הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57527

⸱

1 ביוני 2018

 ,  , 
1Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 3Howard Hughes Medical Institute and Laboratory of Sensory Neuroscience, The Rockefeller University

במאמר זה

סיכום

Organotypic תלת מימדי התרבויות של מאתר utricle, שבלול ב שטיחות נקה קולגן אני ג ' לים שימור רקמות מולדת מורפולוגיה לאפשר גירוי מכני באמצעות התאמה של מטריקס נוקשות, אישור המסירה הגן וירוס בתיווך.

תקציר

אברי החישה של האוזן הפנימית הם מאתגרים ללמוד אצל יונקים בשל הנגישות שלהם כדי מניפולציה ניסויית והתבוננות אופטי. יתר על כן, למרות שיטות חקלאות הקיים לאפשר לפליטת הביוכימי, שיטות אלה אינם מספקים אמצעי כדי לבחון את השפעות כוח מכני וקשיחות ברקמות במהלך הפיתוח של אברי החישה באוזן הפנימית. כאן נתאר שיטת organotypic תלת מימדי התרבות של utricle מאתר ללא פגע, שבלול מתגבר על מגבלות אלה. הטכניקה עבור התאמת מנדנד מטריקס תלת מימדי המתוארים כאן מאפשר מניפולציה של כוח אלסטי מנוגדות של רקמה. שיטה זו ולכן ניתן ללמוד את התפקיד של כוחות מכני במהלך הפיתוח באוזן הפנימית. בנוסף, התרבויות אישור המסירה הגן וירוס בתיווך, אשר יכול לשמש לניסויים רווח, הפסד-של-פונקציה. שיטה זו תרבות משמרת תאים שיער מולדת של תמיכה תאים, משמש חלופה מעולה שעשוי להיות לתרבות דו-ממדית מסורתית של איברי חישה שיווי המשקל ושמיעתיים.

מבוא

כבר בהנחייתם של המחקר של רוב ההיבטים של התפתחות האיברים בתרבית של מערכות במבחנה . שתי השיטות העיקריות המשמשים כיום עבור התרבות של איברי חישה שיווי המשקל: לתרשים1 וההכנות חסיד2 . שתי השיטות היתר החקירה של תא שיער פגיעויות3 והתחדשות1,4 בתוך חוץ גופית. בנוסף, יש התפקידים התפתחותית של דרגה5,6,7,ונ ט8, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR)9,10 איתות cascades באוזן הפנימית הוקם, בין השאר, באמצעות תרבויות במבחנה של epithelia חושית. עם זאת, צמיחת תאים ובידול נשלטים, לא רק באמצעות איתות על ידי אורגניזם, אלא גם דרך רמזים הפיזי ועל מכניים כגון אנשי קשר המערכת, את הנוקשות של מטריצה חוץ-תאית, ו מכני מתיחה או כיווץ. התפקיד של גירויים מכניים כזה הוא מאתגר לחקור ב האוזן הפנימית המתפתח בתוך vivo. יתר על כן, קיימות שיטות התרבות לתרשים חסיד אינם מתאימים כגון לימודי חוץ גופית בתוך. כאן נתאר שיטת לתרבות organotypic תלת מימד של קולגן אני ג ' לים של נוקשות בדרגות שונות. בשיטה זו במידה רבה שומרת על הארכיטקטורה ויוו של אברי החישה שיווי המשקל, שבלול, מאפשר חקירה של השפעות כוח מכני בהתפתחותם11.

מאחר גירויים מכניים ידועים כדי להפעיל אירועים מולקולריים במורד הזרם, כגון ההיפופוטם איתות לשביל12,13,14,15, חשוב להיות מסוגל לשלב בין גירוי מכני עם מניפולציות גנטיות הביוכימי. שיטת תרבות המתוארים כאן אישורי המסירה הגן וירוס בתיווך, ולכן ניתן ללמוד מכני וגם מולקולרית איתות במהלך פיתוח באוזן הפנימית11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של אוניברסיטת רוקפלר, של אוניברסיטת דרום קליפורניה.

1. (אופציונלי) הכנת קולגן אני הפתרון של הגידים Mouse-tail

הערה: קולגן אני פתרונות זמינים מסחרית. בצע הוראות היצרן להכנה ג'ל.

  1. המתת חסד 5-10 עכברים צעירים מבוגר (בן 3-5 שבועות) של כל זן פראי סוג עם פחמן דו חמצני לפי הפרוטוקול אושר על ידי ה הרלוונטיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש16. לאסוף את הזנב ולחטא אותם על ידי השוקע אתנול 70% למשך תקופה מינימלית של 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הדגירה במשך יותר מ 48 שעות יש להימנע, כפי שהוא מתבטא התייבשות יתר רקמת פוגעת תהליך החילוץ גיד.
  2. הסר את העור כל זנב על ידי היכרות עם חתך האורך עם להב סכין היציבה העור שלם עם מלקחיים. להעביר את זנבות עור צלחת פיטרי 100-מ מ מלא עם אתנול 70% נקי וחתכו אותם לחלקים 10 מ מ.
    הערה: למחוק את החלקים הדק של הזנבות, אשר קשה לתמרן.
  3. באמצעות מלקחיים, להבטיח שכל קטע של הזנב לתחתית הפטרי ולהשתמש זוג מלקחיים בסדר השני כדי לחלץ את הגידים זנב אחד בכל פעם. סיבי הגיד הפרט צריך להגיח עם התנגדות מינימלית.
    הערה: מלקחיים #5 הישן, משעמם עובד היטב עבור שלב זה.
  4. להכין 100 מ של פתרון 0.1% (לפי נפח) של חומצה אצטית במים סטרילי, ברמה המולקולרית ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון זה צלחת פטרי סטריליות 100-מ מ. להעביר את הגידים הפטרי, להשאיר לשעה בטמפרטורת החדר כדי denature הקולגן.
  5. השתמש מספריים אזמל או iridectomy סטרילי עם טיפים בוטה, מעוגל כדי מינצ הגיד לחלקים 1-2 מ מ. להעביר את הגידים טחון שפופרת 50-mL סטרילי ולהוסיף 0.1% חומצה אצטית להביא את אמצעי האחסון 50 מ.
    הערה: להשתמש ארבע או חמש זנבות על כל 50 מ ל חומצה כדי להשיג קולגן אני ריכוז של 2.0-2.5 מ"ג/מ"ל.
  6. להכניס למקרר הקולגן אני הפתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 48 שעות כדי להקל על דנטורציה של חלבונים מלאה. מערבולת עם מערבולת שולחן להגדיר את מהירות מקסימאלית עבור 1 דקות פעמיים ביום.
  7. למדוד את ריכוז חלבון הפתרון באמצעות וזמינותו חומצה bicinchoninic, להתאים את הקולגן אני ריכוז 2.0-2.5 מ"ג/מ"ל על-ידי הוספת 0.1% תמיסת חומצה אצטית, וחנות ב 4 º C.
    הערה: קולגן אני הפתרון ניתן לאחסן במשך שנה-שנתיים.
  8. (אופציונלי) Centrifuge הקולגן אני הפתרון ב- g x 2,000 עבור h 1-4 ° C ושימוש שקוף העליון השבר (כמחצית האחסון), כדי להשיג קולגן שטיחות ברור ג ' לים בסעיף 4.

2. ניתוח אברי שיווי המשקל ושמיעתיים

  1. המתת חסד עכברים בהריון של כל זן עם פחמן דו חמצני לפי הפרוטוקול אושר על ידי ה הרלוונטיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש16. לחלץ, לערוף את העוברים.
    הערה: Lfng-CreERT2/tdTomato עכברים יכול לשמש כדי לאפשר תיוג קבוע לתמוך תאים עם חשיפה ל 4-hydroxytamoxifen17.
  2. לעקר כל משטחי עבודה, כלי ניתוח, כולל שני זוגות של מלקחיים #5, הסכין שיער18, על-ידי ניקוי אותם עם 70% אתנול.
  3. פיצול כל ראש לשני חצאים על ידי הצגת חתך האורך עם להב האזמל סטרילי או באמצעות שני זוגות #5 מלקחיים. לחלץ עצמות הרקה, להכיל את לאוזניים הפנימיות19, ומניחים ל-15 מיליליטר של האנק כקרח מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) בצלוחית 60 מ מ. שמור את המנה על קרח.
    הערה: העוברים במגוון שלבים מ E13.5 כדי E18.5 שימשו בהצלחה.
  4. (אופציונלי) לשטוף לאוזניים הפנימיות על ידי בעדינות בטילטול 50 מ ל צינור חרוטי המכיל 30 מ ל קרה כקרח HBSS והחלפה של HBSS של שלוש או ארבע פעמים. שמור את הצינורית על קרח.
    הערה: שלב זה מגביל זיהום אפשרי של התרבות רקמות ומביא במהירות את הטמפרטורה עד 4 ° C, המונע מוות השפלה ותא רקמות.
  5. באמצעות שני זוגות של מלקחיים #5 בסדר, להפריד לאוזניים הפנימיות הרקה, להעביר את האוזניים, שלושה או ארבעה בכל פעם, לתוך צלחת פטרי 60 מ מ מלא HBSS קר כקרח.
  6. לנתח את אברי החישה שיווי המשקל.
    1. אוריינט הצד המדיאלי אוזניים למעלה ואתר את utricle. עם שני זוגות של מלקחיים #5, הסר את הסחוס המקיף של אברי שיווי המשקל. בעדינות סבר העצב vestibular, הקשר בין utricle את saccule, ואת התעלות semicircular, כפי שמוצג באיור1. משוך בעדינות את utricle, את אמפולות המצורפת של התעלות semicircular מעולה ואופקיים מהאוזן.
      הערה: שיטה זו יכולה לשמש על אוזניים הפנימיות של שלבי E16.5 - E18.5. לשמר את שברי סחוס בסעיף 3 להלן.
  7. לנתח שבלול.
    1. הסר את רקמות הסחוס המקיפים את האיבר שמיעה עם שני זוגות #5 מלקחיים. בעדינות לנתק את הקשר בין הבסיס שבלולי saccule כפי שמוצג באיור1.
      הערה: עבור שלבים E13.5 - E14.5, לרכך את הסחוס לפני ניתוח על ידי טיפול הפנימי אוזניים עם collagenase 0.25% אני בפתרון באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשמר את שברי סחוס בסעיף 3 להלן.
  8. שימוש pipet 200-µL מצויד טיפ רחב nonstick, להעביר את utricles ואת cochleae צלחת פטרי 30-מ מ מלא עם מדיום הגידול הכוללת DMEM/F12 בתוספת 33 מ מ Dglucose, 19 מ מ סודיום ביקרבונט, 15 מ מ 4(2hydroxyethyl)- חומצה 1piperazineethanesulfonic (HEPES) 1 מ"מ גלוטמין, 1 מ"מ nicotinamide, גורם הגדילה באפידרמיס 20 מ ג/ליטר, 20 מ ג/ליטר פיברובלסט גורם גידול, אינסולין 10 mg/L, transferrin 5.5 מ ג/ליטר, 5 µg/L סודיום סלניט.
  9. לשמור על ההכנות utricle עד 3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר ריפוי של קיצוץ האפיתל הציג במהלך הקרע. שבלול הכנות צריך להעביר את הג'ל קולגן 10 דקות לאחר הקרע.
    הערה: כי הקרע מבוצע ב HBSS קר כקרח, שאין אין צורך לחמם את מדיום הגידול כדי 37 מעלות צלזיוס.

3. (אופציונלי) להתאים קולגן אני ג'ל קשיחות על-ידי הוספת ריכוזים שונים של Chondrocytes

הערה: שיטת chondrocyte בידוד שונה מ- Gosset. et al. 20

  1. להכין פתרון 1% של collagenase אני עקר 1 x PBS וחנות 100-200 µL aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. הפשרה על קרח בעת הצורך, הימנעות מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה.
  2. מלקחיים בסדר להשתמש כדי לאסוף את השברים של הסחוס נשאר ניתוח אברי שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים 10-12. נפרד רקמות החיבור ואת האוזן הפנימית של הסחוס. להעביר את הסחוס צלחת פטרי 30-מ מ ולהוסיף 300 µL של מדיום הגידול סטרילי.
  3. השתמש האזמל סטרילי להב או iridectomy מספריים עם טיפים מעוקל בוטה לרכך את הרקמה כדי להשיג חתיכות הסחוס כ 0.5 מ מ אורך.
  4. להוסיף collagenase את המדיום עם סחוס כדי להשיג ריכוז האנזים הסופי של 0.25%. להעביר את המנה חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס בגז עם 5% פחמן דו-חמצני. Pipet נמרצות באמצעות pipet 1,000 µL כל 20 דקות עד חתיכות הסחוס מביצועם הם כבר לא ניתן להבחנה בפתרון, ואז תקופת דגירה של 20 דקות נוספות.
    הערה: במקרה של ההכנות utricle, בידוד chondrocyte יכול להתבצע במהלך שלב 2.9; זה לוקח כ 2 h (3-4 סיבובים pipetting).
  5. לאסוף את התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ולכוונן את העוצמה עד 10 מ"ל עם PBS x 1 סטרילי. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של PBS x 1 סטרילי. צנטריפוגה-g x 800 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.
    הערה: חשוב לשטוף את התאים פעמיים; כל collagenase הנותרים לעכל הקולגן שאני ג'ל.
  6. שימוש pipet 200-µL, להוסיף 100 µL של תרבות בינוני ה תא גלולה ל pipet בעדינות כדי resuspend. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולשמור אותם על קרח לפני השימוש.
  7. כדי להגביר את ג'ל קשיחות, להוסיף chondrocytes הקולגן ינוטרלו ג'ל פתרון (סעיף 1). ומערבבים במהירות כדי להפיץ את התאים לאורך כל הג'ל לפני התמצקות.
    הערה: הנפח של הקולגן אני ג'ל (מידת קשיחות), עולה באופן ליניארי עם מספר chondrocytes הוסיף11. הגומלין מתואר על ידי פונקציה לינארית השפעול נחוש E = 206· Nc + 15, שבו E הוא הנפח פסקל ומתגבר, Nc הוא המספר של chondrocytes במיליונים. עבור פרוטוקול מפורט עבור ג'ל קשיחות מדידות נא עיין במאמר המקורי11.

4. מניחים את האיבר חושית שיווי המשקל או שמיעתי ב קולגן שאני ג'ל

  1. צינור 1.5-mL סטרילי, להכין קולגן אני הפילמור פתרון על ידי ערבוב µL 160 ל- PBS x 10 עם מחוון ה-pH פנול אדום, 133 µL של 0.34 M נתרן הידרוקסידי, µL 70 של 0.9 M סודיום ביקרבונט µL 40 של 1 מ' HEPES. שמור את הצינורית על קרח.
    הערה: המתכון הזה מספק את הפתרון הפילמור דרושים כדי להכין 2 מ"ל של קולגן ג'ל, אבל ניתן לשנות לפי הצורך.
  2. מיקס 100 µL של פתרון פלמור, µL 400 של קולגן אני פתרון על הקרח על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה צינור 1.5-mL צוננת. כדי להגביר את ג'ל קשיחות, להוסיף 50 µL של מדיום הגידול המכיל chondrocytes ולערבב בעדינות כמתואר בסעיף 3.
  3. העברת µL 500 של הקולגן ינוטרלו אני הפתרון 30-מ מ פטרי צונן עם הוספת זכוכית 10 מ מהתחתון או טוב של צלחת ארבע-. טוב.
    הערה: חשוב לשמור את כל ריאגנטים על קרח כדי למנוע פלמור מהירה, לא אחיד של הקולגן אני.
  4. העבר במהירות את cochleae או utricles כדי לנטרל הקולגן אני הפתרון ולהתאים את האיברים לעמדות הרצוי שלהם עם שיער סטרילי הסכין18 או זוג מלקחיים בסדר.
    הערה: קולגן אני הפילמור הופך להיות מורגש לאחר 1-2 דקות כמו הפתרון הופך עכורים.
  5. לאחר הפתרון סביב הרקמה יש polymerized, למקם את צלחת פטרי או ארבע-ובכן לוח עבור 20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו חמצני כדי להבטיח הפילמור מלאה.
  6. להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת 0.5% סרום שור עוברית (FBS) לכל צלחת פטרי או 500 µL של המדיום אותו לאדם טוב של צלחת ארבע-. טוב. לשמור על התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני. אם רצונך בכך, תוספת מדיום הגידול עם 10 מיקרומטר 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) לסמן תאים מתרבים.
    הערה: ריכוז FBS גבוה יכול לשמש במקרה הצורך.

5. נגיפי זריקות בתרבויות תלת מימדי של שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

  1. מפשירים את הוירוס הרצוי על קרח ומערבבים עם פתרון trypan blue 0.5 mL צינור חרוטי להשגת ריכוז לצבוע הסופי של 0.05%. השתמש 10-20 x צבע כדי למנוע דילול משמעותי של הנגיף. לשמור על הקרח.
    הערה: אדנו אדנו 5 עובד בצורה הטובה ביותר להדביק תאים התומכים ב- utricle19, ואילו וירוס adeno-הקשורים Anc80 יכול להדביק תאים שיער הן ותמיכה התאים את utricle ואת ה שבלול21.
  2. לשבור את קצה מחט זכוכית שהוכנו על פולר micropipette עם מלקחיים נקי בסדר תוך התבוננות על זה ברמת ההגדלה הגבוהה ביותר של המשקפת לנתח מיקרוסקופ.
    הערה: חשוב למטב את הגדרות פולר המחט. מחטים עם שאנקס 9 - 12 מ מ ו- 20 - 30-מיקרומטר פתחים פועלות בצורה הטובה ביותר.
  3. הסר את תרבות איבר החישה של החממה. לצרף את המחט microinjector ולמלא את זה עם 2-3 µL של תערובת לצבוע ווירוסים. תוחבים את המחט לתוך איבר החישה תוך התבוננות על זה תחת התאום לנתח מיקרוסקופ.
  4. לנהוג בעדינות את מחט דרך שכבות mesenchymal ואפיתל של הגג של תרבות utricular תלת מימדי. להזריק את התערובת ויראלי עד החללים של utricle, אמפולות למלא הצבע הכחול.
    הערה: כי זה מאפשר גישה נוחה אל איברי חישה, צלחת פטרי 10 מ מ זכוכית-התחתון היא אופטימלית על הזריקות.
  5. דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני.
    הערה: כאשר חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום נעשה שימוש הבונה ויראלי, ידי קרינה פלואורסצנטית הוא לכאורה 24 שעות לאחר התמרה חושית ויראלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אברי החישה שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים עובריים, תרבותי ב- 40-Pa קולגן אני ג'לים מחקה קשיות נמוכה תנאים עובריים11, שומרים על מבנים תלת מימדיים רגיל יחסית (איור 1) ולשמור על תאים שיער ו תומכים תאים (איור 2 , איור 3). למרות תמיכה תא צפיפות מקטין מעל 30% ( t -test של התלמיד: n = 4, p < 0.004) ומפחית את צפיפות השיער תא ב- 60% ( t -test של התלמיד: n...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

האותות מולקולרית כי הצמיחה התחלקות ובידול באוזן הפנימית במהלך הפיתוח כבר למד בהרחבה5,6,7,8,9,10. עם זאת, ראיות שהושגו ממערכת דגם utricular מרמז כי רמזים מכני, חש דרך צמתי תא והפעלה של היפו איתות, גם לשחק תפקיד חשוב אלה תהליכים2,11, 22

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ג'קובו א ד ר ד ר ג'יי Salvi, א Petelski על תרומתם למחקר המקורי שעליו מבוססת פרוטוקול זה. אנו מודים גם ג'יי לאמות, וו Makmura על גידול בעלי חיים וסיוע טכני. אנו להכיר מענק הכשרה NIDCD T32 DC009975, NIDCD הענק R01DC015530 רוברטסון טיפולית הקרן, הקרן המשפחתית קארוזו למימון. לבסוף, אנו להכיר תמיכה של הווארד יוז במכון הרפואי, אשר ד ר Hudspeth הוא חוקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#10 להבים כירורגייםMiltex4-110
#5 מלקחייםDumont11252-20
צלחת פטרי 100 מ"מSigmaP5856-500EA
250 uL קצות פיפטה פתח גדולUSA Scientific1011-8406
צלחת פטרי תחתונה זכוכית 30 מ"מMatsunami Glass USA CorporationD35-14-1.5-U
4 באר צלחתתרמו פישר סיינטיפיק176740
4-הידרוקסיטאמוקסיפן  סיגמאH7904
60  מ"מ צלחת פטריתרמו פישר סיינטיפיק123TS1
חומצה אצטית Sigma537020
Ad-GFPוקטור Biolabs1060
אנטי-GFP, עוף IgY חלקInvitrogenA10262 
Anti-Myo7AProteus Biosciences25-6790
נוגדן Anti-Sox2 (Y-17)Santa Cruzsc-17320
בדיקת חומצה ביסינצ'וניניתThermo Fisher Scientific23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ערכת הדמיהThermo Fisher ScientificC10340
קולגנאז IGibco17100017
D-גלוקוזסיגמאG8270
DMEM/F12 Gibco11320033
גורם גדילה אפידרמליSigmaE9644
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific16140063
גורם גדילה פיברובלסטיםSigmaF5392
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםמכשיר סאטרP-97
גלוטמיןסיגמאG8540
HBSSGibco14025092
המוציטומטר DaiggerEF16034F
HEPESSigmaH4034
אינסוליןSigmaI3536
מספריים לכריתת אירידקטומיה זפף מכשירים רפואיים08-1201-10   
מיקרו-מזרקNarishigeIM-6
ניקוטינאמידסיגמאN0636
PBS (10X), pH 7.4ג'יבקו70011044
PBS (1X), pH 7.4ג'יבקו10010023
מחוון pH אדום פנול סיגמאP4633 
אתנול טהור, 200 הוכחותDecon Labs 2716
נוגדן RFPChromoTek  5F8
נתרן ביקרבונטSigmaS5761
נתרן הידרוקסידSigmaS8045
נתרן סלניטSigmaS5261
מערבולת שולחן VWR97043-562
טרנספריןסיגמאT8158
טריפאן כחול סיגמאT6146

מקורות

  1. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
  2. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  3. Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
  4. Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
  5. Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
  6. Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418(2016).
  7. Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
  8. Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613(2015).
  9. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  10. White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
  11. Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
  12. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  13. Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
  14. Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
  15. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  16. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  17. Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
  18. Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137(2000).
  19. Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
  20. Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
  21. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  22. Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
  23. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
  24. Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
  25. Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
  26. Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

1
Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.