מאמר שיטה
במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.
תאים סרטניים יש באופן שגרתי תרבותי בשני מימדים (2D) על משטח פלסטיק. טכניקה זו, עם זאת, חסרה את הסביבה נכון גידול בנפח גדול חשוף vivo בתוך. גידולים מוצקים גדלים לא כמו סדין המצורפת פלסטיק, אבל במקום כאוסף של תאים המשובטים תלת מימדי (3D) מרחב אינטראקציה עם שכניהם, ועם מאפיינים המרחבי ברורים כגון שיבוש קוטביות סלולרית רגילה. אינטראקציות אלה לגרום תלת-ממד תרבותי תאים לרכוש מאפיינים מורפולוגיים הסלולר רלבנטיות יותר ויוו גידולים. בנוסף, גידול בנפח גדול עומד בקשר ישיר עם סוגי תאים אחרים כגון תאי סטרומה ואת המערכת החיסונית, כמו גם של מטריצה חוץ-תאית של כל סוגי תאים אחרים. המטריקס שהופקדו מורכבת של מקרומולקולות כגון קולגן fibronectin.
בניסיון להגביר את התרגום של ממצאי המחקר באונקולוגיה מן הספסל אל מיטתה, קבוצות רבות החלו לחקור את השימוש במערכות דגם התלת-ממד באסטרטגיות הפיתוח שלהם סמים. מערכות אלו נחשבים רלבנטי יותר מבחינה פיזיולוגית, כי הם מנסים לסכם את הסביבה הטרוגנית ומורכבת של הגידול. מערכות אלו, עם זאת, יכול להיות מורכב למדי,, למרות נוטה צמיחה בשנת 96-ובכן תבניות, וחלק עכשיו אפילו ב- 384, והם מציעים מספר אפשרויות הצמיחה בקנה מידה גדול, הקרנה. זה נצפתה הפער הוביל להתפתחות של השיטות המתוארות כאן בפירוט כדי תרבות גידול spheroids בתפקיד תפוקה גבוהה ב- 1536-ובכן צלחות. שיטות אלה מייצגים פשרה למערכות מורכבות מאוד מבוסס-מטריקס, אשר קשה מסך וקונבנציונאלי מבחני 2D. מגוון רחב של שורות תאים סרטן מחסה מוטציות גנטיות שונות מוקרנים בהצלחה, בחינת היעילות מורכבים באמצעות ספריית אצר של תרכובות מיקוד מסלול Mitogen-Activated קינאז או MAPK. התגובות תרבות ספרואיד משווים לאחר מכן על התגובה של התאים גדלו ב 2D, פעילויות דיפרנציאלית מדווחים. שיטות אלה מספקים פרוטוקול ייחודי לבדיקת פעילות מורכבת בסביבה תלת-ממד תפוקה גבוהה.
בעשור האחרון, יותר ויותר מחקרים יש ליישם את השימוש תא תלת-ממד מודלים תרבות כדי להבין את המושגים לא recapitulated באופן מלא על ידי גידול התאים ב- 2D על הפלסטיק. דוגמאות של מושגים אלה כוללים מסעה קוטביות תאים אפיתל רגיל1 שבו יאבדו הכיוון המרחבי של הפסגה, הבסיס שכבות של תאים, כמו גם את התפקיד של מטריצות בוויסות הישרדות, גורל. המחקר האונקולוגי, בפרט, השתמשה דגמי תלת-ממד כדי להבין את הביולוגיה בסיסי של תאים סרטניים, ההבדלים בין 2D and 3D תא תרבות מערכות3,4. הפיתוח של טכניקות מתוחכמות יותר של תרבות תא ושל שלהם התאקלמות נוספת לתבניות רב טוב אפשרה את החיפוש אחר תרופות חדשות הגדרות תלת-ממד. בניג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. culturing של הגידול 1536-ובכן 3D Spheroids
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מגוון של תא סרטני הוקמה קווים ידועה לגדול גם בתנאים תרבות 2D נבדקו באמצעות השיטות המתוארות כאן. להחליפן בתמונות מתוך מגוון של סרטן מוטציה MAPK תא קווים (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-מל-30:NRAS ולאחר KNS-62:HRAS) ניתן לראות באיור1. תמונות אלה מדגימים כי למרות הקווים תא מורפולוגיות שונות, כל אחד נוצר 3D מבנים הלוחות assay 1536-. טוב. איור 2 מדגים את זה, כאשר נעשה שימוש להקרנה בקנה מידה גדול, רגישות מתחם ההפרש בין תרבויות גדלו ב .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השיטות המובאות כאן מדגימים פרוטוקול מפורט על איך לייצר spheroids הגידול ב- 1536-ובכן לוחות עבור הקרנות מתחם בקנה מידה גדול. שיטות אלה היו בתחילה ממאמרו של עבודה במכון הסרטן הלאומי שבו הגידול spheroids גדלו במבחני בתפוקה נמוכה ב- 6-ובכן, 96-ובכן צלחות לשאול שאלות אודות יחסי תלות גנטית וגם רגישות מתחם13, 14 , 15. תכונה חיוני וייחודי של פרוטוקול זה היא כי spheroids נוצרות מתאי מסורתי 2D תרבותי רקמות 1536-פלטות באמצעות הגדרה מדיה המ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים הם עובדים של נוברטיס, כמה מהעובדים הם גם בעלי המניות.
המחברים רוצה להכיר מארק פרר המרכז הארצי לקידום מדעי Translational, מכוני הבריאות הלאומיים שלו תמיכה והדרכה על ההתפתחות הראשונית של מבחני אלה. בנוסף, ברצוננו להודות אליסון פרימן, Mariela Jaskelioff, מיכאל אקר, ג'ייקוב Haling ו- Vesselina קוק קלט מדעי ודיון שלהם כמו פרויקט חברי צוות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | נרכש כפתרון מוכן. קבלה זו נמצאה מועדפת בהשוואה לספקים אחרים. |
| DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | נרכש כפתרון מוכן. |
| מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) | לונזה | 12-115Q | נרכש כפתרון מוכן. |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Seradigm | 1500-500 | נרכש כפתרון מוכן. |
| 1x 0.25% טריפסין עם חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) | היקלון | SH30042.01 | נרכש כתמיסה מוכנה. |
| 1x פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140 | נרכש כפתרון מוכן. |
| 10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובסט בסיסי אנושי (bFGF) | Sigma | F0291 | השעיה במים סטריליים. |
| 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF) | Sigma | E9644 | השעיה במים סטריליים. |
| 0.4% אלבומין סרום בקר (BSA) | Sigma | A9418 | השעיה ב-PBS סטרילי ובמסנן. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) החלפת סרום | Gibco | 10828-028 | הוסף טרי ממש לפני השימוש. |
| 100% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | נרכש כתמיסה מוכנה. |
| <חזק>חומרים מתכלים | |||
| קלטת קומבי קטנה | ThermoFisher | 24073295 | |
| קלטת מרובת זרימה קטנה | BioTek | 294085 | |
| 1536 בארות צלחות TC סטריליות (לבן) | קורנינג | 3727 | |
| צלחות TC סטריליות 1536 בארות (שחור) | קורנינג | 3893 | |
| צלחות | ScivaxMBL International | NCP-LH384-10< | |
| חזק>ציוד | |||
| דבקים אטמים | ThermoFisher | AB0718 | |
| חממת ספינינג | LiCONiC | ||
| מכסי נירוסטה | המכון הגנומי של קרן המחקר נוברטיס (GNF) | ||
| ATS מתקן אקוסטי | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| משאבה פריסטלטית- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה