מאמר שיטה

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

30 באפריל 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

תקציר

חוזר palindromic באופן קבוע interspersed (CRISPR) - CRISPR - באשכולות קשורה חלבון 9 (Cas9) מערכת הגנה החיסון מסתגלת prokaryotic יש כבר גייס בתור כלי רב עוצמה עבור הנדסה מדויקת הגנום האיקריוטים. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה באמצעות מדריך בודד chimeric RNAs (sgRNA) ו- CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) עבור הדור יעיל ומדויק של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. אנו מתארים צינור בחירת היעד sgRNA, עיצוב התבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexing ו משלוח של אסטרטגיה genotyping המאפשרת זיהוי מהיר ועמיד חיות הערוך בצורה נכונה. הגישה שלנו מאפשרת הדור נתיישב וזיהוי של הנקודה הרצויה גנומית חיות אלא גם מקלה על האיתור של אללים אחרים מורכבים ויאסין כ 4-5 ימים עם יעילות גבוהה, עומס עבודה מופחתת ההקרנה.

מבוא

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות טרנספורמציה באופן קיצוני, האיצו את היכולת בדיוק מהנדס הגנום. בפרט, המערכת CRISPR-Cas9, אשר מסתמך על endonuclease מונחה RNA Cas9 לזירוז הפסקה גדיל כפול (DSB) ליד הרצף היעד עניין, בהרחבה שימש לתכנן במדויק את הגנום של רוב האורגניזמים מודל בשימוש מחקר ביו1,2,3,4. באופן משמעותי, השימוש CRISPR-Cas9 נעול הגנום עריכה אפילו במינים קשה כמו C. elegans5. בין המינים, יצירת מוטציות נקודה עם הגנום CRISPR-Cas9 המבוסס על מערכת עריכה מתבסס על שלושה רכיבים מרכזיים: 1) Cas9 endonuclease, 2) RNA מדריך יחיד (sgRNA) שמנתב את Cas9 endonuclease רצף המטרה ולאחר 3) משתמש מעוצב תבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) המכילה את edit(s) הרצוי של הריבית2.

ישנן מספר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי להציג את sgRNA ואת Cas9 מיקוד נוקלאז לתוך תאים כולל פלסמיד, RNA נגיפי המבוסס על משלוח שיטות6. לאחרונה, מסירה ישירה של טרום-ומורכבת sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) התפתחה ככלי רב עוצמה ויעיל הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי עריכה7. מסירה ישירה של טרום-ומורכבת RNPs CRISPR-Cas9 יש מספר יתרונות ברורים, כלומר: 1) RNPs לעקוף את הצורך הסלולר תמלול, תרגום, 2) RNPs נמחקים במהירות, אשר עשוי להגדיל ירידה לפרטים על-ידי הפחתת הזמן הפנוי את המטרה המחשוף ו- 3) RNPs מכילים גורמים זרים אין DNA/RNA אשר עוקף המבוא של רצפים שאינם ילידי לתוך הגנום מארח באמצעות שילוב אקראי. יחד, סביר תכונות אלה מספקות פרץ קצר של--יעד CRISPR עריכה תוך מזעור תופעות את המטרה.

אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור שינויים בייעודי לאתר גנומית C. elegans. פרוטוקול זה כולל מיקוד sgRNA oligonucleotide תקועים יחיד (ssODN) HDR תבנית, sgRNA-Cas9 RNP complexing ו משלוח, ועיצוב אסטרטגיה genotyping לצורך זיהוי חד משמעי של חיות ערוכה כראוי. באמצעות אסטרטגיה זו, לא רק השינויים הרצויים בייעודי לאתר ניתן לשחזר, אבל גם עשוי להיות התאושש מוטציות ויאסין שאינם ספציפיים אחרים. לפיכך, האסטרטגיה שלנו מאפשרת את הדור של סדרות allelic באמצעות אסטרטגיה אחת, שם הן מונו-allelic, דו-allelic, ויאסין מוטציות יכול להיווצר דור1 F.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני בעקבות המנחה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת מישיגן. להשתמש בפתרונות נטולת RNase, פיפטה טיפים לאורך כל הפרוטוקול. לנקות את אזור העבודה פיפטות, צינורות, צנטריפוגה עם פתרון טיהור RNase לבצע את ההנחיות יצרן (ראה טבלת חומרים).

1. sgRNA בחירת היעד

  1. באמצעות דפדפן אינטרנט, פתח את דף האינטרנט: http://crispor.tefor.net8
    1. קלט ~ 60 בסיסים (bp) של רצף איגוף ערוך הרצוי של עניין (כלומר 30 bp 5' ו 3' של עריכה הרצוי).
    2. בחר את הגנום Caenorhabditis elegans מתוך התפריט הנפתח.
    3. בחר את מוטיב סמוך Protospacer (20 bp-הגולה - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) מתוך התפריט הנפתח.
    4. לחץ על שלח. בדף התוצאות, לבחור את רצף המטרה מדורגת העליון הקרוב ערוך עניין. אם אין אתרי יעד מתאים תוך איגוף 60 bp לרצף הקלט, להרחיב את רצף שאילתה ל-100 bp (כלומר 50 bp צדי הרצוי עריכה).
  2. ממקור זמין, למשל synthego, להשיג sgRNA יעד של 20-מר עם המפרט הבא: 3 nmol; אין לערוך שינויים.
  3. עם קבלת, צנטריפוגה sgRNA lyophilized המכילה צינור-> g 12,000 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף µL 60 של טה נטולת נוקלאז הצינור ולאחר בעדינות להשעות מחדש על-ידי pipetting למעלה ולמטה 15 - 20 פעמים באמצעות פיפטה P200. הריכוז הסופי הוא 50 מיקרומטר.

2. הומולוגיה מכוון לתיקון תבנית עיצוב

  1. עיצוב של ssODN HDR תבנית המכילה: 1) מוטציה של הריבית, 2) אתר ייחודי endonuclease הגבלה במסגרת, 3) מוטציה שקטה של אחת או שתיהן Gs בתוך הרצף הגולה פאם והזרועות 4) 50 bp 5' ו 3' הומולוגיה איגוף המוטציה הראשונה והאחרונה. (איור 1C) 9 , 10.
    1. אם המוטציה של הרצף פאם הגולה אינו אפשרי, להציג 5-6 מוטציות שקטות בתוך הרצף sgRNA זיהוי המטרה למנוע בתיווך sgRNA המחשוף של התבנית HDR ssODN.
  2. ממקור זמין, למשל idtdna, להשיג "oligonucleotide Ultramer DNA" עם הפרמטרים הבאים: קנה מידה: 4 nmol; ניסוח: כלום; טיהור: Desalting רגיל.
  3. עם קבלת, צנטריפוגה ssODN lyophilized המכילה צינור-> g 12,000 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות מחדש להשעות ssODN כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר ddH נטולת נוקלאז2O על ידי pipetting למעלה ולמטה 15 - 20 פעמים באמצעות פיפטה P200.

3. עיצוב Genotyping תחל

  1. עיצוב פריימר להגדיר איגוף השינוי הגנום לייצר ~ 400-700 bp PCR אמפליקון11.
  2. למטב את תנאי הרכיבה PCR כדי לייצר אמפליקון יחיד, מדויקת11.

4. מכינים תערובת הזרקה

  1. צנטריפוגה ריאגנטים טבלה 1 -מהירות מירבית למשך 2 דקות ב 4 º C.
  2. לפי הסדר הרשום, להוסיף טבלה 1 ריאגנטים צינור PCR נוקלאז-חופשית.
  3. לערבב ביסודיות על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים עם P20 פיפטה.
  4. דגירה הזרקת מיקס 10 דקות בטמפרטורת החדר.

5. הזרקת פרוטוקול

  1. עומס הזרקת micropipette עם חצי אחד של הזריקה לערבב12. שמור שנותרו לערבב הזרקת במקרה שהמחט הזרקת שסותם או שובר.
  2. לשבור עצה micropipette כך p.s.i. ~ 20-30 מייצרת פתרון זורם12הדרגתית.
    הערה: טיפים בקוטר גדול יותר באופן שלילי משפיעים על בריאות בעלי חיים ולא להקטין F1 רומא התשואה.
  3. להזריק 10-15 צעירים תולעים בוגרות בשני הידיים האשכים במידת האפשר12. אם לא, הזרקה לתוך זרוע האשכים אחת מספיקה.
  4. לאפשר מוזרק לבעלי חיים (P0) להתאושש במשך 1-2 h בטמפרטורת החדר בצלחת מדיה (NGM) נמטודות צמיחה מתחילה OP50 35 מ מ. לאחר מכן, יחיד מוזרק P0 לבעלי צלחות NGM בודדים מתחילה OP50 35 מ"מ באמצעות תולעת חוט פלטינה לבחור12.

6. צלחות0 המסך P ו- s1יחיד mCherry(+) F

  1. יומיים לאחר זריקה, לזהות P0 הצלחות המכיל F1 רומא לבטא mCherry ב הלוע באמצעות stereomicroscope של פלורסנט (איור 1D, יום 2 - 3). בחרו 3 P0 לוחות המכילים את רוב mCherry(+) F1 בעלי החיים.
  2. מכל שלוש נבחרות P0 הצלחות, יחידה 8-12 mCherry(+) F1 חיות בסך 24-36-mCherry(+) F-1-s באמצעות תולעת לבחור (איור 1D, יום 2 - 3).
    הערה: חיות mCherry(-) יכול גם שיוציאו מן הלוחיות P0 , אך ההסתברות של זיהוי כראוי נערך חיות הרבה נמוך (איור 2 א).
  3. לאפשר בודדים s1F self-fertilize, להטיל ביצים במשך 1-2 ימים בטמפרטורת החדר.

7. יחיד תולעת PCR ו- Genotyping

  1. לאחר 1-2 ימי להטלת ביצים, להעביר את ה-F1s לתוך בודדים PCR רצועת צינור כמוסות המכילות µL 7 תולעת פירוק המאגר באמצעות איסוף תולעת (טבלה 2, איור 1D, ביום 4-5).
  2. צנטריפוגה המבחנות במהירות המרבית עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להביא חיות לתחתית הצינור, ומקפיאים צינורות ב-80 מעלות צלזיוס עבור 1 h.
    הערה: תולעים ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן.
  3. Lyse תולעים קפואות thermocycler באמצעות התוכנית הבאה: 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, להחזיק 4 ° C.
  4. הגדרת ה-PCR mastermix כפי שמוצג בטבלה3.
  5. להוסיף µL 21 של PCR mastermix המבחנות נקי, ולאחר מכן להוסיף 4 µL של תולעת פירוק משלב 3. מערבבים היטב בעזרת פיפטה ולהפעיל PCR התוכנית לבצע את ההנחיות יצרנים (ראה טבלת חומרים).
  6. לטהר תגובות PCR באמצעות ערכת ה-DNA נקי ולהתרכז, ביצוע ההוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). Elute DNA על-ידי הוספת 10 µL מים על העמודה ספין.
  7. הגדרת אנזים הגבלה mastermix כפי שמוצג בטבלה4.
  8. להוסיף 10 µL של mastermix אנזים הגבלה כל התגובה PCR נקי, תקופת דגירה של 1-2 h ב- 37 ° C13.
  9. נפרדים מתעכל PCR מוצרים ב- 1.5% agarose ג'ל לרוץ במהירות 120 V באמצעות 1 x טריס-אצטט-EDTA (טה) מאגר14.

8. זיהוי ואימות רצף של חיות הערוך

  1. לבחון דגימות אנזים מתעכל לנוכחות של להקות להצביע על פוטנציאל נערך חיות14 (איור 1D, ביום 4-5).
    הערה: טען פקד N2 לזהות מוטציות ויאסין פוטנציאליים אשר יכול להיות שנצפו כמו משמרות במידה ו/או עיכול אנזים הגבלה בלתי צפויים ומורכבים פסים דפוסי.
  2. לאחר זיהוי חיות שנערכו פוטנציאליים, להשתמש את µL 3 הנותרים של תולעת פירוק וחזור על התגובה ה-PCR. אסור לנקות או אנזים הגבלה לעכל את תגובת ה-PCR בסיום התוכנית. לטעון את תגובת ה-PCR על ג'ל agarose 1%, נפרד ולחלץ את הלהקה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל15 (ראה טבלת חומרים).
  3. סנגר רצף16 הג'ל מופק הדנ א באמצעות ומהצמיגים F1 כדי לזהות חיות הערוך בצורה נכונה (איור 1 א')
    הערה: Heterozygote קריאות יכיל בשכבות פסגות בשל נוכחותם של הסוג הפרוע ומתוכננים אלל.
  4. כדי לקבל חיות homozygous מחיות מאומת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים הערוך, יחידה 8-12 F2 חיות ולבצע שלבים 7-8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מוטציות בגן האנושי סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) בחשבון של משפחתית נוירודגנרטיביות, מחלה ניווניות הרסנית שמוביל תמיד לשיתוק ומוות17~ 10-20%. סופראוקסיד דיסמוטאז אנושי-1 הוא חלבון שנשמרת אבולוציונית שיתוף דמיון זהות ו- 70%-55% עם החלבון השתילות-1 C. elegans (איור 1B). כדי להדגים את הפשטות, כדאיות ויעילות של הגישה מבוססת-CRISPR-Cas9 RNP, שסימנו את הגן C. elegans השתילות-1 כדי להציג את הגרסה הקשורים למחלה G93A הא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת CRISPR-Cas9 הוא כלי חזק ואפקטיבי בדיוק שינוי הגנום של מודל אורגניזמים. . הנה, נדגים שאת chimeric sgRNAs20 יחד עם ssODN HDR תבניות לזמינה הדור יעילה במיוחד של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. חשוב לציין, נדגים כי משלוח RNP מייצרת יעילות העריכה גבוהה כאשר קרינה פלואורסצנטית משמש כסמן בחירה משותף, המדגיש את נוחות ואמינות של הטכניקה.

הרוב המכריע של שיטות CRISPR-Cas9 C. elegans הגנום הנדסה להסתמך על רקע גנטי מסוים או co-CRISPR אסטרטגיות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אנו מודים לחברי של המעבדה Beg לקריאה ביקורתית של כתב יד זה. זנים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחקר במעבדה Beg הוא נתמך על ידי מענקים NIH (R01 NS094678), ניוון שרירים האגודה (MDA382300) כדי A.A.B.

תודות

ישנם שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.כימרי sgRNA
נטול נוקלאז TESynthego Inc.מסופק עם ערכת sgRNA ערכת
מים ללא נוקלאזSynthego Inc.מסופק עם ערכת sgRNA ערכת
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR תבנית
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSטכנולוגיות DNA משולבות1078728חלבון Cas9
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mדובדבן סמן פלסמיד
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA נקי & רכזZymo ResearchD4004
Zymoclean ג'ל שחזור DNA ערכת ZymoResearchD4002
Q5 התחלה חמה נאמנות גבוהה 2X Master Mixניו אינגלנד BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
זכוכית בורוסיליקט זכוכית מיקרופיפטותSutterInstruments BF100-78-10OD: 1.0 מ"מ. מזהה: 0.78 מ"מ
Trizma HydrochlorideSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap DecoolingSolution Fisher ScientificAM9780
EZEZ

מקורות

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C eleganssgRNAssODN HDRmCherry

מאמרים קשורים