הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57482

⸱

5 במאי 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בעכבר השריר מרים auris הארוך (LAL) כדי להקליט ספונטנית, עורר עצב postsynaptic פוטנציאל (זרם-קלאמפ) וזרמים (מתח-קלאמפ) באזור צומת עצב-שריר. שיטה זו יכולה לספק תובנות מפתח במנגנונים של ההעברה הסינאפסית בתנאים רגיל ומחלות.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר טכניקה כדי להקליט הסינאפסית מצומת neuromuscular בתנאים הנוכחיים-קלאמפ, מתח-קלאמפ. הכנה ex-vivo של מרים auris הארוך (LAL) משמש כי זה שריר דק המעניק קל ויזואליזציה של צומת עצב-שריר חלוקה בניצב microelectrode-motor endplate. שיטה זו מאפשרת ההקלטה של פוטנציאל endplate מיניאטורי ספונטנית, זרמים (mEPPs ו- mEPCs), עורר עצב endplate פוטנציאל וזרמים (אפס ו- EPCs), כמו גם את מאפייני ממברנה motor endplate. התוצאות המתקבל בשיטה זו כוללות בתוכן quantal (קיו סי), מספר האתרים שחרור שלפוחית (n), ההסתברות של שלפוחית שחרור (prel), ההנחיה סינפטית, דיכאון, כמו גם את קרום זמן קבוע של השריר (τ מ') קלט ההתנגדות. יישום של טכניקה זו על העכבר מודלים של מחלות אנושיות יכול להאיר את מפתח פתולוגיות במצבי מחלה, לסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניים. מאת מלא מתח-מחבר חובק למעקה סינפסה בודדת, שיטה זו מספקת באחד הניתוחים המפורט ביותר של ההעברה הסינאפסית זמין כרגע.

מבוא

לומד הסינאפסית באזור צומת עצב-שריר מספק תובנות לתוך מערכת היחסים דינמי בין המערכות שרירי העצבים והשלד, הוא מודל מצוין לבחינת פיזיולוגיה סינפטית. מרים auris הארוך (LAL) הוא שריר דק, המאפשר צמתי neuromuscular ניתן לאבחן בקלות. בדו"חות קודמים תיארו שם משתמש את LAL לבחון סינפטית סמים ורעלים, שאפיינו את מאפייני סוג סיבי השריר והשלד של1,לל2. מחקרים רבים ניצלו את LAL לבחון פיזיולוגיה neuromuscular3,4,5,6,7,8. עבור אלקטרופיזיולוגיה, את היכולת להבחין בקלות צמתי neuromuscular LAL מאפשר מיקום מדויק של microelectrodes-motor endplate ואת מקטינה באופן משמעותי בעיות קלאמפ שטח ההקלטות הסינאפסית. . מלחציים צולבים הנוכחי הקלטות של המאפיינים ממברנה שרירים, כגון ממברנה זמן קבוע (τמ'), התנגדות קלט (מוב) מתקבלים בקלות. יתר על כן, ניתן למדוד מאפיינים אלה של סיבי השריר אותו שימוש לתיעוד התמסורת neuromuscular, המאפשר השוואה ישירה של פונקציה סינפטית במאפיינים ממברנה שריר. ניתוח של נתונים אלה יכולים לספק תובנות מפתח במנגנונים הפיזי של מחלות נוירומוסקולריות ומדינות רבות של פעילות שונה.

היבט בטכניקה המתוארת כאן הוא השימוש של מתח-קלאמפ להקלטות סינפטית, אשר אינם כפופים הלא-linearities נתקל הנוכחי-קלאמפ ואינן תלויות המאפיינים ממברנה שריר. יתרונות השימוש מתח-קלאמפ לעומת הנוכחי-קלאמפ לבחון את התמסורת neuromuscular הוקמו על ידי חלוצי המאמצים ב שנות ה-509. תחת זרם-קלאמפ, אפסס עולה על 10-15 mV משרעת אינם תוצר ליניארי של משרעת mEPP9. לדוגמה, אם mEPP הממוצע הוא 1 mV, EPP של 5 mV אפשר להניח להיות התוצר של 5 mEPPs (קיו סי 5); הואיל EPP של 40 mV יהיה התוצר של mEPPs יותר מ-40. זה הלא-ליניאריות-אפס גדול יותר מתרחשת כיוון הכח הדוחף עבור EPP, אשר ההבדל בין פוטנציאל ממברנה פוטנציאל שיווי משקל של הקולטן אצטילכולין (~-10 mV), פוחתת באופן משמעותי במהלך אפס גדול. בעיה זו הוא נמנע בניסויים מתח-קלאמפ, כי פוטנציאל ממברנה שריר אינו משתנה במהלך הניסויים מתח-קלאמפ. החיסרון הוא מתח-קלאמפ ניסויים טכנית קשה יותר להשלים מאשר הנוכחי-קלאמפ הקלטה. עם זאת, מקלכלן ומרטין פיתח תיקון מתמטית פשוטה that חשבונות for הלא-linearities בהקלטות הנוכחי-קלאמפ אפסס10. התיקונים עובדים טוב11,12,13, אך, חשוב להניח המאפיינים ממברנה שריר לא שובשו.

המאפיינים ממברנה שריר חשובים במיוחד לשקול אם לומד תנאים או מצבי מחלה לשבש את השריר. לדוגמה, שרירי השלד מהמודל הטרנסגניים R6/2 של מחלת הנטינגטון היא hyperexcitable עקב ירידה פרוגרסיבית מנוחתו כלורי, אשלגן זרמי14,15. כתוצאה מכך, mEPPs, אפסס הם מוגבר בשרירי השלד R6/2. . בהחלט, גורמים נוספים יכולים לשנות mEPPs, אפס. עבודה עם מודל שונה של מחלת הנטינגטון עכברים (R6/1) נמצאו שינויים אפסס זה נראה להיות קשורה מוקש-חלבונים8. כדי להעריך את מנגנוני גרימת התמסורת neuromuscular מסולף, זה יהיה מועיל לחסל את ההשפעות של שריר שינו ממברנה מאפיינים באמצעות מתח-מלחציים. במחקר שנערך לאחרונה, התמסורת neuromuscular R6/2 נחקר תחת שני התנאים מהדק זרם מתח בטכניקה המתוארת במסמך זה. מכלול של endplates המנוע היו מתח מהודקי עם פחות מ- 1% השגיאה על-ידי הצבת שני microelectrodes בתוך אורך קבוע endplate ה-16. היא הוצגה על המתח-המלחציים, תיקן רשומות הנוכחי-קלאמפ הניב מדידות מנוגדים של התמסורת neuromuscular בשריר R6/2. זה מדגיש כי ייתכן שתתקשה לתיקון אפסס הלא-linearities אם המאפיינים ממברנה שריר שונתה, מציגה את היתרונות של קבלת מתח-קלאמפ רשומות שאינן תלויות המאפיינים ממברנה שריר. פרוטוקול שהוצגו במסמך זה הינו אידיאלי עבור בחינת תנאים או מצבי מחלה המשפיעות הסינאפסית והמאפיינים postsynaptic ממברנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם חיה אכפת לי ואת השימוש הוועדה של רייט סטייט.

1. עכבר המתת חסד

  1. בשכונה fume, מקם את העכבר זכוכית אטום מאלחש קאמרית.
  2. לחשוף את העכבר באמצעות אינהלציה כדי מנה קטלנית של איזופלוריין (קולח, או ~ 25%). להשאיר את העכבר בתא עד יכול להיות שנצפו לא לנשום.
  3. להסיר את העכבר מן החדר ולבצע. תאמת צוואר הרחם כשיטה משנית של המתת חסד.

2. הסרת שיער מן המשטח הגבי של הראש, הצוואר, הגב

  1. השתמש מכונת גילוח חשמלית כדי להסיר את רוב השיער על המשטח הגבי של הראש, הצוואר וגב העכבר. כמו כן, להסיר את השיער על האוזן השמאלית.
    הערה: יש להיזהר בעת גילוח העור סביב האוזניים, העור עלול להיתפס הלהבים של מכונת הגילוח, עלול לגרום נזק רקמות שריר הבסיסית.
  2. להחיל קרם להסרת שיער באמצעות מקלון צמר גפן על האזור המגולח כדי להסיר את השיער הנותר. לחכות כ 1 דקות לשטוף את הסרת שיער קרם עם מים באמצעות בקבוק לחיץ לשטוף, ואז שינקה כל קרם או שיער בעזרת ספוגית כותנה הנותרים, לטפוח העור יבש.

3. להסיר את העור כדי לחשוף את השריר מרים Auris הארוך

  1. תחת מיקרוסקופ ויבתר סטריאו, עושים חתך קטן (עמוקה מספיק כדי לחדור את העור) בחלק האחורי של העכבר ברמה של השכם. לחתוך את העור באמצעות ניתוח מיקרו מספריים, בעקבות הנתיב שמוצג באיור 1 א'-ב'.
  2. בעזרת מלקחיים בסדר (כגון מס ' 5), תעלה את העור לאורך החתך ליד השכם. באמצעות מספריים האביב, חותכים רקמת החיבור להפריד את העור לרקמת שריר כבסיס כשהם התקרבו האוזן. חשוב, חותכים רקמת חיבור עם הלהבים הצביע לתוך העור כדי למנוע מקרי חיתוך לרקמת שריר חשוף.
  3. מעת לעת perfuse השריר חשוף עם פתרון תמיסת מלח פיזיולוגית, כגון Na+ הבאים חיצוני למאגר המורכב (במ מ): 144 NaCl, 4 אשלגן כלורי 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, גלוקוז 5, 12PO NaH4, pH 7.4 עם NaOH, ויש של osmolality של 300 ± 5 mmol/ק ג. ברגע רקמת החיבור נחתך לכיוון האוזן השמאלית, לחתוך את העור סביב האוזן כדי להסיר את העור לחלוטין מן העכבר ולמחוק אותו.
    הערה: LAL מייחסת הבסיס של האוזן, עלולים להיפגע בקלות בעת הסרת העור. זה טוב לעזוב בסביבות 1 מ"מ של העור סביב הבסיס של האוזן כדי למנוע חיתוך את לל.

4. הסרת השריר מרים Auris הארוך ואת הרקמה הסובבת

  1. באמצעות מספריים האביב, להתחיל על ידי חיתוך השרירים הנמצאים נחות לל, אשר להתחבר בין השכם עמוד השדרה. מתחילים עצם השכם הימנית, רק בשביל הזכות של האמצע, וחותכים לקראת הסוף rostral של העכבר, תוך שמירה על הצד הימני של הקו האמצעי. המשך חיתוך לאורך כל הדרך עד הסוף של רקמת שריר על הגולגולת.
    הערה: LAL הוא השריר השטחית ביותר מחובר בצד המדיאלי של האוזן האמצע, כמוצג באיור2. לתמונות נוספות, ספר מאת E.C. גרין17 מציג תמונות מעולה, מצוירת ביד לל.
  2. להשתמש מלקחיים כדי לתפוס את הרקמה לחתוך מיד מימין האמצע, ואז בעדינות להרים ולהתחיל חיתוך לרקמת לכיוון האוזן השמאלית עם הלהבים של המספריים נלחץ כנגד הגולגולת כדי להסיר מספר שכבות של שרירים המהווים נחות LAL השמאלי. להשאיר את כל הרבדים מצורף באופן זמני כדי למנוע חיתוך בטעות את LAL במהלך ההסרה.
  3. עם להבי במקביל גזורה נלחץ כנגד הגולגולת כדי למנוע חיתוך העצב innervates את לל, אשר גולש סביב תעלת האוזן, והוא מזין את השרירים בצד המדיאלי של האוזן. המשך לחתוך דרך תעלת האוזן, שמירה על כמות של עצב צמוד ככל האפשר.
    הערה: העצב המספק את LAL מסתעף ממני עצב הפנים וצריכות להימצא כמו זה ב'טבלת בהמשך ההליך.
  4. חותכים רקמת שומן זה רק דרך תעלת האוזן אותו שביל באיור איור 1B בחלק ventrolateral של האוזן. כמו כן, חתך לאורך עצם השכם השמאלית כפי שנעשה מצד ימין כדי להסיר את השריר לחלוטין מן העכבר.

5. בידוד השריר מרים Auris הארוך

  1. מקם את לל, ואת הרקמה הסובבת, לתוך מכולה. השתמש מיכל שבו הרקמה ביתור ניתן להצמיד התחתון, כגון צלחת פטרי עם חלק תחתון elastomer סיליקון. להתרחץ ולשטוף לעתים קרובות רקמת בפתרון תמיסת מלח פיזיולוגית.
  2. לחתוך את פינה של האוזן לאורך הבסיס של האוזן, עוזב את החלק הסחוס של האוזן לצרף לל. להעיף את השרירים כך הצד נחות פונה למעלה (LAL על החלק התחתון של המנה).
  3. במקום מספר זיהוי אישי, כגון pin החרקים, דרך תעלת האוזן להחזיק את ההכנות במקום. ואז באמצעות סיכות קטנות יותר, pin הרקמה הנותרת בצד הנגדי של האמצע של לל. באמצעות מלקחיים, משוך בעדינות את העור בחלק הלטראלי של האוזן כדי למתוח את השריר מקום סיכה קטנה דרך העור. חזור על שלב זה עד הרקמה תהיה מאובטחת היטב למנה, כפי שמוצג באיור3.
    הערה: סיכות חיתוך קטן יכול להתבצע על ידי חיתוך הקצוות של דיקור מחטים עד לאורך הרצוי. . סיכות קטנות למזער את הנזק לרקמות, ניתן להשתמש עם מים-טבילה מטרות מיקרוסקופ עם זמן עבודה מרחקים.
  4. בגין הסרת את השרירים (ראה איור 4), זה מכסה את לל (auricularis מעולה, החוטף auris הארוך, וגם את interscutularis), והן אלה קשור לאל דרך רקמת חיבור הדוקות במיוחד ליד קו האמצע, באמצעות מספריים מלקחיים ואביב מס ' 5.
  5. עם המלקחיים להרים על השכבה שמעליה שריר, רקמת חיבור עם הלהבים כלפי השכבה שריר שנגררת גזורה לטפל כדי למנוע חיתוך או חותך את לל. לחתוך לכיוון האמצע, תפסיקי לחתוך כשלושה רבעים דרך האמצע. לאחר מכן, חותכים במקביל האמצע כדי להסיר את כל שכבת השריר. לשמור על הסרת שכבות שריר עד נשאר רק לל.
  6. להסיר חלק רקמת החיבור הנותר מכסה את לל, אשר מסייע להתפתחות שיפוד כהוצאה להורג של האלקטרודות. בעדינות להשתמש מלקחיים מס ' 5 כדי למשוך רקמת החיבור הרחק LAL וחותכים אותו משם באמצעות מספריים האביב. רק להסיר רקמות שניתן לעשות בקלות ללא סיכון של פגיעה של LAL בתהליך. הסר את כל העצבים גדול innervate שכבות שריר נחות שנותרו על פני נחות לל זה עלול להכשיל את החזיית צמתי עצב-שריר.

6. בידוד של עצב

  1. לזהות את העצב innervates לאל את השימוש של הקוצב העצבי (לדוגמה, שני חוטי פלטינה מחובר לגנרטור הדופק); יהיו כמה עצבים בורח תעלת האוזן לשרירים. לגעת העצבים עם הקוצב העצבי באספקת זרם קצת (הנוכחית תשתנה בסביבות 5 V). כאשר השריר מתכווץ, העצב הנכון זוהתה.
  2. בזהירות לתפוס את הרקמה ליד העצב ולהשתמש מעיין מספריים כדי להפריד את העצב רקמות המקיפים את האוזן. כדי למזער את הנזק, לשמור על רוב העצב שמוטבע איזה הרקמה הסובבת, אשר ישמשו מאוחר יותר כדי לאבטח את החוצפה המנה הקלטה.
    הערה: העצב המוטוריים innervates את לל ממוקם בצד המדיאלי של תעלת האוזן פתיחה.
  3. אם באמצעות אלקטרודה מגרה של הפרעה דו קוטבית, להסיר את הרקמה שמסביב רק סביב אזור של עצב, הדיסטלי של השריר. אם משתמש של אלקטרודה היניקה, להסיר את הרקמה הסובבת בסוף לחתוך העצב.
    הערה: זוהי נקודת עצירה טובה. זוהי נקודת עצירה טובה. אם הפסקה הוא צריך ההכנות לל ביתור יכול להישמר פיזיולוגית או זלוף קבוע במשך כמה שעות על מנת להבטיח כי מטבוליטים מזיקות אינם מצטברים. השתמש כמויות גדולות של פתרון או קבוע זלוף כדי להבטיח כי מטבוליטים מזיקות אינם מצטברים.
  4. הבא, בטל הצמדה ולהעביר את השריר לתא זלוף לניסויים אלקטרופיזיולוגיה תחת מיקרוסקופ מתחם זקוף.
    הערה: שימוש תא זלוף עם חלק תחתון רך אשר הרקמה יכולה להיות מאובטחת מוצמד (איור 5A).
  5. להצמיד את השריר בקצוות (האוזן ו קו האמצע), לאורך הקצה של השריר. מקם את העצב בניצב סיבי השריר ולהדק אותו לתחתית של המנה דרך טישו עודף מה שנותר ללא פגע בסופו של העצב. שמור את הרקמה רחצו בפתרון תמיסת מלח פיזיולוגית בכל עת.
    הערה: זה גם מועיל יש מעוגלים, חומר מוגברות ישירות מתחת סיבי השריר לל. תמיכה נוספת זו מסייעת אלקטרודה חלוקה בניצב, יכול להיעשות מתוך קטע קטן של סיליקון elastomer יצוק בצינור 50 מ ל חרוט שוכבת על צדה. ניתן לאבטח את המקטע מעוגל של אלסטומר בתחתית תא זלוף באמצעות כמות קטנה של סיליקון טרי. דיאגרמה של תא זלוף מוצג באיור 5B-C. סיבי השריר יכול לדבוק בחוזקה יצוקה לאחרונה elastomer סיליקון (וזה מאוד הידרופובי), עשוי להיות פגום. זה עוזר את המעיל או בלוק יצוק לאחרונה סיליקון עם חלבון, הדומה הצעד חסימה immunoblot. כדי לחסום את זה, לנו יש מתפשט לאחרונה יצוקה סיליקון בתמיסה מרוכזת של אלבומין שור בן לילה.

7. אלקטרופיזיולוגיה ציוד התקנה

  1. להכין או להפשיר aliquots של צבע כדי לסייע להמחיש את צומת עצב-שריר, כגון צבע מיטוכונדריאלי 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, אשר הוא רגיש אור ויש לאחסנו מן האור. כמו כן, להפשיר אלקטרודה פתרונות. מערבולת כל aliquots כדי להבטיח כי כל מומסים בגבול בפתרון. להכין פתרון תמיסת מלח פיזיולוגית המכיל 1 מיקרומטר ממוצע-Conotoxin GIIIB (ממוצע-אקס) ו- 80 מיקרומטר BTS (אופציונלי).
  2. לאבטח תא זלוף עם LAL לבמה מיקרוסקופ. המקום האלקטרודה ההפניה לתוך כוס מלאה 3 מ' אשלגן כלורי, אשר מחובר אל התא הקלטה גשר אגר. להתחבר האלקטרודה הפניה המגבר לפי הוראות יצרן.
  3. בשלב זה, מקם את האלקטרודה מגרה עצב על העצב. להשתמש על אלקטרודה יניקה או אלקטרודה דו-קוטבי, קטן כפי שהם פועלים היטב עבור גירוי עצבי.
    1. הצב האלקטרודה מגרה רחוק לשריר ככל האפשר כדי למזער את מספר חפצים גירוי בהקלטות.
      הערה: צריך להיות נשלט האלקטרודה מגרה עם יחידת בידוד הגירוי יכול לשלוט את משרעת מתח לפי הצורך.
  4. לאט הרימו את המתח על-ידי הפעלת הידית מתח יחידת בידוד הגירוי עד התכווצויות שנצפו. הנקודה שבה ההתכווצות נצפתה לראשונה היא הסף. ברגע הסף זוהתה, להגדיר את המתח על יחידת בידוד גירוי ב- 1.5 * סף (או כפי שהוגדר על ידי הניסוי).
    הערה: איור 6 מראה את ההכנות שריר להגדיר תחת מיקרוסקופ זקוף, האלקטרודה דו-קוטבי קטנים הממוקמים על העצב באמצעות תחמן הכדור-ג'וינט. . זה רייטינג יש את המתח הנמוך ביותר לגירוי אפשרי אך שהם עדיין מספיק מעל הסף. מתח גירוי נמוך מפחית את מספר חפצים גירוי במהלך הקלטות. כמו כן, הצבת האלקטרודה מגרה מן השריר יקטן בגודל של החפץ גירוי. לפעמים הסוף של העצב יתערער מ. הקרע, ולכן יהיה צורך להתנסות בו לאורך העצב ממריץ יוצבו.
  5. להסיר את תמיסת מלח ים והחלף 5 מיקרומטר 4-Di-2-Asp. לחשוף את ההכנות לל ל 4-Di-2-Asp 10 דקות להשיג פלורסצנטיות נאותה להמחשת צומת עצב-שריר (איור 7).
  6. להכין שני פתרונות אלקטרודה, 3 מ' אשלגן K+ פתרון פנימי המורכב (במ מ) 75 אספרטט, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP ניתרן, ניתרן 5 phosphocreatine, 5 גלוטתיון, המגבים 20, 30 EGTA, pH 7.2 עם קו.
    הערה: הפתרונות צריכים להיות מוכנים מראש; הפתרון פנימי K+ יכול להיות מאוחסן aliquots ב-20 ° C.
  7. מילוי הזכוכית משך נימי עבור האלקטרודה חישה מתח עם 3 מ' אשלגן כלורי. השתמש הפתרון פנימי K+ (שלב מוכן ב 7.6) על האלקטרודה הנוכחי-חולפת; השתמש צר תווך לא מתכתי מחט (~ 34 מד) מצורף מזרק 1 מ"ל למלא בקלות הנימים זכוכית. טפח בעדינות את נימי הדם כדי להסיר בועות אוויר; ודא כי כל אלקטרודה מלא יש התנגדות של 10-15 MΩ.
    הערה: בדוק ורשום את ההתנגדות של שתי אלקטרודות באמצעות התוכנה רכישת נתונים.
  8. לאחר 10 דקות, להחליף את הפתרון 4-Di-Asp עם Ca2 + הפתרון נורמלי.

8. זיהוי של צומת עצב-שריר באמצעות קרינה פלואורסצנטית

  1. שימוש במיקרוסקופ זקוף עם סטנדרטיים מואר-שדה והארה פלורסצנטיות, חפשו פס בהיר של פלורסנט צמתי neuromuscular ירוקה פועל בניצב סיבי השריר לאורך ההכנות כפי שמוצג באיור 7 א. השתמש מטרה טבילה במי הגדלה נמוכה (~ 10 X) לזיהוי צמתים עצב-שריר
    הערה: המיקרוסקופ צריך להיות מצויד קוביה FITC (לשעבר: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50), ולא LED, לייזר, מנורת הלוגן או מרקורי מנורה על ידי קרינה פלואורסצנטית. כדי למזער תמונה הלבנה, לסירוגין בין תאורה בהירים- ושדה קרינה פלואורסצנטית.
    הערה: הלהקה הזאת היא בדרך כלל יותר מקורב לבסיס של האוזן מאשר האמצע. הלהקה הוא האזור שבו צמתי neuromuscular מרוכזים ביותר.
  2. לעבור אל יעד טבילה במי הגדלה גבוהה יותר (~ 40 X) ולזהות צומת עצב-שריר על השכבה העליונה של שריר לבחון עם electrophysiology (איור 7 ב).
  3. אבטח את פיפטות מילוי לתוך בעלי פיפטה על headstages המתאים, לפי הוראות היצרן. השתמש micromanipulators למיקום האלקטרודות מעל קרום שרירים בתוך 100 מיקרומטר של צומת עצב-שריר מזוהה (איור 7C). מקם את האלקטרודות שימוש בעיקר מיקרוסקופיית שדה בהיר; השתמש זריחה כדי לאשר את מיקום האלקטרודות יחסית צומת עצב-שריר.
  4. תחילה, השתמש מטרה הגדלה נמוכה (~ 10 X) כדי לאתר את האלקטרודות ולאחר מכן לעבור אל יעד ההגדלה (~ 40 X) גבוה יותר עבור המיקום הסופי של האלקטרודות. לא לדקור את האלקטרודות לתוך השריר בנקודה זו, תחילה לכוון האלקטרודות.

9. כוונון, משפדים את האלקטרודות

  1. ברגע האלקטרודות ממוקמות מעל סיבים הרצוי, אפס, לכוון האלקטרודה חישה מתח באמצעות גשר איזון (או גישה מקבילה), לנטרל את קיבול אלקטרודה לפי הוראות היצרן. כמו כן, אפס האלקטרודה הנוכחי-חולפת.
  2. הביאו שתי אלקטרודות אל פני השטח של הסיבים. לאט לאט להתאים את מיקום האלקטרודות בדרך אל הסיבים כך האלקטרודות להישאר בכיוון הנכון ביחס באזור צומת עצב-שריר, כפי שתואר בשלבים 8.3 ו- 8.4.
  3. לאחר שתי אלקטרודות יש קשר עם פני השטח של סיבי השריר, לדקור האלקטרודה הנוכחי-עובר בוטה קודם. להשתמש בטכניקות כגון באז (קצר פולסים של קיבול עודפי הפיצוי), פולסים קצרים הנוכחי או בעדינות טופפת על השולחן כדי להקל על חלוקה בניצב אלקטרודה.
    1. נטר את האות, באמצעות אוסצילוסקופ או פרוטוקול אוסצילוסקופ בתוכנה רכישת נתונים, עד קרום שליליות פוטנציאליות מזוהה, המציינת כי להשתפד האלקטרודה.
  4. נלחצים האלקטרודה חישה מתח חד אל השריר לרמה של האלקטרודה הנוכחי-עובר משופדים. לאחר שתי אלקטרודות בקנה אחד עם אחד לשני, לדקור האלקטרודה חישה מתח באותן שיטות להחיל עם האלקטרודה הנוכחי-חולפת.
  5. בעת חלוקה בניצב מוצלחת, באמצעות הבקר עבור המגבר, להחיל שלילי מתמיד מחזיק הנוכחי עם האלקטרודה חולפת הנוכחי כדי לפצות על נזק הממברנה בשל חלוקה בניצב אלקטרודה. התא יתחיל לחייב לאט לכיוון-80 mV, עלייה החזקתו הנוכחי כמו הצורך להביא את התא הרצוי המנוחה פוטנציאליים (קרי-80 ל-85 mV).
    הערה: להימנע הקלטה של סיבי הדורשים אחזקה הנוכחי בתוך הערך המוחלט שגודלם nA--25 בשריר פראי סוג כדי למזער את הסיכוי של הקלטה של סיבים לא בריא.
  6. ברגע הסיבים הוא יציב לכמה דקות ב הרצוי המנוחה פוטנציאליים, להמשיך להקליט שריר ממברנה מאפיינים או התמסורת neuromuscular.

10. רישום מאפייני ממברנה Postsynaptic הסינאפסית

  1. להתחיל עם זרם-קלאמפ הקלטות על-ידי החלת מספר שווה של חיוביות ושליליות צעדים הנוכחי כדי למדוד את התגובות מתח קרום המתאים, אשר ישמשו לקביעת motor endplate Rב , τמ'. כדי להבטיח מאפיינים פאסיביים, השתמש תגובות מתח קטן להגיע למצב יציב, יש זרם-מתח הקשר הליניארי16,19,20. להימנע הקלטה של סיבים עם עצב פגומים או לא בריא, סיבים כאלה יש תדר mEPP > 3 הרץ.
  2. בשלב הבא, הזן 2-אלקטרודה מתח-קלאמפ לפי הוראות היצרן. . מלחציים צולבים מתח סיבים-פוטנציאל הממברנה של-85 mV. . מלחציים צולבים מתח הגדרות להשגת יחס אות לרעש המאפשרות זיהוי של mEPCs.
    הערה: שמירה על בקרת מתח הולם יכול להוות בעיה. אנו משתמשים בשתי שיטות כדי למזער בעיות אלה. ראשית, הסיבים הם משופד בתוך 100 מיקרומטר של motor endplate כפי שתואר לעיל, אשר נמצא אורך קבוע של סיבים אלה21. שנית, אנו משתמשים בתכונת שחזור DC של המגבר. תכונה זו מגדירה רווח מתח גבוה מאוד-קלאמפ. העבודות הקודמות שלנו תיאר שיטה זו בפירוט, התווה שיטה להערכת endplate מהודקי מתח ה-16.
  3. פעם אחת במתח-קלאמפ, להקליט זרמים סינפטית (mEPCs ו- eEPCs) באמצעות גירוי עצבי פרוטוקולים שונים, בהתאם לדרישות של הניסוי.
    1. שיא mEPCs ספונטנית, EPCs באמצעות פרוטוקול גירוי עצבי בתדר נמוך (≤0.5 הרץ) המאפשרת רשומה EPCs ללא אפנון סינפטית (ההנחיה או אפנון) כדי להעריך את תוכן quantal. כדי להעריך את ההנחיה סינפטית או דיכאון, להשתמש בפרוטוקול גירוי עצבי בתדר גבוה (10 פולסים במהירות של 50 הרץ).
    2. לעורר את העצב בתדר הרצוי באמצעות יחידת בידוד גירוי, אשר יכול להיות מופעלות באמצעות גנרטור הדופק מפוקח באמצעות התוכנה רכישת נתונים.
  4. ברגע ההקלטות מתח-קלאמפ עשית, להחזיר את המגבר להגדרה הנוכחית-קלאמפ, לבטל את כל הזרמים, להסיר את האלקטרודות הסיבים. סימון כי האלקטרודות לא סתומים או ותפזורת בגישה הבסיסית מתח במהלך ההקלטה.
    הערה: לגבי הסחף, המתח אלקטרודה צריך להיות 0 וולט בהפתרון חוץ-תאית, כפי שהם נקבעו לפני חלוקה בניצב סיבים. לדוגמה, המתחים מוקלטות יהיה ברור אם המתח נסחפה במהלך הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 8 מראה דוגמה של הפולסים הנוכחי (איור 8A) ואת התגובות מתח (איור 8 ב') מסיב לל אחד תחת זרם-קלאמפ סוג בר בן שבוע 12 עכבר R6/2. הנוכחות של mEPPs מציין כי רשומות אלה לקוחים את motor endplate. הרשומות התקבלו בפתרון תמיסת מלח פיזיולוגית. רשומות הנוכחי-קלאמפ אלה ניתן לנתח כדי לקבוע את Rב , τמ' זה סיב16,19,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המתוארים כאן הוא הכנת השימוש בעכבר LAL שריר לשקילת התמסורת neuromuscular בתנאים מהדק זרם או מתח. ישנן מספר נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון ניקוד החוצה לל. ניקוי עודף רקמת חיבור של כל העזרים השריר ב חלוקה בניצב אלקטרודה, כמו האלקטרודות יכול להרים רקמת החיבור כאשר והצב אותן עבור חלוקה בניצב. עם זאת, רק להסיר את רקמת החיבור יכול להילקח בקלות כדי להגביל את הסיכויים של פגיעה בשריר. הבידוד של העצב יש לבצעו בזהירות כי זה מאוד עדין. כדי למנוע נזק עצבי, זה עוזר להשאיר חלק הרקמה שמסביב המצורפת לקצה של עצב שדרכו ניתן להציב pin כדי לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ד ר מארק מ עשיר ומירנדה דניאל על הערות, Khedraki אחמד שעזרת להקים זה טכניקה, אוניברסיטת המדינה של רייט עבור תמיכה כספית (קרן אתחול כדי A.A.V.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אולימפוס תרכובת מיקרוסקופאולימפוסBX51WI
10x אובייקטיביאולימפוסUMPLFLN10XW
40x אובייקטיביאולימפוסLUMPLFLN40XW
בורוסיליקט זכוכיתסאטר מכשיריםמכשירים BF150-86-7.5
CCD מצלמהסנטה ברברה מכשירים קבוצהST-7XMEI
Mater-9 דופק מחוללAMPI
מבודד גירוי איזו-פלקסAMPI
pCLAMP 10 תוכנה לרכישת וניתוח נתוניםהתקנים מולקולריים1-2500-0180
אלקטרודה דו קוטבית קונצנטריתFHCמניפולטור
Narishige 
מזרקים לא מתכתיים 34 מדמכשירי דיוק עולמייםMF34G-5
ניקון סטריאומיקרוסקופניקוןSMZ800N
מס' 5 מלקחייםמדעיים
מספריים קפיציםכלי מדע עדינים15006-09
מס' 2 מלקחייםRobozRS-5Q41
מיקרו-חיתוך מספרייםRobozRS-5912SC
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning2404019862
קרם הסרת שיערNair
Grass SD9 ממריץדשא רפואי
דגם P-1000 חולץ מיקרופיפטהמכשירי סאטרP-1000
Axon Digidata 1550 מערכת חימום נתונים עם רעש נמוךמכשירים מולקולריים
מסנן בסלמסנן וורנר אינסטרומנט קורפ.LPF-8
מיקרומניפולטור שמאליSiskiyou Corp.MX1641/45DL
מיקרומניפולטור ימניSiskiyou Corp.MX1641/45DR
בקרת תנועה יחידהSiskiyou Corp.MC100e
מיקרומניפולטור רולר חוצהSiskiyou Corp.MX1641Rזה נוסף לציר ה-Z של המיקרומניפולטורים השמאליים והימניים כדי לאפשר למניע את ציר ה-z. הגדרה מותאמת אישית זו זולה יותר ופחות מגושמת מקניית מיקרומניפולטור ממונע בעל 4 צירים. זה גם מאפשר לנו לשלוט בשני המיקרומניפולטורים עם בקר אחד
כל הכימיקלים הוזמנו מפישר למעט,
BTSToronto Research ChemicalsB315190
CTXAlomone LabsC-270
4-Di-2-Aspבדיקות מולקולריותבדיקות מולקולריות היא כבר לא חברה. עכשיו הוזמן דרך פישר
מפרק כדורי CBDSH75 כלים עדינים נמוך

מקורות

  1. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  2. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  3. Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
  4. Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
  5. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  6. Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67(2016).
  7. Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
  8. Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
  9. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
  10. McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
  11. Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80(2015).
  12. Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
  13. Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
  14. Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
  15. Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
  16. Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
  17. Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
  18. Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
  19. Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
  20. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
  21. Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
  22. Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
  23. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
  24. Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.