כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חוזר palindromic באופן קבוע interspersed (CRISPR) - CRISPR - באשכולות קשורה חלבון 9 (Cas9) מערכת הגנה החיסון מסתגלת prokaryotic יש כבר גייס בתור כלי רב עוצמה עבור הנדסה מדויקת הגנום האיקריוטים. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה באמצעות מדריך בודד chimeric RNAs (sgRNA) ו- CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) עבור הדור יעיל ומדויק של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. אנו מתארים צינור בחירת היעד sgRNA, עיצוב התבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexing ו משלוח של אסטרטגיה genotyping המאפשרת זיהוי מהיר ועמיד חיות הערוך בצורה נכונה. הגישה שלנו מאפשרת הדור נתיישב וזיהוי של הנקודה הרצויה גנומית חיות אלא גם מקלה על האיתור של אללים אחרים מורכבים ויאסין כ 4-5 ימים עם יעילות גבוהה, עומס עבודה מופחתת ההקרנה.
מבוא
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות טרנספורמציה באופן קיצוני, האיצו את היכולת בדיוק מהנדס הגנום. בפרט, המערכת CRISPR-Cas9, אשר מסתמך על endonuclease מונחה RNA Cas9 לזירוז הפסקה גדיל כפול (DSB) ליד הרצף היעד עניין, בהרחבה שימש לתכנן במדויק את הגנום של רוב האורגניזמים מודל בשימוש מחקר ביו1,2,3,4. באופן משמעותי, השימוש CRISPR-Cas9 נעול הגנום עריכה אפילו במינים קשה כמו C. elegans5. בין המינים, יצירת מוטציות נקודה עם הגנום CRISPR-Cas9 המבוסס על מערכת עריכה מתבסס על שלושה רכיבים מרכזיים: 1) Cas9 endonuclease, 2) RNA מדריך....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני בעקבות המנחה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת מישיגן. להשתמש בפתרונות נטולת RNase, פיפטה טיפים לאורך כל הפרוטוקול. לנקות את אזור העבודה פיפטות, צינורות, צנטריפוגה עם פתרון טיהור RNase לבצע את ההנחיות יצרן (ראה טבלת חומרים).
1. sgRNA בחירת היעד
- באמצעות דפדפן אינטרנט, פתח את דף האינטרנט: http://crispor.tefor.net8
- קלט ~ 60 בסיסים (bp) של רצף איגוף ערוך הרצוי של עניין (כלומר 30 bp 5' ו 3' של עריכה הרצוי).
- בחר את הגנום Caenorhabditis elegans מתוך התפריט הנפתח. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מוטציות בגן האנושי סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) בחשבון של משפחתית נוירודגנרטיביות, מחלה ניווניות הרסנית שמוביל תמיד לשיתוק ומוות17~ 10-20%. סופראוקסיד דיסמוטאז אנושי-1 הוא חלבון שנשמרת אבולוציונית שיתוף דמיון זהות ו- 70%-55% עם החלבון השתילות-1 C. elegans (איור 1B). כדי להדגים את הפשטות, כדאיות ויעילות של הגישה מבוססת-CRISPR-Cas9 RNP, שסימנו את הגן C. elegans השתילות-1 כדי להציג את הגרסה הקשורים למחלה G93A הא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מערכת CRISPR-Cas9 הוא כלי חזק ואפקטיבי בדיוק שינוי הגנום של מודל אורגניזמים. . הנה, נדגים שאת chimeric sgRNAs20 יחד עם ssODN HDR תבניות לזמינה הדור יעילה במיוחד של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. חשוב לציין, נדגים כי משלוח RNP מייצרת יעילות העריכה גבוהה כאשר קרינה פלואורסצנטית משמש כסמן בחירה משותף, המדגיש את נוחות ואמינות של הטכניקה.
הרוב המכריע של שיטות CRISPR-Cas9 C. elegans הגנום הנדסה להסתמך על רקע גנטי מסוים או co-CRISPR אסטרטגיות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אנו מודים לחברי של המעבדה Beg לקריאה ביקורתית של כתב יד זה. זנים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחקר במעבדה Beg הוא נתמך על ידי מענקים NIH (R01 NS094678), ניוון שרירים האגודה (MDA382300) כדי A.A.B.
תודות
ישנם שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | כימרי sgRNA | |
| נטול נוקלאז TE | Synthego Inc. | מסופק עם ערכת sgRNA ערכת | |
| מים ללא נוקלאז | Synthego Inc. | מסופק עם ערכת sgRNA ערכת | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR תבנית | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | טכנולוגיות DNA משולבות | 1078728 | חלבון Cas9 |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mדובדבן סמן פלסמיד |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA נקי & רכז | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean ג'ל שחזור DNA ערכת Zymo | Research | D4002 | |
| Q5 התחלה חמה נאמנות גבוהה 2X Master Mix | ניו אינגלנד Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| זכוכית בורוסיליקט זכוכית מיקרופיפטות | Sutter | Instruments BF100-78-10 | OD: 1.0 מ"מ. מזהה: 0.78 מ"מ |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decooling | Solution Fisher Scientific | AM9780 |
מקורות
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
