Method Article

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

DOI:

10.3791/57491

⸱

June 17th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology at Irkutsk State University, 2Institute of Biology at Karelian Research Centre of Russian Academy of Sciences, 3Baikal Research Centre, 4Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology, and Research (A*STAR), 5University of Oulu, Optoelectronics and Measurement Techniques Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדגים את העקרונות של זריקה מהירה, פולשנית של פלורסנט microparticles את circulatory system של דגים קטנים, הפריט החזותי ויוו של microparticles בדם דגים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המינהל מערכתית של חלקיקים בגודל מיקרו לתוך אורגניזם יכול להיות מיושם להערכת ויזואליזציה, סמים, משלוח חיסון, ההשתלה של תאים הטרנסגניים וחיישנים אופטי זעיר. עם זאת, microinjections תוך ורידי לתוך חיות קטנות, אשר משמשים בעיקר במעבדות ביולוגי, וטרינרית, קשה מאוד, דורשת צוות מיומן. במסמך זה, נדגים שיטה חזקה ויעילה המבוא של microparticles לתוך מערכת הדם של דג זברה למבוגרים (רזבורה rerio) על ידי זריקה לתוך הכליה דגים. כדי להמחיש את microparticles הציג ב להערכת, אנו מציעים טכניקה פשוטה הדמיה intravital ב זימים של דג. In vivo ניטור pH הדם דג זברה הושג באמצעות פלורסנט microencapsulated מוזרק בדיקה, SNARF-1, כדי להדגים את אחד היישומים האפשריים של הטכניקה המתוארת. מאמר זה מספק תיאור מפורט העטיפה של pH רגיש צבע ומדגים את עקרונות הזריקה מהירה והדמיה של מהמיקרו קפסולות שהושג ויוו הקלטה של האות פלורסנט. השיטה המוצעת של הזרקת מאופיין על ידי שיעור התמותה נמוכה (0-20%) ואת יעילות גבוהה (70-90% הצלחה), וזה קל של מכון התקנים באמצעות ציוד זמין נפוץ. ניתן לבצע בכל ההליכים המתוארים במינים אחרים של דגים קטנים, כגון דגים ו- medaka.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המינהל של חלקיקים בגודל מיקרו לתוך אורגניזם בעל חיים הינה משימה חשובה בתחומים כמו סמים, חיסון משלוח1, להערכת ויזואליזציה2, תא הטרנסגניים השרשה3וחיישן אופטי זעיר השרשה 4 , 5. עם זאת, הליך ההשתלה microscale חלקיקים לתוך מערכת כלי הדם של חיות מעבדה קטנה קשה, במיוחד עבור אורגניזמים ימיים עדין. עבור דגימות מחקר פופולרי כמו דג זברה, מומלץ כי הליכים אלה מובהר, שימוש בפרוטוקולי הוידאו.

Microinjections intracardiac, נימי דורשים צוות מיומן ומתקני למיקרו ייחודי למסירה של microobjects לדם דג זברה. בעבר, הזרקת ידנית רטרו-מסל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי על ניסויים בבעלי חיים, אושרו על ידי החיה נושאים מחקר הוועדה של המכון לביולוגיה באוניברסיטת אירקוטסק.

1. ייצור של מהמיקרו קפסולות

הערה: נושא של הפלורסנט מהמיקרו קפסולות מוכנות תוך שימוש אסיפה שכבה אחרי שכבה של הפוך טעונה polyelectrolytes7,8. כל ההליכים בוצעו בטמפרטורת החדר.

  1. לסנתז נקבובי microcores3 של קאקו, תוחמת את הפלורסנט, מערבבים 2 מ"ל של הפתרון SNARF-1-לתוספי (רוב פולימר מכורך הפלורסנט כגון FITC-BSA יכול לשמש)-ריכוז של ~ 2 מ"ג/מ"ל עם 0.6 מ"ל כל אחד הפתרונ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות שהושג בא מאחד לשלוש קטגוריות עיקריות של פרוטוקול שהוצגו: היווצרות של פלורסנט microparticles על ידי ומגעים צבע פלורסנט (איור 1), הזרקה כליות של מהמיקרו קפסולות עם עוד יותר את הפריט החזותי גיל נימים (איור 2 ו 3) וההקלטה, בסופו של דבר, אין ויוו ספקטרלי של קרינה פלואורסצנטית SNARF-1 כדי לפקח על דם רמות ה-pH (איור 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את הזריקה של microparticles לתוך הכליה דג זברה, השתמשנו חדיר למחצה מהמיקרו קפסולות עמוסה של אינדקטור. כך, הפרוטוקול מכיל הוראות להרכבת מהמיקרו קפסולות באמצעות מכלול שכבה אחרי שכבה טעונה הפוך polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18 (איור 1 א'). היתרון בטכנולוגיה זו הוא כי זה קל לבצע עם ציוד מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים מאוד להכיר את העזרה של בוגדן Osadchiy, ייבגני Protasov (אוניברסיטת המדינה של אירקוטסק, רוסיה) בהכנה של פרוטוקול וידאו. מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הרוסי (#15-14-10008) וקרן רוסי למחקר בסיסי (#15-29-01003).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SNARF-1-dextran, 70000 מגה-וואטThermo Fisher ScientificD3304בדיקה פלואורסצנטית. כל צבע פלואורסצנטי מתאים אחר הקשור לפולימר יכול לשמש כמילוי מיקרו-קפסולה
מצומד אלבומין-פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC-BSA)SIGMAA9771בדיקה פלואורסצנטית
רודמין B איזותיוציאנט-דקסטרן (RITC-dextran)SIGMAR9379בדיקה פלואורסצנטית
סידן כלוריSIGMAC1016CaCO3 היווצרות
תבניותנתרן פחמתיSIGMAS7795CaCO3 תבניות היווצרות
פולי (אלילמין הידרוכלוריד), MW 50000 (PAH)SIGMA283215פולימר קטיוני
פולי (נתרן 4-סטירנסולפונט), MW 70000 (PSS)SIGMA243051פולימר אניוני
פולי-L-ליזין [20 kDa] מושתל בפוליאתילן גליקול [5 kDa], g = 3.0 עד 4.5 (PLL-g-PEG)SuSoSPLL(20)- g[3.5]-PEG(5)פולימר סופי להגברת התאימות הביולוגית של מיקרו-קפסולות
נתרן כלוריSIGMAS8776להמסת פולימרים מיושמים
מערכת טיהור מיםMilliporeSIMSV0000להכנת מים נטולי יונים
מערבל מגנטיSteglerליצירת
תבניות CaCO3אפנדורף  מחקר  בתוספת פיפטה, 1000 ומיקרו; LEppendorfפתרונות מינון
Eppendorf  מחקר  פלוס פיפטה, 10 ומיקרו; LEppendorfפתרונות מינון
קצות פיפטה, טווח נפח 200 עד 1000 ומיקרו; LF.L. Medical28093פתרונות מינון
קצות פיפטה, טווח נפח 0.1-10  μ LEppendorfZ640069פתרונות מינון
מיני צנטריפוגה Microspin 12,BioSanלהליך צנטריפוגה-כביסה מיקרו-קפסולה
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"לEppendorfZ666513מיקרו-קפסולה סינתזה ואחסון
שייקר אינטל-מיקסר RM-1LELMY בע"מלהפחתת צבירת מיקרוקפסולות
אולטראסונילהפחתת צבירת מיקרוקפסולות
טלפונים ראשיים כדי להגן על האוזניים מפני אולטרסאונד
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתSIGMAEDSכדי להמיס את תבניות CaCO3
מונוסודיום פוספטSIGMAS9638הכנת מאגרי pH
דיסודיום פוספטSIGMAS9390הכנת מאגרי pH
נתרן הידרוקסידSIGMAS8045כדי להתאים את ה-pH של תמיסת ה-EDTA והמאגרים
תרמוסטטלייבוש מיקרו-קפסולות על שקופית זכוכית
תאהמוציטומטר לחקור את הגודל, ההתפלגות והריכוז של המיקרו-קפסולות המוכנות
מיקרוסקופ פלואורסצנטי Mikmed 2LOMOהדמיה in vivo של מיקרו-קפסולות בדם
דגיםסט מסנני פלורסנט עבור SNARF-1 (יש לבחור בהתאם לדגם המיקרוסקופ; דוגמה מסופקת)Chroma79010הדמיה של מיקרו-קפסולות עם בדיקות פלואורסצנטיות
ספקטרומטר סיבים QE ProOcean Opticsכיול מיקרו-קפסולות תחת מיקרוסקופ
סיבים אופטיים QP400-2-VIS NIR, 400 μ מ', 2 מ'אוקיינוסיתלחיבור ספקטרומטר עם יציאת מיקרוסקופ
קולימטור F280SMA-AThorlabsלחיבור ספקטרומטר עם יציאת מיקרוסקופ
שקופית מיקרוסקופ זכוכיתפישרברנד12-550-A3כיול מיקרוקפסולות מתחת למיקרוסקופ
כיסויים, 22 x 22 מ"מפנינהMS-SLIDCVכיול מיקרוקפסולות תחת מיקרוסקופ
מיקרו-נימי זכוכית Intra MARK, 10 ומיקרו; LBlaubrandBR708709לאיסוף דם דגים
שמן ציפורןSIGMAC8392הרדמת דגים
Lancet No 11Apexmed international B.V.P00588כדי לחתוך את זנב הדג ולשחרר את מחט הפלדה מקצה מזרק האינסולין האוטומטי
Heparin, 5000 U/mLCalbiochemL6510-BCלטיפול בכל המשטחים הבאים במגע עם דם דגים במהלך איסוף דם דגים
מד pH שבע 2 Go Pro עם מיקרואלקטרודהמטלר טולדולקביעת pH בדם דגים
מחטי עט אינסולין Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 מ"מבקטון, דיקינסון ושותלהליך הזרקה. כל מחט דקה (Ø 0.33 מ"מ או פחות) מתאימה
נימי זכוכית, 1 x 75 מ"מHirschmann Laborgerä te GmbH & Co9201075להליך הזרקה
לפידלהלחמת מחט פלדה לנימים מזכוכית
מיקרו-מזרק IM-9BNARISHIGEלמינון מדויק של תרחיף מיקרו-קפסולות
צלחות פטרי, 60 מ"מ על 15 מ"מ, פוליסטירןSIGMAP5481למניפולציות עם דגים בהרדמה
כפיתפלסטיקלמניפולציות עם דגים בהרדמה
ספוגלמניפולציות עם דגים בהרדמה
מספריים לדיסקציהThermo Scientific31212להסרת כיסוי הזימים מראש הדג
פיפטת פסטר, 3.5 מ"לברנדZ331767להרטיב זימים של דגים
במהירות גבוהה מנקה תא ספירת תאי דם אופטיקה ' גז לח

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
  2. Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microparticle InjectionFish KidneyIntravital ImagingMicrocapsule PreparationFluorescent ProbeBlood pH MonitoringZebrafish Circulatory SystemLayer by Layer EncapsulationGill VisualizationSpectral Analysis

Related Articles