כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9
במאמר זה
סיכום
תקציר
Rootworm תירס המערבי (WCR) המזיק חשוב של תירס והיא ידועה בשל יכולתו להסתגל במהירות אסטרטגיות ניהול בפשט. למרות התערבות ב RNA (RNAi) הוכיח להיות כלי רב עוצמה עבור לימוד הביולוגיה WCR, יש המגבלות. באופן ספציפי, RNAi עצמו הוא חולף (כלומר לא תגרום לטווח ארוך התורשה של פנוטיפ המשויך), וזה דורש לדעת את רצף ה-DNA של הגן היעד. האחרון יכול להיות הגבלת אם פנוטיפ עניין נשלטת על ידי גנים שנשמרת לקוי, או אפילו רומן, כי זיהוי מטרות שימושי להיות מאתגר, אם לא בלתי אפשרי. לכן, מספר כלים בארגז גנומית של WCR צריך ניתן להרחיב באמצעות פיתוח שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור זנים מוטציה יציב ולאפשר סקרים עצמאית רצף הגנום WCR. במסמך זה, אנחנו פירוט האמצעים שננקטו כדי לאסוף microinject precellular WCR עוברי עם חומצות גרעין. בעוד הפרוטוקולים המתוארים בזאת מכוונים היצירה של WCR מהונדס, עריכה CRISPR/Cas9-הגנום יכול גם להתבצע תוך שימוש באותם הפרוטוקולים, כאשר ההבדל היחיד הוא ההרכב של הפתרון מוזרק העוברים.
מבוא
תירס המערבית rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, היא הדברה חשובים של תירס1. מעניין, WCR מופיע כדי להתגבר על שליטה מודד במהירות רבה יותר מאשר מזיקים החקלאי ביותר מאז הם לא רק להתאים מבחינה פיזיולוגית, אלא גם בהתנהגותו2,3,4,5, 6. בעשור האחרון, RNA הפרעה (RNAi), כלי רב-עוצמה פונקציונלי גנומית נחקר כשיטה בקרה פוטנציאליים עבור7,WCR8, ו גם שימש כאמצעי ללמוד ג'ין פונקציה9. אולם, בעוד RNA....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. המושבה ברמת לגידול של מבוגרים WCR
- בכמות ובאיכות של מבוגרים WCR (500-1000) ממעבדת החברה או מחקר אמין (ראו טבלה של חומרים לדוגמה) ומניחים בתוך כלוב3 30 ס מ.
הערה: השימוש זן הלא-diapausing מומלץ בחום. - הכנת מזון מלאכותי WCR ע פ הפרוטוקול של היצרן ויוצקים שכבה בעובי של ס מ 1 לתוך מיכל עוז 38 (ראה טבלה של חומרים). לאחר ערבוב, לאחסן דיאטה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.
- לשים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם דיאטה למבוגרים (10-15 גרם) לתוך כלוב3 30 ס מ. הוסף עוד דיאטה כאשר המזון הוא נמוך או יבש.
- לשים בקבוקון (300 מ ל) עם מים, מכוסה עם כדור צמר גפן, אשר משמש כדי להחזיק במקום גליל כותנה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיקול חשוב בעת פיתוח פרוטוקול זה היה השלב של התפתחות בזמנו של microinjection. באופן ספציפי, טרנספורמציה germline דורש microinjection של DNAs לפני cellularization עובריים. זה בגלל DNAs לא יכול בקלות לחצות את קרום התא. ניסיונות כדי להמחיש את שלבי ההתפתחות עובריים WCR בעזרת כתם גרעיני היו לא מוצלח כי dechorionation של העוברים WCR במהותה מתמוסס כל בקרום מגן אחראי השלמות של העובר. עם זאת, קו חקירה זה היה הללו על ידי קושי נוסף – רכישת כמויות מספיקות של עוברי מבעוד. בשדה, WCR הנקבות מטילות את בי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות microinjection של WCR עם dsRNAs לצורך RNAi כבר דווח על9, זהו הפרוטוקול הראשון להקים מומלצות microinjecting precellular WCR עוברי, תהליך קריטי עבור ניצוח germline שינוי ו/או הגנום CRISPR/Cas9 עריכה של מין זה. Microinjection מוצלחת של WCR עוברי הוא תלוי בגורמים רבים, וכן יעילות טרנספורמציה. בהמשך הם בחלק מן הנושאים העיקריים להשפיע על התוצאה של שימוש בפרוטוקול זה לשינוי germline לחיפושית הזאת.
קבלת עוברי precellular
כפי שהוזכר לעיל, ה-DNA לא עובר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של התוכנית מחקר מונסנטו ידע Rootworm תירס, מעניק מספר AG/1005 (ל MDL, שיקו לוי) וקרנות סטארט-אפ ל MDL מן NCSU. FC נתמכה על ידי מענקים של מונסנטו תירס Rootworm ידע תכנית המחקר (AG/1005), הקרן הלאומית למדע, להעניק מספר MCB-1244772 (MDL). המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים. FC ו- MDL נוצר ועוצב הניסויים; FC, PW ו- SP לבצע את הניסויים; FC ו- MDL ניתח את התוצאות; FC, נג ו- MDL כתב היד. אנו מודים תרזה אולירי, ויליאם Klobasa, סטפני גורסקי על סיוע מומחה שלהם הקרנה WCR. אנו מודים גם ד ר צרפתי וייד (USDA-ARS, צפון מעבדת המחקר החקלאי המרכזי, ברוקינגס, SD) עבור משלוחים ביצים להקים מושבות מעבדה, מתן פרוטוקולי גידול.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נייר סינון איכותי (שחור) | Ahlstrom | 8613-0900 | עבור הזרקת מיקרו ביצה |
| 1 oz מיכלים | כלי שולחן מפלסטיק של אנני | ASET101 | מיכל ביצים |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | מצע לכלי הטלת ביצים WCR |
| מלקחיים במשקל נוצה | Bioquip | 4748 | טיפול בזחלים וגלמים |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | לשטוף תירס וכלים |
| האהוב על נהג משאית Yellow | Coor Farm Supply | 502 | תירס להאכלת |
| מערכת מיקרו-הזרקה WCR (תוצרת בית) | NA חלקים והוראות זמינים על פי בקשה | שולט בלחץ ההזרקה (0-20 psi) | |
| הדבק הלא רעיל של Elmer's | Elmer's Products, Inc. | E304 | דבק ביצים על נייר סינון |
| epTIPS טיפים למיקרו-טוען | אפנדורף | C2554691 | מילוי חוזר טיפים לטעינת מחט |
| פלקון כלי תרבית רקמות | פלקון | 25383-103 | הנבטת תירס /150 x 25 מ"מ |
| פישרברנד מעגלי נייר סינון בדרגה כמותית | פישר סיינטיפיק | S47576C | הכנת צלחת אגר להטלת ביצים/9 ס"מ |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | לשטוף כלים |
| שקופיות מיקרוסקופ רגיל | פישר סיינטיפיק | 12-549-3 | החזקת נייר סינון וביצים למיקרו-הזרקה |
| תולעת שורש תירס מערבית עם תחליף אבקה | מדעי החקלאות | F9766B | WCR תזונה מלאכותית למבוגרים |
| כדורי צמר גפן, גדול | Genesee Scientific | 51-101 | סגור את הבקבוק |
| גלובוס מדעי 3.0 מ"ל פיפטות העברת נורה קטנה | גלובוס מדעי | 137035 | איסוף והעברת ביצים |
| Leica M165 FC סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי | Leica | M165 FC | הקרנת WCR |
| סט מסננים DsRed לסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי | Leica | DSR | מסנן עירור: 510-560 ננומטר, מסנן פליטה: 590-650 ננומטר |
| מסנן EGFP | Leica | GFP2 | מסנן עירור: 440– 520 ננומטר, מסנן פליטה: 510 ננומטר |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | כלוב למושבה למבוגרים |
| מברשת צבע מיניאטורית | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| מיקרומניפולטור ג'ויסטיק | Narishige | MN-151 | מיקרומניפולטור ומחזיק מחט |
| מיקרוסקופ XY שלב | אולימפוס | 265515 | מיקרוסקופ שלב (מותאם לשימוש עם סטריאוסקופ) |
| כיתה 90 בד גבינה | חנות בדים מקוונת | CHEE90 | להטלת |
| ביצה סרט פרפין מפלסטיק | אריזות פלסטיק Pechiney | PM-996 | צלחת אגר חותם לאחר מיקרו-הזרקה/גודל גליל 4 אינץ' x 125 רגל |
| חממת | Percival Percival | I41VLH3C8 | תא גידול WCR (אינקובטור לגידול חרקים) |
| צלוחיות Erlenmeyer צרות פה | VWR | 4980-300-PK | מיכל מים למושבה בוגרת |
| כוסות גריפין בצורה נמוכה | VWR | 1000-600-PK | לשטיפת ביצים |
| לחמניות כותנה קלועות | ריצ'מונד כותנה שיניים ושות'. | 605-3599 | שימוש באספקת מים למושבה בוגרת |
| צלחות פטרי (35x10 מ"מ) | SIGMA | CLS430588-500EA | לצלחות דיאטה |
| פנול אדום | סיגמא | 143-78-8 | מאגר מיקרו-הזרקה |
| מושך מיקרופיפיט מבוסס לייזר | מכשיר סאטר | P-2000/G | מושך מחט / חום = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| קרקע עליונה פרימיום | חברת סקוטס | 71130758 | אדמה לגידול |
| קרוניםReloc Zippit 2 מיל שקיות רוכסן | תאגיד הפלסטיק של ארצות הברית | 48342 | שקית צלחת אגר לאחר מיקרו הזרקה/5x7 |
| צלחות פטרי (100x15 מ') | VWR | 89038-968 | הכנת צלחת אגר להטלת ביצים / 100 x 15 מ"מ |
| 6 אונקיות מיכלים | Webstaurantstore | 128E506 | WCR תא הזדווגות זוג יחיד |
| 38 אונקיות מיכלים | Webstaurantstore | 128NC888 | קופסת גידול זחלים/38 אונקיות |
| ChoiceHD 16 אונקיות מיכל מעדנייה מפלסטיק שקוף למיקרוגל | Webstaurantstore | 128HRD16 | קופסת גידול זחלים/16 אונקיות |
| מיקרו הזרקה היקף | היקף מיקרו-הזרקה | של Wild Heerbrugg | WILD-M8 |
| נימי זכוכית סטנדרטיים | מכשירים מדויקים בעולם | 1B100F-4 | מחטי מיקרו-הזרקה |
| תולעי שורש תירס מערביות בוגרות צפון | מרכז מחקר מחקר מעבדה | זן שאינו דיאפאאז | בקשה מהמעבדה של ד"ר בריאן ווייד פרנץ' |
| ערכת מידי DNA פלסמיד | Qiagen | 12143 | טיהור DNA פלסמיד מוכן להזרקה |
מקורות
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
