Tween 20 (TTBS), ולחסום אותו באמצעות חלב יבש ללא שומן 5% (w/v) ב- 1 x TTBS.
   1. להכנת 1 ליטר של 10 x TBS, להמיס 24 גר' טריס הבסיס ו- g 88 של NaCl ב 900 מל של₂O H_dd ולהתאים את ה-pH ל 7.6. DdH₂O להוסיף נפח סופי של 1 ל' פתרון 1 x, לערבב 1 חלק של מניות x 10 עם 9 חלקים של ddH₂O.
5. דגירה הקרום עבור h 1 עם 1:1,000 6E10 בדילול נוגדן ראשוני β-עמילואיד, לשעה בטמפרטורת החדר עם עז משני נוגדן אנטי עכבר IgG-HRP המספר המשלים מדולל 1:10, 000.
6. לפתח ממברנות באמצעות 1 מ"ל של ריאגנט פלורסנט Luminata ולכמת להקות על ידי ניתוח densitometric, כפי שמתואר בשלב 5.2.

5. ניתוח נתונים

1. כדי לנתח את הנתונים שבידי FC, ליצור טבלה מציג את עוצמת פלורסנט רשע (MFI), קרינה פלואורסצנטית החציוני לשגיאה הסטנדרטית המתאימים ו/או המקדם של השונות (CV) עבור קרינה פלואורסצנטית GFP ורמות סטרס חמצוני.
   1. לחץ על הכרטיסיה מפקח בסמל נתונים סטטיסטיים כדי להתאים אישית את נתונים סטטיסטיים הדרושים לכל ערוץ.
      הערה: בעת השוואת גרסאות חלבון, להמיר פלורסצנטיות ערכי הנתונים מקפלים-over רקע או מדד רזולוציה (RD):
      
      בהמדד, המדגם רשע הוא זריחה מתכוון הבעיה דוגמאות של הפקד רשע הוא זריחה אכזרי של תאים משמש פקד, הגרמנים הוא סטיית התקן של זריחה אומר. פקטור רואד הוא אינדקס מדויקת יותר מהערך MFI הוא לא רק מחשב את ההפרש בין דגימות, אלא גם חשבונות עבור הפצת הנתונים. חישוב זה רלוונטי במיוחד כאשר משווים נתונים שמקורם ניסויים שונים מתבצעת לאורך זמן. לאחר ה-RDs חושבו, השימוש של מבחן סטטיסטי מומלץ לאשר את משמעות ההבדלים שנצפה בין גרסאות חלבון.
2. עבור חלבון immunodetection, לכמת את רמות חלבון רקומביננטי מאת תספיג באמצעות תוכנת ImageJ.
   1. לפני הניתוח densitometry, להמיר תמונות raw המקורי של קרום מפותחת תבנית קובץ JPEG ומצב בגווני אפור.
   2. להתאים את המקטע להגדיר מידות של התפריט נתח לערך גריי אומר.
   3. לחץ על הכלי מלבן של ImageJ ולהגדיר אזור בעל עניין (ROI) בגודל אחיד לניתוח densitometry הלהקה. מרכז כל הלהקה על התמונה ממברנה בתוך המסגרת מלבני נוצר והקלטה של מדידה אחת באמצעות Ctrl + M (הפקודה מדידה).
   4. למדוד את הרקע מקומי צמוד כל הלהקה, החלת רועי באותו האזור. לאחר המדידה, להחסיר הרקע המקומי המתאים כל הלהקה בודדים.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעסיק אוסף של משתנים 20 של פפטיד Aβ42 שבו יש כבר מוטציה Phe19 proteinogenic טבעי כל חומצות אמינו²⁸. מספק צבירת התיאורטי שלעצמו החלבונים האלה ניתן לנתח באמצעות אלגוריתמים שונים bioinformatic שני (AGGRESCAN וטנגו^31,32). בשני המקרים, ניתוח זה הופך את שינוי הדרגתי פרוגרסיבי של צבירת נטיות, ומייחס, ככלל, את הערכים הגבוהים ביותר ואני את שאריות הידרופובי לאלה טעונה, קוטבי (

דיון

מגוון רחב של מחלות קשורה להצטברות של חלבונים misfolded לתוך הסלולר פיקדונות^6,7,8,33. מאמצים רבים נעשו כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המפעילות את התפרצות של מחלות אלו באמצעות גישות חישובית, אשר לא עשה חשבון חלבון ריכוזים, או במבחנה מתקרב, שבו ריכוז חלבון נשארת קבועה במהלך התגובה. עם זאת, בתוך התא, חלבונים נמצאים כל הזמן מסונתז והשפילו בסביבה צפופה, אי-הומוגניות. זה מסביר את הסתירות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי שמרים BY4741	ATCC	201388	גנוטיפ: MATa his3Δ 1 leu2&דלתא; 0 met15&דלתא; 0 ura3&דלתא; 0
pESC(-Ura) פלסמיד	Agilent Genomics	217454	פלסמיד ביטוי שמרים עם מקדם גל. סמן לבחירה URA3
שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי מזון	Sigma	Y1501	אבקת
שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו	Sigma	Y0626	אבקת
Raffinose	Sigma	R7630	אבקת
גלוקוז	Sigma	G7021	אבקת
גלקטוז	Sigma	G0750	אבקת
פוספט מי מלח חומציים (PBS)	פישר סיינטיפיק	BP3991	פתרון 10X
ריאגנט אדום עמוק של CellROX	Life Technologies	C10422	חיישן פלואורסצנטי של רדיקלים חופשיים, לא פלואורסצנטי במצב מופחת, ומציג פלואורסצנטיות בהירה בעת חמצון על ידי מיני חמצן תגובתיים (ROS), עם ספיגה/פליטה מקסימלית של 644/665 ננומטר.
מגיב מיצוי חלבון Y-PER	Thermo Scientific	78990	מאגר ליזה של תאים נוזליים
אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד	Sigma	A6050	תמיסת
ברדפורד	Bio-Rad	5000205	ריאגנט צבע לקביעת שלב אחד של ריכוז החלבון
ונוגדני עמילואיד 6E10	BioLegend	803001	עכבר IgG1. האפיטופ נמצא בתוך חומצות אמינו 3-8 של בטא עמילואיד (EFRHDS).
מצומד IgG-HRP נגד עכבר עיזים	Bio-Rad	1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Premixed, מוכן לשימוש מגיב זיהוי HRP כימילומינסנט
תמיסת פלואוריד פנילמתאן סולפוניל (PMSF)	Sigma	93482	. מומס ב-0.1 מ' באתנול
FACSציטומטר זרימה של קאנטו	BD Biosciences	657338	מצויד ב-488  לייזר כחול nm לזיהוי GFP, ו-635  לייזר אדום ננומטר / מסנן 530/30 ננומטר BP ומסנן 660/20 ננומטר תא
העברת אלקטרופורזה תא העברת	חלבון Bio-Rad	1703930	מערכות
יציקה ידנית	Bio-Rad	1658000FC	מערכת אלקטרופורזה