הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57497

⸱

27 באפריל 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

תקציר

Rootworm תירס המערבי (WCR) המזיק חשוב של תירס והיא ידועה בשל יכולתו להסתגל במהירות אסטרטגיות ניהול בפשט. למרות התערבות ב RNA (RNAi) הוכיח להיות כלי רב עוצמה עבור לימוד הביולוגיה WCR, יש המגבלות. באופן ספציפי, RNAi עצמו הוא חולף (כלומר לא תגרום לטווח ארוך התורשה של פנוטיפ המשויך), וזה דורש לדעת את רצף ה-DNA של הגן היעד. האחרון יכול להיות הגבלת אם פנוטיפ עניין נשלטת על ידי גנים שנשמרת לקוי, או אפילו רומן, כי זיהוי מטרות שימושי להיות מאתגר, אם לא בלתי אפשרי. לכן, מספר כלים בארגז גנומית של WCR צריך ניתן להרחיב באמצעות פיתוח שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור זנים מוטציה יציב ולאפשר סקרים עצמאית רצף הגנום WCR. במסמך זה, אנחנו פירוט האמצעים שננקטו כדי לאסוף microinject precellular WCR עוברי עם חומצות גרעין. בעוד הפרוטוקולים המתוארים בזאת מכוונים היצירה של WCR מהונדס, עריכה CRISPR/Cas9-הגנום יכול גם להתבצע תוך שימוש באותם הפרוטוקולים, כאשר ההבדל היחיד הוא ההרכב של הפתרון מוזרק העוברים.

מבוא

תירס המערבית rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, היא הדברה חשובים של תירס1. מעניין, WCR מופיע כדי להתגבר על שליטה מודד במהירות רבה יותר מאשר מזיקים החקלאי ביותר מאז הם לא רק להתאים מבחינה פיזיולוגית, אלא גם בהתנהגותו2,3,4,5, 6. בעשור האחרון, RNA הפרעה (RNAi), כלי רב-עוצמה פונקציונלי גנומית נחקר כשיטה בקרה פוטנציאליים עבור7,WCR8, ו גם שימש כאמצעי ללמוד ג'ין פונקציה9. אולם, בעוד RNAi מבוצע לעתים קרובות על ידי microinjection של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) בחיות אחרות, מבוססת על הזרקת RNAi הוא נדיר WCR. למעשה, ישנם רק כמה דיווחים של RNAi באמצעות microinjection של dsRNA לתוך WCR9. הסיבה היא כי WCR יכולים להשיג גבוהה-רמות של ג'ין תמונות ציפורים באמצעות בליעה של dsRNA7,10, אפילו המתיר את חקר תופעות עובריים מאכילים dsRNA אמא11. בעוד ששיטה זו עושה WCR נושא מצוין עבור אנליזה גנומית פונקציונלית ויה RNAi, זה הואטה ההתקדמות על פיתוח מתודולוגיות עובריים microinjection במין זה.

למרות כוחו של RNAi, ישנם כמה חסרונות. לדוגמה, לא כל הגנים להגיב באותה מידה RNAi. ההשתנות יכול להפוך לפרש את התוצאות של לסיבי assay קשה יותר. בנוסף, RNAi הוא חולף, אינו יוצר מוטציות heritable. מצד שני, germline טרנספורמציה, עוד כלי גנומית תפקודית, ניתן ליצור מוטציות heritable באמצעות החדרת טרנספוזון מסומן לתוך הגנום12,13. זה עושה את השינוי germline כלי מצוין ליצירת זנים מוטציה לשימוש במחקרים גנטיים לטווח ארוך. השינוי יכול לשמש גם כדי להציל מוטציה על ידי מסירת עותק פונקציונלי של הגן הגנום מוטציה14. יתר על כן, השינוי germline היא אבן הפינה של מגוון רחב של טכניקות גנטיות מולקולריות. בנוסף לדפוק ו/או הצלת תפקוד הגן, טרנספורמציה germline יכול לשמש משפר השמנה15, ג'ין השמנה16, המבוסס על Gal4 ביטוי חוץ רחמי17של הגנום כולו מוטגנזה מכוונת18.

לאחרונה, פותחו כלים המאפשרים עריכה מתוחכמת הגנום. כלים אלה כוללים שעתוק Activator-Like אפקטור Nucleases (TALEN), CRISPR/Cas9-נוקלאז מערכת19,20. היתרון של כלים חדשים אלה הוא בכך שהם מציעים החוקרים את היכולת לגרום להפסקה DNA גדילי כפול כמעט בכל מקום בתוך כמעט בכל הגנום. ברגע המושרה, הפסקות אלה ניתן לתקן באמצעות אחד מהקצוות שאינם הומולוגיים הצטרפות, אשר יכול להציג מחיקות או הוספות בגן יישוב, או באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה, אשר בנוכחות לבנות מהונדסים, יכולים לעודד החלפה של גנים כולו או אזורים גנטיים21,22. עם זאת, שיטות אלה דורשים microinjection של ה-DNA, RNA או החלבון לתוך עוברי צעיר מאוד.

חשוב, בניגוד dsRNAs המשמש RNAi, חומצות גרעין וחלבונים המשמשים germline שינוי ועריכה הגנום לא יכול בקלות לחצות קרום התא. לכן, microinjection של פלסמיד DNAs, mRNAs, ו/או חלבונים חייב להתבצע במהלך השלב syncytial blastoderm (דהיינו לפני העובר חרקים cellularizes). זה הופך התזמון של זריקות גורם קריטי. לדוגמה, ב- דרוזופילה melanogaster, העוברים צריך להיות מוזרק בתוך שעתיים אחרי ביצה שכבה12. לפיכך, פיתוח פרוטוקול microinjection עובריים מוצלח עבור WCR חייב לקחת בחשבון את התנאים הטובים ביותר להטלת הביצית, כמו גם השיטה הטובה ביותר לאיסוף כמויות מספיקות של עוברי precellular.

מאמץ להביא מגוון רחב של כלים גנטיים על ביולוגיה WCR דורש פיתוח שיטות איסוף של microinjecting precellular WCR עוברי. כאן אנו מספקים הוראות מפורטות, יחד עם טיפים וטריקים, לעזור לאחרים להשתמש בטכניקות מבוססות-טרנספורמציה במחקר WCR. ומאריכים הטרנסגניים טכנולוגיות כדי WCR לשימוש פונקציונלי גנומית מחקרים, טכניקות אלו מאפשרים גם עוצמה אסטרטגיות שליטה חדשות המזיק כגון גנים נסיעה23,24 ייבדק בזה כלכלית המזיק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. המושבה ברמת לגידול של מבוגרים WCR

  1. בכמות ובאיכות של מבוגרים WCR (500-1000) ממעבדת החברה או מחקר אמין (ראו טבלה של חומרים לדוגמה) ומניחים בתוך כלוב3 30 ס מ.
    הערה: השימוש זן הלא-diapausing מומלץ בחום.
  2. הכנת מזון מלאכותי WCR ע פ הפרוטוקול של היצרן ויוצקים שכבה בעובי של ס מ 1 לתוך מיכל עוז 38 (ראה טבלה של חומרים). לאחר ערבוב, לאחסן דיאטה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.
  3. לשים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם דיאטה למבוגרים (10-15 גרם) לתוך כלוב3 30 ס מ. הוסף עוד דיאטה כאשר המזון הוא נמוך או יבש.
  4. לשים בקבוקון (300 מ ל) עם מים, מכוסה עם כדור צמר גפן, אשר משמש כדי להחזיק במקום גליל כותנה (6 "x" 3/8), כדי לשמש כמקור מים. להחליף את המים כאשר הוא פועל נמוכה.
  5. לשמור על WCR בטמפרטורה 26 ° C עם 60% לחות, מחזור 14:10 אור חרק חממה לגידול.

2. העובר אוסף ויישור

  1. להפוך תא איסוף ביצים באמצעות אגר 1% במים סטריליים 100 x 15 מ"מ2 פטרי. לאחסן ב 4 ° C לאחר עפור אגר.
  2. לאסוף ביצים הניח שזה עתה, מניחים שכבה אחת של נייר סינון, ואחריו 4 שכבות של גזה (כל חתך לגודל) על פני השטח של אגר (איור 1 א').
    הערה: גזה הניתנים לשימוש חוזר, לאחר שטף של אקונומיקה, בלוק, אבל זה לא הכרחי כדי לעשות את זה עבור השימוש הראשון. נייר סינון לא חוזר, אינו צריך להיות מעוקר.
  3. מניחים ביצה וספרייט לכלוב WCR מאוחר ביום ככל האפשר (בסוף יום העבודה) ולכסות עם אוהל נייר כסף. להשאיר למשך הלילה.
    הערה: נתקל האורות השעות 10:00 לביצה עיכובים 12 בבוקר (14 h) הנחת, למוצא האוסף של הצעיר ביצים עבור microinjection ללא צורך אנשי המעבדה למקם את האוסף קאמרית כלוב מאוחר בלילה.
  4. להסיר תא איסוף ביצים בסביבות 8 או 9 בבוקר
  5. להשתמש מלקחיים לאסוף שכבה 1 של גזה זמן ומקום ב גביע (500 מ"ל) מים. לשטוף ביצים ממני אריג מרושת על ידי בעדינות ערבוב (איור 1B וג 1).
  6. להשתמש על פיפטה הנורה כדי להעביר ביצים עוד גביע (500 מ"ל) מים. חזור על x 2-3 כדי לנקות את הביצים.
  7. להשתמש את הנורה פיפטה להעביר ביצים על גבי נייר סינון (איור 1D) תוך צמצום כמות המים carry-over.
  8. חתוך שחור מסנן נייר לרצועות רחב כמו שקופיות זכוכית ואת הסרט בחוזקה אל השקופית כדי לוודא הנייר מניח שטוח (איור 2 א).
    הערה: נייר סינון שחור מסייע לשפר את הראות תחת המיקרוסקופ על-ידי הפחתת כמות האור המוחזר.
  9. החלת דבק רעיל (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ) על נייר הסינון של קווים עדינים (איור 2B). שמור את הקווים דבק דק יותר הקוטר של ביצה. כדי להימנע מקבלת את הביצים מצופה דבק.
  10. השתמש במברשת בסדר כדי להניע בעדינות WCR ביצים אחת של נייר סינון שלהם לקו דבק. נסו להניח את הביצים על הדבק לפני וזה מייבש ולשמור על ביצה אחת לפחות של המרחק בין כל ביצה.
  11. למקסם יעילות הזרקת על ידי הצבת מספר שורות של ביצים בשקופית אחת נייר סינון (איור 3).
  12. לאחר כל הביצים נפרסות על נייר הסינון, המתן עד כל שהדבק מתייבש לפני microinjection.
    הערה: שינוי germline ולקבלת הגנום CRISPR/Cas9-מתווכת, עריכה, להזריק כל העוברים עד הצהריים (12 P.M.) כך העובר הבכור הוא בן יותר מ- 19 h. עם זאת, עבור RNAi, יש ללא מגבלה של זמן, כי ב- WCR, dsRNA יכול לעבור בין תאים. למעשה, עבור RNAi, העוברים יישון עשוי להתבטא טוב יותר שיעורי ההישרדות.

3. הכנת פלסמיד DNAs, מחטים הזרקת

  1. להכין דנ א פלסמיד supercoiled באיכות גבוהה תוך שימוש מסחרי ללא אנדוטוקסין קיט (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ).
  2. כדי להכין את הפתרון הזרקה, לבדוק את ריכוז כל פלסמיד ולאחר מכן לשלב המסייע פלסמיד (250 ריכוז סופי ng/µL), תורם פלסמיד (750 ריכוז סופי ng/µL), מאגר פנול אדום (ריכוז סופי של 20%). מערבולת הפתרון בקצרה, צנטריפוגה במשך 3 דקות במהירות המרבית, כדי לזרז חלקיקים יכול לסתום את המחט.
  3. משוך זכוכית בורוסיליקט מחטים (יתר 1 מ"מ, זיהוי 0.58 מ"מ, 10 ס מ אורך) באמצעות פולר micropipette סוג של חום/הבוערים. לאחסון, לאבטח מחטים משך דו-צדדית קלטת דביק צלחת פטרי או אחרים מיכל ברורה.
    הערה: עבור מערכת פולר micropipette, ההגדרות המשמשות היו: חום = 335, FIL = 4, ול = 40, דל = 200, דופק = 100.
  4. מילוי המחט הזרקת באמצעות מיקרו-העובדים עצה (ראה טבלה של חומרים) כדי pipet 0.5 - 1.0 µL למטה בתוך המחט, ליד הקצה מחודדות. הסר בועות קצה המחט אם כל להתרחש.
  5. הכנס את המחט הזרקה בעל מחט.
  6. פתח את קצה המחט על-ידי שבירת בעדינות עם זוג נאה מלקחיים, או בעדינות לגעת/גרירת הקצה בשקופית coverslip או זכוכית.
    הערה: המטרה היא המזח הקטן ביותר שמאפשר את התמהיל הזרקת לצאת החוצה (פתחים קטנים יותר בדרך כלל דורשות הזרקה בלחץ גבוה יותר). מחטים משופעים ואינם דורשים שלב זה מאז הם כבר פתוחים.

4. microinjection והטיפול שלאחר הזרקה

  1. שימוש במכחול בסדר, בזהירות רטוב המשטח של 1-3 ביצים עם מים סטריליים את המחט, להזריק את הפתרון. להזריק כל ביצה לפני השטח מתייבש. חפשו את המראה כמות קטנה של צבע אדום בתוך ביצים במהלך ההזרקה כדי לציין את microinjection מוצלח. לרסק או להסיר את כל הביצים נראה פגוע, ריק, או אחרת לא יכול להיות מוזרק.
    הערה: למרות הזרקה בלחץ משתנה בהתבסס על גודל נשא מחט, 10-13 psi הוא נקודת התחלה טובה.
  2. לאחר כל הביצים מוזרקים, להסיר את נייר סינון השקופית זכוכית.
  3. מניחים נייר הסינון על פני השטח של צלחת אגר 1% (המתואר לעיל).
  4. השתמש פרפין פלסטיק הסרט החותם את המנה, ותשים חרק 26 ° C לגידול חממה במשך 12 יום.
    הערה: הסרט פרפין תסייע למנוע זיהום עובש בין הצלחות. עם זאת, כל טיפול אחר למניעת התפתחות חיידקים ולעצב יכול להפחית את ההישרדות של העוברים מוזרק.

5. culturing וגדלים של עוברי

  1. הפעלת בדיקת העוברים 12 ימים שלאחר הזרקת עבור הזחלים שזה עתה בקעו ולהמשיך מדי יום במשך השבועיים.
  2. להעביר את הזחלים, בעזרת מברשת בסדר, לתיבת rearing עם נבט התירס ואדמה.
    הערה: עובש יכול לגדול לתוך המנה אגר, אך הזחלים יבקעו עדיין ברוב המקרים. חפשו את הזחלים בזהירות בתוך כייר לתפוס את כולם. הזחלים קצת אולי להעביר המכסה של המנה, אולי נתקע עיבוי.
  3. אחורי הזחלים בטמפרטורה 26 ° C בעקבות תקן WCR לגידול בשיטות25.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיקול חשוב בעת פיתוח פרוטוקול זה היה השלב של התפתחות בזמנו של microinjection. באופן ספציפי, טרנספורמציה germline דורש microinjection של DNAs לפני cellularization עובריים. זה בגלל DNAs לא יכול בקלות לחצות את קרום התא. ניסיונות כדי להמחיש את שלבי ההתפתחות עובריים WCR בעזרת כתם גרעיני היו לא מוצלח כי dechorionation של העוברים WCR במהותה מתמוסס כל בקרום מגן אחראי השלמות של העובר. עם זאת, קו חקירה זה היה הללו על ידי קושי נוסף – רכישת כמויות מספיקות של עוברי מבעוד. בשדה, WCR הנקבות מטילות את בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות microinjection של WCR עם dsRNAs לצורך RNAi כבר דווח על9, זהו הפרוטוקול הראשון להקים מומלצות microinjecting precellular WCR עוברי, תהליך קריטי עבור ניצוח germline שינוי ו/או הגנום CRISPR/Cas9 עריכה של מין זה. Microinjection מוצלחת של WCR עוברי הוא תלוי בגורמים רבים, וכן יעילות טרנספורמציה. בהמשך הם בחלק מן הנושאים העיקריים להשפיע על התוצאה של שימוש בפרוטוקול זה לשינוי germline לחיפושית הזאת.

קבלת עוברי precellular
כפי שהוזכר לעיל, ה-DNA לא עובר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של התוכנית מחקר מונסנטו ידע Rootworm תירס, מעניק מספר AG/1005 (ל MDL, שיקו לוי) וקרנות סטארט-אפ ל MDL מן NCSU. FC נתמכה על ידי מענקים של מונסנטו תירס Rootworm ידע תכנית המחקר (AG/1005), הקרן הלאומית למדע, להעניק מספר MCB-1244772 (MDL). המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים. FC ו- MDL נוצר ועוצב הניסויים; FC, PW ו- SP לבצע את הניסויים; FC ו- MDL ניתח את התוצאות; FC, נג ו- MDL כתב היד. אנו מודים תרזה אולירי, ויליאם Klobasa, סטפני גורסקי על סיוע מומחה שלהם הקרנה WCR. אנו מודים גם ד ר צרפתי וייד (USDA-ARS, צפון מעבדת המחקר החקלאי המרכזי, ברוקינגס, SD) עבור משלוחים ביצים להקים מושבות מעבדה, מתן פרוטוקולי גידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נייר סינון איכותי (שחור)Ahlstrom8613-0900עבור הזרקת מיקרו ביצה
1 oz מיכלים כלי שולחן מפלסטיק של אנניASET101מיכל ביצים
Drosophila Agar Type IIApex66-103מצע לכלי הטלת ביצים WCR
מלקחיים במשקל נוצה Bioquip4748טיפול בזחלים וגלמים 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770לשטוף תירס וכלים
האהוב על נהג משאית YellowCoor Farm Supply502תירס להאכלת
מערכת מיקרו-הזרקה WCR (תוצרת בית)NA חלקים והוראות זמינים על פי בקשהשולט בלחץ ההזרקה (0-20 psi)
הדבק הלא רעיל של Elmer'sElmer's Products, Inc.E304דבק ביצים על נייר סינון
epTIPS טיפים למיקרו-טועןאפנדורףC2554691מילוי חוזר טיפים לטעינת מחט
פלקון כלי תרבית רקמותפלקון25383-103הנבטת תירס /150 x 25 מ"מ
פישרברנד  מעגלי נייר סינון בדרגה כמותיתפישר סיינטיפיקS47576Cהכנת צלחת אגר להטלת ביצים/9 ס"מ
SparkleenFisher Scientific04-320-4לשטוף כלים
שקופיות מיקרוסקופ רגילפישר סיינטיפיק12-549-3החזקת נייר סינון וביצים למיקרו-הזרקה
תולעת שורש תירס מערבית עם תחליף אבקהמדעי החקלאות F9766BWCR תזונה מלאכותית למבוגרים
כדורי צמר גפן, גדולGenesee Scientific51-101סגור את הבקבוק
גלובוס מדעי 3.0 מ"ל פיפטות העברת נורה קטנהגלובוס מדעי137035איסוף והעברת ביצים
Leica M165 FC סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי LeicaM165 FC הקרנת WCR
סט מסננים DsRed לסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaDSRמסנן עירור: 510-560 ננומטר, מסנן פליטה: 590-650 ננומטר
מסנן EGFPLeicaGFP2מסנן עירור: 440– 520 ננומטר, מסנן פליטה: 510 ננומטר
BugDormMegaView ScienceDP1000_5Pכלוב למושבה למבוגרים
מברשת צבע מיניאטוריתMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
מיקרומניפולטור ג'ויסטיקNarishigeMN-151מיקרומניפולטור ומחזיק מחט
מיקרוסקופ XY שלבאולימפוס265515מיקרוסקופ שלב (מותאם לשימוש עם סטריאוסקופ)
כיתה 90 בד גבינהחנות בדים מקוונתCHEE90להטלת
ביצה סרט פרפין מפלסטיק אריזות פלסטיק PechineyPM-996צלחת אגר חותם לאחר מיקרו-הזרקה/גודל גליל 4 אינץ' x 125 רגל
חממתPercival Percival I41VLH3C8תא גידול WCR (אינקובטור לגידול חרקים)
צלוחיות Erlenmeyer צרות פהVWR4980-300-PKמיכל מים למושבה בוגרת 
כוסות גריפין בצורה נמוכהVWR1000-600-PKלשטיפת ביצים
לחמניות כותנה קלועותריצ'מונד כותנה שיניים ושות'.605-3599שימוש באספקת מים למושבה בוגרת 
צלחות פטרי (35x10 מ"מ)SIGMACLS430588-500EAלצלחות דיאטה
פנול אדוםסיגמא143-78-8מאגר מיקרו-הזרקה
מושך מיקרופיפיט מבוסס לייזרמכשיר סאטרP-2000/Gמושך מחט / חום = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
קרקע עליונה פרימיוםחברת סקוטס71130758אדמה לגידול
קרוניםReloc Zippit 2 מיל שקיות רוכסןתאגיד הפלסטיק של ארצות הברית48342שקית צלחת אגר לאחר מיקרו הזרקה/5x7
צלחות פטרי (100x15 מ')VWR89038-968הכנת צלחת אגר להטלת ביצים / 100 x 15 מ"מ
6 אונקיות מיכליםWebstaurantstore128E506WCR תא הזדווגות זוג יחיד 
38 אונקיות מיכליםWebstaurantstore128NC888קופסת גידול זחלים/38 אונקיות
ChoiceHD 16 אונקיות מיכל מעדנייה מפלסטיק שקוף למיקרוגלWebstaurantstore128HRD16קופסת גידול זחלים/16 אונקיות
מיקרו הזרקה היקף היקף מיקרו-הזרקהשל Wild HeerbruggWILD-M8
נימי זכוכית סטנדרטייםמכשירים מדויקים בעולם1B100F-4מחטי מיקרו-הזרקה
תולעי שורש תירס מערביות בוגרות צפוןמרכז מחקר מחקר מעבדהזן שאינו דיאפאאזבקשה מהמעבדה של ד"ר בריאן ווייד פרנץ'
ערכת מידי DNA פלסמידQiagen12143טיהור DNA פלסמיד מוכן להזרקה
גבול מצויד בשלב XY

מקורות

  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629(2011).
  3. Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
  4. Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
  5. Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
  6. Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
  7. Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  8. Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
  9. Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162(2010).
  10. Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
  11. Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
  12. Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
  13. Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
  14. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
  15. O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
  16. Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
  17. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  18. Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
  19. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  20. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  21. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  22. Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
  23. Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
  24. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  25. Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
  26. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
  27. Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
  28. Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
  29. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  30. Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
  31. Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
  32. Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
  33. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
  34. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
  35. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11(2007).
  36. Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.