פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
עם השכיחות הגוברת של סרטן הערמונית, זיהוי של הגידול מנהלי התקנים חדשים או מאפננים היא קריטית. מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) עבור סרטן הערמונית מונעים על ידי גידול הטרוגניות ואת הדינמיקה שלה microevolution מורכבים. סרטן הערמונית המסורתית העכבר דגמים הכוללים, בין השאר, germline, הסתרה מותנה, ביטוי הטרנסגניים oncogenes ומודלים xenograft. דור של מוטציות דה נובו מודלים אלה הוא מורכב, זמן רב ויקר. בנוסף, רוב המודלים המסורתיים יעד הרוב המכריע של האפיתל הערמונית, ואילו האדם סרטן הערמונית הוא ידוע להתפתח ארוע בודד ברק תת קבוצה קטנה של תאים. מודלים יקר צריך לדמות לא רק סרטן הערמונית חניכה, אלא גם סדר מחלה מתקדמת.
כאן נתאר שיטת למטרה מספר תאי האפיתל הערמונית על ידי תאים transducing על ידי נגיפים. המשלוח של וירוס מהונדס הערמונית מאתר מאפשרת שינוי של ביטוי גנים epithelia הערמונית. וירוס סוג וכמות בזאת יגדירו את מספר תאים ממוקדות עבור שינוי גנטי על ידי transducing כמה תאים לטקס החניכה סרטן ותאים רבים עבור ריפוי גנטי. באמצעות הזרקת המבוסס על ניתוח באונה הקדמי, דיסטלי מן המסלול בדרכי השתן, הגידול במודל זה ניתן להרחיב מבלי ופוגע הפונקציה השתן של החיה. יתר על כן, על ידי מיקוד רק ערכת משנה של הערמונית תאים אפיתל הטכניקה מאפשר משובט הרחבה של הגידול, ולכן מחקה גידול אנושי חניכה, התקדמות, כמו גם פלישה דרך קרום הבסיס.
טכניקה חדשנית זו מספק מודל חזק סרטן הערמונית עם שיפור הרלוונטיות פיזיולוגיים. סבלם של בעלי החיים היא מוגבלת, שכן אין גידול נוסף נדרש, מונה בסך הכל בעלי חיים מצטמצם. באותו הזמן, ניתוח של גנים מועמדים חדשים מסלולים היא מואצת, וזה בתורו עלות גבוהה יותר יעיל.
מבוא
זיהוי וטיפול בסרטן הערמונית השתפרו משמעותית בעשור האחרון. ובכל זאת, השכיחות של סרטן הערמונית עולה, בעקבות תוחלת החיים. משוערת 1.1 מיליון מקרים חדשים ברחבי העולם, זה בין הסיבות הנפוצות ביותר של מוות מסרטן גברים 1. סרטן הערמונית הוא איטי בהתפתחות שלו, אך כאשר הסרטן התפתחה למצב גרורתי מתקדם, הפרוגנוזה הוא עני בשל אפשרויות הטיפול מוגבל. עד כה, רק כמה גנים זוהו מנהלי התקנים נפוצים ב סרטן זה, ופוגע שלה הטרוגניות, multifocality זיהוי של סמנים ביולוגיים, מחלת targetable מנהלי התקנים2,3.
לטכניקות GEMMs ביצירת הם לעיתים קרובות לקוי על ידי המורכבות שלהם, הוצאות בזמן ועלויות. מודלים נוקאאוט מותנה היה בשימוש נרחב לחקר סרטן הערמונית המועמד גנים, כי התוצאה עובריים קטלני כאשר לא פעיל ב germline4. הדגמים הנפוצים ביותר לערב של recombinase Cre ספציפיים הערמונית מושפעת גם ששונה Probasin5 או מקדם6 PSA משולב של GEMM על ידי הצלב מטלטלין נוספים. דגמים אלה, הגן עניין יהיה ממוקד ברוב המכריע של הערמונית תאים אפיתל, יצירת היפרפלזיה האיבר כולו, אשר עשוי לפגום של החיה בדרכי השתן פונקציה7.
משלוח ויראלי של החלבון Cre בזריקה לתוך האונה הקדמי של הערמונית מאתר ניתן לפתור בעיה זו על ידי מיקוד רק תאים מספר8. התחשבות דרישות טכניות מעבדות, מומחיות, מטרות, יתרונות שיטת מקשת רחבה של ווריאציות אפשריות. גישות מוצלחת ניצול אדנו מיקוד JunB , Pten9 או Lentivirus מיקוד Pten ו- Trp5310 הוכחו בין השאר. הוספת transgenes, כגון לוציפראז, הבונה ויראלי או GEMM את יתר על כן תאפשר פולשני ניטור של התקדמות המחלה באמצעות ביולומינסנציה הדמיה11.
הגנום עריכה מבוסס על טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מגלה הזדמנות חדשה ומהירה ללמוד סרטן באמצעות יצירה מהירה של הסתרה סומאטית12. משלוח ויראלי של מדריך בודד RNAs (sgRNAs) למזהים ייחודיים של האונה הקדמי של הערמונית מאתר יוצר מודל פיזיולוגית רלוונטיים יותר של סרטן הערמונית. בכך תאים בודדים נשיאת מוטציות שבחרת יכולים ליצור שיבוטים מסוגלים התפשטות ופלישה. יתר על כן, השימוש מדריך RNAs עבור גנים יעד מרובים יפיק שיבוטים תאים עם שינויים בגנים שונים. פעולה זו תאפשר גידול הטרוגניות, לחץ הברירה הטבעית על התקדמות סרטן, אשר יכול לחשוף את החשיבות של כל שינוי גנטי או מנגנונים epistatic.
כאן אנו מציגים שיטה להעביר נגיפים הערמונית מאתר עבור שינוי של ביטוי גנים. בטן חתך קטן, האונה הערמונית הקדמי מאתר חשוף, נגיפים מוזרקים לתוך האונה. חמישה ימים לאחר הניתוח, ניתוח קליפים ניתן להסיר מן העור, ניתן לנתח את סרטן הערמונית מ- 8 שבועות לאחר. בסך הכל, זה הליך מהיר וחסכוני, יש השפעה קטנה על העכבר ומאפשר הגידול גדול יותר לפתח מבלי להתפשר על העכבר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה כרוך הליך כירורגי של עכברי מעבדה. ניסויים בבעלי חיים כל חייב להיות בנפרד נבדקו ואושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC). כמו הגישה מבוססת על שחזור בעלי חיים, הישרדות, ודא ההרדמה המתאימה לניהול כאב, סביבה כירורגי aseptic בכל עת. השתמש כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה במהלך הניתוח ועד ההתאוששות מן ההרדמה.
1. הפעלת שיקולים
- בהתאם הנגיף שימש, דרישות כייל נוגדנים שונים עשויים לחול; לדלל את הוירוס בהתאם.
הערה: בדוגמה זו, וירוס Adeno-הקשורים בלתי מדולל ב- PBS מוזרק ב כייל של עונה 1 פרק 10-12 IU/mL. הנגיף מכיל מדריך RNA Pten , ביטוי של חלבונים Cre תחת promotor אוביקוויטין (איור 1), ויש serotype 9. אובדן Pten גדל pAKT והתפשטות של האפיתל של הערמונית13. - השתמש עכברים זכרים בגיל 8 שבועות בזמנו של ניתוח כדי להבטיח פיתוח הערמונית נאותה.
הערה: עכברים הראו בניסוי זה הם עכברים knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP על רקע C57BL/6J12 (איור 1). - טרי להכין תערובת הרדמה כללית, אם אפשר שיהיה סטרילי.
הערה: עבור שחזור בעלי חיים טוב יותר לאחר הניתוח, תרופת הרדמה מומלץ מאוד.- כדי להכין את הנפח הכולל של הרדמה 5 מ"ל, מערבבים 0.15 מ ל medetomidine הידרוכלוריד (1 מ"ג/מ"ל), midazolam 0.4 מ ל (5 מ"ג/מ"ל) ו 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) עם 4.2 mL סטרילי מים מלוחים.
הערה: ניתן להשתמש שיטות הרדמה חלופי, כמו איזופלוריין נשימים, על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים. - כדי להפוך את האפקט של medetomidine הידרוכלוריד לאחר הניתוח, מערבבים atipamezole 0.1 מ"ל (5 מ"ג/מ"ל) עם 4.9 מ ל מים מליחים סטרילי.
- כדי להכין את הנפח הכולל של הרדמה 5 מ"ל, מערבבים 0.15 מ ל medetomidine הידרוכלוריד (1 מ"ג/מ"ל), midazolam 0.4 מ ל (5 מ"ג/מ"ל) ו 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) עם 4.2 mL סטרילי מים מלוחים.
- להכין סביבה כירורגי aseptic מאת נכונה חיטוי ועיקור. אוטוקלב מכשירי ניתוח לפני השימוש.
2. וירוס-משלוח הערמונית מאתר
- עזים ומתנגד החיה על ידי זריקה בקרום הבטן עם מזרק עקר 1 מ"ל, מחט 27G x ½". השתמש מנה הרדמה של 0.01 מ ל/גרם משקל. אם ההליך נמשך יותר מ 30 דקות, לשמור על הרדמה על ידי הזרקת מנה 1/3 של ההתחלה כל 30 דקות.
- בדוק את עומק הרדמה על-ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגה פדלים, רפלקסים palpebral. כאשר אובדן רפלקסים נצפית, לגלח את הבטן התחתונה של החיה.
- בזהירות לכסות את העיניים של החיה עם וטרינרי משחה אופטלמולוגיות באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי כדי למנוע עיוורון עקב חוסר רפלקס המצמוץ.
- נגב את הבטן מגולח עם 70% אתנול וביו -10% povidone יוד לחטא את האזור הכירורגי. לשפשף את האזור הכירורגי במרכז האזור כירורגי לעבר הפריפריה.
- לבצע חתך אנכי העור בקו האמצע בבטן נמוך של 1 ס מ בעזרת מספריים כירורגי סטרילי.
- הרם את הצפק באמצעות מלקחיים הצבע בסדר כדי למנוע פגיעה האיברים הן הנחת מתחת. בזהירות לעשות חתך < 8 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיים דרך הצפק.
הערה: בניגוד אנושית, בלוטת הערמונית של מכרסם כוללת ארבע אונות נפרדים. האונה הקדמי מחוברת של שלפוחית הזרע. - להניע בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע. באמצעות מלקחיים טבעת, בזהירות להרים שלפוחית הזרע עד הקדמי הערמונית יכולה להיות מזוהה (איור 1).
- תזריק את הנפח הכולל של פתרון וירוס (3 x 1010 חלקיקים נגיפיים) µL 30 קדמי האפיתל הערמונית באמצעות מזרק אינסולין 0.5 mL עם מחט 30G x 8 מ מ. למזער את זליגת ולהבטיח שהנוזל נספג בתוך הרקמה, ויצרו בועה קטנה. מקם את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן.
- תפר של הצפק עם תפרים קטע פשוט 2-3, 6-0 נספגים באמצעות של 13 מ מ, 3/8 circle ו מחט להתחדד לנקודה.
- סיכת הידוק העור עם 3 קליפים סטרילי 4.8 x 6.5 מ"מ הרמת העור עם מלקחיים כדי למנוע נזק של הצפק.
- להתאוששות טובה יותר, החל תרופת הרדמה במנה של 0.01 מ ל/גרם משקל בזריקה בקרום הבטן באמצעות מזרק עקר 1 מ"ל ו מחט 27G x ½". בזהירות המקום האחורי חיות בכלוב שלו.
3. לאחר הניתוח נהלים
- שמור את הכלוב עם עכברים נותח על משטח חימום עבור 1 h לאחר הניתוח, כדי למנוע היפותרמיה עד החלים לחלוטין. אם הנוגדן מוחל, החיה צריך להיות ער, דקות ספורות לאחר ההזרקה.
- לפקח על החיות מדי יום עבור אינדיקציות ריפוי וכאב הפצע המתאים. במידת הצורך, לנהל משככי כאבים נוספים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.
- להסיר סרטונים העור אחרי 4-5 ימים, לאחר הפצע סגור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להעריך וירוס משלוח הערמונית מאתר, דגימות נותחו 3 חודשים אחרי הניתוח. עכברים Rosa26-LSL-Cas9-EGFP12 מבטאים את ה-GFP בתאים נחשפו Cre לחלבון מבוטא על ידי הוירוס. הדגימות הערמונית נבחנו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות כדי לזהות אזורים עם GFP אות (איור 2 א). האות ה-GFP מציין פעילות Cre האפיתל הערמונית אבל לא אם ג'ין עריכה יש כבר המושרה על ידי מדריך CRISPR. Immunohistochemical מקטעים הראה תחומי פעילות של תאים עם ביטוי גבוהה של pAKT (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשנות ביטוי גנים באונה הקדמי של הערמונית מאתר באמצעות הזרקת וירוס, יצירת מודל חזק עכבר חדש עבור סרטן הערמונית (איור 2). ניהול מוצלח אדנו תוארה לראשונה על ידי Leow et al. . ב- 2005-8. בעבר הראינו איך קידוד אדנו Cre recombinase חלבון יכול להחליף גוזלת זמן בין מטלטלין של אלל Cre רקמות ספציפיות מחיקה 9 (איור דו-ממדי). מאז הנגיף מדביק תאים מספר9, מודל זה מח...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מר מומן על ידי התחברות של האגודה למלחמה בסרטן הדני (R146-A9394-16-S2). MFB ו MKT היו ממומן על-ידי AUFF נובה (AUFF-E-2015-FLS-9-8). מר MFB משותפת, במימון בית הספר, בריאות, AU. המעבדה E.F.W. נתמך על ידי מענקים ממשרד ספרדית של הכלכלה (SAF2015-70857, שותפה במימון על ידי ERDF-האיחוד האירופי), של ERC מתקדם גרנט (741888 - CSI-Fun).
אנחנו רוצים להודות ליליאנה Fajardo מלור (גנים, פיתוח ומחלות; לחקר הסרטן הלאומי) לקריאה ביקורתית של כתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ציוד | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J עכברים | מעבדת ג'קסון | 26175 | |
| 0,5 מ"ל U-100 מזרק אינסולין | BD | 324825 | להזרקת וירוסים |
| 1 מ"ל מזרק | BD | 300013 | להזרקת הרדמה |
| 30 גרם 1/2' ' מחט | BD | 304000 | להזרקת הרדמה |
| 6-0 תפר פוליסורב | מדטרוניק | GL889 | לסגירת הצפק |
| וילון ניתוח מעוקר חד פעמי מספר | ספקים | ||
| כרית חימום | מספר ספקים | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| זמירה מכונה | Aesculap | GT415 | לגילוח הבטן |
| מלקחיים Dumont | FST | 11252-00 | |
| מחזיק מחט מיקרו Halsey | FST | 12500-12 | |
| מספריים איריס | FST | 14094-11 | |
| מלקחיים דפוס צר | FST | 11002-12 | |
| מלקחיים טבעתיים | FST | 11106-09 | |
| ידית מערכת קליפ פצע כולל קליפסים | FST | 12030-01 | לסגירת העור |
| מסיר מערכת קליפ פצע | FST | 12030-04 | |
| מיקרוסקופ | Leica | נעשה שימוש בדגמים שונים | |
| <חזק>ריאגנטים | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | מתקבל ממתקן בעלי חיים | ||
| בוטאורפנול | שהושג ממתקן בעלי חיים | ||
| Medetomidinhydrochlorid | שהושג ממתקן בעלי חיים | ||
| Midazolam | שהושג ממתקן בעלי חיים | ||
| 100% אתנול | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| משחת עיניים | Takeda | 7242 | |
| וירוס (AAV, AV) | וירוס ספקים | המשמש בפרוטוקול זה הוא | |
| נוגדן pAKT | CST | 4060 | בשימוש 1:200 דילולציה |
| GFP anitbody | CST | 2956 | בשימוש 1:100 דילולציה |
מקורות
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
