למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט את assay מוטציה cII למדא בחר בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. גישה זו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים.

Abstract

מספר מודלים בבעלי חיים מהונדס, מערכות זיהוי המוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים, בחר למבדה (λ) cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור למדא בחר cII מוטציה וזמינותו, אשר ניתן להחיל על תאים בתרבית של העכברים הטרנסגניים/חולדות או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: (1) בידוד של דנ א גנומי מתאי או איברים/רקמות חיות הטרנסגניים שטופלו חוץ גופית או ויוו, בהתאמה, תרכובת מבחן; (2) שחזור של וקטור הסעות למדא נושא גן כתב mutational (כלומר, cII transgene) של ה-DNA גנומי; (3) אריזה של הווקטורים שניצלו לתוך bacteriophages זיהומיות; (4) להדביק חיידקים המארח ו culturing בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר הפצת מוטציות המושרה cII ; (5) הקלפים של cII-מוטציות ו- DNA רצף ניתוח כדי לקבוע את תדירות מוטציה cII ואת הספקטרום מוטציה, בהתאמה.

Introduction

מגוון רחב של מודלים בבעלי חיים מהונדס ומערכות איתור מוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים Big Blue (המכונים להלן BB), בחר λ cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצה זו רבים אחרים מחקר קבוצות ברחבי העולם^{1,2, 3,4,5,6,7,8,9}. במשך 16 השנים האחרונות, חקרנו את ההשפעות המוטגניות של סוכנים כימ....

Protocol

1. הדנ א בידוד מן העכבר מתחלקים Fibroblasts

הערה: העכבר הראשי fibroblasts עובריים הם מבודדים מעוברים שמקורם העכברים הטרנסגניים BB עם רקע גנטי C57BL/6, על פי פרוטוקול שפורסמו⁵³. חומר המוצא עבור פרוטוקול זה מורכב עונה 1 פרק 10⁶ עונה 1 פרק 10⁷ תאים עובריים פיברובלסט שטופלו מבחן מתחם מול פקד. קציר וספירה של תאים אלה תוך שימוש בשיטות הרגילות מתוארים הפניות-^10,-^54,-⁵⁵.

1. הכנת מאגר של (0.3 M סוכרוז 60 מ מ אשלגן כלורי, 15 מ מ NaCl, 60 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, spermidine 0.5 מ מ, 0.15 מ מ spermine,....

Results

בהתאם לנתונים הפצה, בדיקות פרמטרית או שאינם פרמטרי משמשים כדי לקבוע את המשמעות של הבדל בשכיחות מוטציה cII בין קבוצות הטיפול ושליטה (קרי, המושרה לעומת תדרים מוטציה ספונטנית) . השוואה של התדרים מוטציה המושרה cII קבוצות טיפול שונה נעשית על ידי שונים (pairwise) בדיקות סטטיסטיות, לפי הצורך. המבחן ההיפר-גיאומטרית של אדמס ו- Skopek משמש בדרך כלל כדי להשוות את ספקטרום מוטציה המושרה, ספונטני הכולל⁵⁷, למרות בדיקות אחרות, כגון χ² המבחן או.......

Discussion

Λ cII בחירה וזמינותו משמש לצורך זיהוי של מוטציות transgene cII התאוששה הדנ א הגנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות של BB מכרסמים³. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכילה עותקים של וקטור הסעות λLIZ chromosomally משולב, אשר נושאת את cII טנדם (294 bp) ו לצי (1,080 bp) transgenes, כמו גנים כתב mutational^{1, 2 , 25}. λ cII בחירה וזמינותו מבוסס על האחזור של הווקטורים הסע.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אגר	MO מעבדות ביו, בע"מ	12112-05	בקטריולוגית
BigDye Terminator v3.1 ערכת ריצוף מחזור	Thermo Fisher Scientific	4337455	ללא
קזאין פפטון	אלפא Aesar	H26557	ללא
ג'לטין	J. T. Baker	2124-01	אבקת
גליצרול	פישר סיינטיפיק	BP 229-1 / M-13750	ללא
LB אגר	פישר סיינטיפיק	BP 9724-500	ללא
QIAquick PCR ערכת טיהור	Qiagen	8104	50 תגובות טיהור PCR
נתרן אצטט טריהידרט	פישר סיינטיפיק	M-15756	None
Taq5000 DNA פולימראז	Qiagen	201207	None
תיאמין הידרוכלוריד	מקרון Fine Chemicals	2722-57	None
Transpack אריזת תמצית	Stratagene Corp., נרכשה על ידי BioReliance | חברת סיגמא-אולדריץ'	200223	50 תגובות אריזה
Tris Base	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	None
Trypton	Biosciences	RC-110	None