כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחזור החיים של לישמניה, סוכן סיבתי של שושנת יריחו, נחליף בין שלבים promastigote, amastigote פנימה החרק ומארח חוליות, בהתאמה. בעוד תסמינים פתוגניים של שושנת יריחו, יכולה להשתנות מ שפיר נגעים עורית לטפסים מחלה קטלנית מאוד מהבטן תלוי בזן זיהומיות, כל המינים לישמניה שוכנים בתוך המקרופאגים מארח במהלך שלב חוליות מחזור החיים שלהם. לישמניה infectivity ולכן קשורה ישירות את יכולתו לפלוש, לשרוד, לשכפל בתוך וקואלות parasitophorous (PVs) בתוך המקרופאגים. לפיכך, הערכת היכולת של הטפיל לשכפל intracellularly מגישה כשיטה אמין לקביעת התקפה אלימה. לימוד פיתוח שושנת יריחו באמצעות מודלים בעלי חיים היא גוזלת זמן, מייגע, לעתים קרובות קשה, במיוחד עם הטפסים הקרביים pathogenically חשוב. נתאר כאן מתודולוגיה לעקוב אחר התפתחות תאיים לישמניה ב מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs). טפיל תאיים מספרים נקבעים במרווחי 24 שעות ביממה עבור h 72-96, בעקבות זיהום. שיטה זו מאפשרת נחישות אמין של ההשפעות של גורמים גנטיים שונים על לישמניה התקפה אלימה. לדוגמה, אנו מציגים כיצד אלל יחיד מחיקה של הגן לישמניה מיטוכונדריאלי ברזל טרנספורטר (LMIT1) וביכולתם של המתח מוטציה לישמניה amazonensis LMIT1/ΔLmit1 לגדול בתוך BMMs, המשקפים ירידה דרסטית התקפה אלימה לעומת פראי-סוג. Assay הזה גם מאפשר שליטה מדויקת על תנאי הניסוי, אשר ניתן לטפל בנפרד כדי לנתח את השפעת גורמים שונים (חומרים מזינים, מינים חמצן תגובתי, וכו '.) על האינטראקציה פתוגן-פונדקאי. לכן, ביצוע המתאימה ואת כימות של מחקרים זיהום BMM לספק חלופה לא פולשנית, מהיר, חסכוני, בטוחה ואמינה ללימודים במודל חיה קונבנציונלי.
מבוא
שושנת יריחו מתייחס לקשת רחבה של מחלות האדם הנגרמת על ידי טפילים protozoan מינים של הסוג לישמניה. כ- 12 מיליון אנשים נגועים כרגע לישמניה ברחבי העולם, בלמעלה מ-350 מליון נמצאות בסיכון. המחלה פתולוגיה תלוי על מינים לישמניה מארח הגורמים, הסימפטומים משתנים בין נגעים בעור ריפוי עצמי לא מזיק לטפסים visceralizing קטלני. אם אינה מטופלת כראוי, מהבטן לישמניה קטלנית, הדירוג רק לאחר מלריה כמו המחלה האנושית הקטלני ביותר הנגרמת על ידי זיהום עם טפילים protozoan1. למרות ההבדלים למחשוב המחלה פתולוגיה ותסמינים, כל המינים לישמניה יש digenic-מחזור חיים לסירוגין בין promastigote ו amastigote שלבים בתוך חרק מארחים חוליות, בהתאמה. ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים ואושרו על-ידי IACUC של אוניברסיטת מרילנד. כל השלבים המתוארים בסעיפים 1 עד 4 צריכה להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית בתוך למינאריים ביולוגי. הגנה אישית אמור לשמש, יש לנקוט זהירות בעת טיפול מטפילים לישמניה בשידור חי לאורך כל השלבים של ניסויים.
1. בידוד ובידול של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs)8,30,31
- יום 0: להקריב 4 - נקבה בת שבוע 6 C57BL/6 או BALB/c עכבר בחדר2 CO ואשר מת דרך נקע בצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לישמניה יש שתי צורות זיהומיות - promastigotes metacyclic, זאת להבדיל procyclic promastigotes בשלב נייח של התרבות, amastigotes, אשר נמצאים בשלבים תאיים (איור 1). במינים מסוימים לישמניה כגון ל' amazonensis, amastigotes גם ניתן להבחין בין תרבות axenic על ידי הסטת התאים promastigote להורדת pH (4.5) וטמפרטורה גבוהות (32 ° C), תנאים דומים לאלו שנמצאו בתוך BMM PVs 8 , 34. רק metacy.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הנתונים הכמותיים המיוצר על ידי זיהום BMM וזמינותו שתוארה לעיל, מאפשר חוקרים כדי להשיג את המחירים של זיהום ונחישות אמין של שינויים במאפייני התקפה אלימה בתוך פרק זמן קצר יחסית (מקסימום 2 שבועות, בהשוואה ל- 2 חודשים הדרושים לניסויים ויוו ). שיטה זו מתבססת על ה-DNA ספציפיים לצבוע דאפי, במיוחד כתמי גרעינים macrophage, טפיל, ומאפשר וכימות מהירה של תאים נגועים. לשם השוואה, כתמים אחרים כגון Giemsa לאגד מספר רב של מרכיבים שונים הסלולר בעוצמה משתנה, שמסבך ניתוח ויזואלי37. השימוש של דאפי מאפשר זיהוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים, מתחרה לא
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק RO1 AI067979 NWA.
YK היא זוכת מלגת תואר ראשון מ הווארד יוז המכון/האוניברסיטה הרפואית של מרילנד קולג פארק.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת תרבית תאים 6 באר | Cellstar | 657160 | |
| אדנין | אקרוס אורגניקס | AC147440250 | |
| טיפים לפיפט מחסום אירוסול (100-1000 μ L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| טיפים לפיפט מחסום אירוסול (20-200 μ L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| קצות פיפט מחסום אירוסול (2-20 μ L) | פישרברנד | 02-707-432 | |
| Bard-Parker להב כירורגי מפלדת פחמן גב #10 | אספן כירורגי | 371110 | |
| BD Luer-Lok קצה 10 מ"ל מזרק | בקטון דיקינסון (BD) | 309604 | |
| מחט BD Precisionglide, 25G | בקטון דיקינסון (BD) | 305124 | |
| צלחת תרבית תאים 35 מ"מ x 10 מ"מ | Cellstar | 627 160 | |
| בקבוק תרבית תאים | Cellstar | 660175 | |
| כיסוי משקפיים: 12 מ"מ עיגולים | פישרברנד | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | Invitrogen | D1306 | |
| D-ביוטין | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| אלכוהול אתילי 200 הוכחה | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן לא מטופל TC | בקר עוברי סרום | ||
| 1500-500 | |||
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Nikon | E200 | |
| עז נגד עכבר IgG טקסס אדום | Invitrogen | T-862 | |
| עז נגד ארנב IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II מדלל | בקמן קולטר | ||
| L-גלוטמין | ג'מיני | 400-106 | |
| בינוני 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 מ"מ) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | ג'מיני | 400-109 | |
| פוספט חוצץ מלח (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטית מפוליפרופילין 15 מ"ל | Cellstar | 188 271 | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילין 50 מ"ל | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade | Reagent ThermoFisher | P36930 | |
| מנורת נגד עכבר עכברוש-1 | נוגדן התפתחותי מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה | 1D4B | |
| רקומביננטי אנושי M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line המוציטומטר | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI בינוני 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 פעילי שטח | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| מספריים עדינים, 4 1/2 אינץ' | VWR | 82027-582 | |
| מלקחיים לניתוח, קצה עדין | VWR | 82027-386 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | VWR | 16004-368 | |
| Z1 מונה חלקיקים קולטר, סף כפול | בקמן קולטר | 6605699 |
מקורות
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
