המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

Manju Sharma; Xiang Zhang; Shouxiong Huang

doi:10.3791/57528

Method Article

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

DOI:

10.3791/57528

⸱

October 29th, 2018

Manju Sharma¹ , Xiang Zhang¹ , Shouxiong Huang¹

¹Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה cytometry זרימה מספקת גישה אידיאלי כדי לזהות את שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של תאים ברמות הפרט והן populational. הפונקציה endocytic שיבשו למצגת אנטיגן השומנים ב החשופים מזהם את האדם תאים דנדריטים הודגם עם transcriptomic בשילוב פרופיל של ביטוי גנים, הפגנה מורפולוגי של חלבון סחר בבני אדם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח populational של שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של חלבונים endocytic הם מאתגרים עקב הדרישה של לכידת תמונה-ניתוח תמונה ברמה וסטטיסטיים תא בודד ברמה populational. כדי להתגבר על הקושי הזה, השתמשנו הדמיה cytometry זרימה, transcriptomic פרופיל (RNA-seq) כדי לקבוע שונה לוקליזציה subcellular של האשכול של בידול 1d חלבון (CD1d) הקשורים עם ביטוי גנים endocytic לקוי-אנוש תאים דנדריטים (Dc), אשר נחשפו המשותף lipophilic אוויר מזהם benzo pyrene [א]. Colocalization של CD1d וחלבונים סמן endocytic Lamp1 מתוך אלפי תמונות תא שנתפסו עם הדמיה cytometry זרימה נותחו באמצעות רעיונות ו- ImageJ-פיג'י תוכניות. תמונות הסלולר רבים עם שותף מוכתם חלבונים CD1d ו Lamp1 היו דמיינו לאחר gating על CD1d⁺Lamp1⁺ DCs באמצעות רעיונות. Colocalization CD1d ו Lamp1 משופרת על BaP חשיפה נוספת הדגימו באמצעות thresholded scatterplots, נבדק עם המקדמים של Mander עבור עוצמת משותפת לשפות אחרות, המותווה מבוסס על האחוז של אזורי משותף לשפות אחרות באמצעות ImageJ-פיג'י. הנתונים שלנו לספק גישה פלייבקים, bioinformatic יתרון למדוד חלבון colocalization ברמות יחיד והן populational הסלולר, תומך תוצאה מליקוי תפקודי של שינוי transcriptomic של האדם חשוף מזהמים בקרי קבוצת מחשבים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטיגן המצגת כוללת בדרך כלל חלבונים תאיים סחר, אשר לעיתים קרובות נחקר באמצעות אפיון מורפולוגי, יצירת פרופילים פנוטיפי של אנטיגן הצגת תאים¹^,²^,³. כדי לשלב את היתרונות של דימות ופעולות phenotyping, נתאר פלטפורמה ניתוח ההדמיה על תא בודד והן רמות האוכלוסיה להפגין colocalization שינו חלבון בתאים דנדריטים אנושי (Dc). במצגת אנטיגן פפטיד, הגדולות histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות לאגד פפטיד קצר (8-10 שאריות) ב רשתית תוך-פלזמית כדי להפעיל CD8 קונבנציונלי⁺ T תאים, בעוד MHC class II מולקולות לאגד ארוך יחסית של פפטיד (שאריות ~ 20) בתאים endocytic להפעלת CD4 ק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים האנושי במחקר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי באוניברסיטת סינסינטי, כל השיטות בוצעו בהתאם ההנחיות הרלוונטיות והתקנות. דגימות דם מתורמים בריאים התקבלו ממרכז דם Hoxworth במרכז הרפואי של אוניברסיטת סינסינטי.

1. Transcriptomic פרופיל החשופים מזהמים בדרור נגזר מונוציט אנושי

סה כ החילוץ-RNA חשוף BaP בדרור
1. להבדיל DCs האנושי באמצעות ציטוקינים GM-CSF ו- IL-4, ולחשוף DCs כדי BaP עבור 4 ימים¹³.
2. למיין החשופים BaP DCs באמצעות cytometry זרימה בהתבסס על הסימנים ביטוי משטח (השושלת^–הלע-DR⁺), ורובם מורכב DCs קונבנציונאלי (CD11c⁺CD1c⁺)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipophilic מזהמים BaP הפיצולים אשכולות גנים endocytic ב DCs נגזר מונוציט DCs. האדם האנושי של כל תורם (n = 3) היו מודגרות עם BaP וממוינות עבור בקרי התחום קונבנציונאלי, אשר שימשו בהמשך RNA החילוץ transcriptomic וניתוח כמתואר . על הנורמליזציה של ביטוי גנים, גנים שונה בין הקבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף היו מקובצים לפי המתאם פונקציונלי של גנים ביטוי באופן שונה. אנחנו קלט את הרשימה ג'ין שינו תוכנית Toppcluster¹⁶ עבור הניתוחים של מסלולים סלולר רלוונטיים ולבצע את הבדיקה ס.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אישור פונקציונלי נתיב הגנים שינו הוא מאתגר, בגלל התבטאות גנים מושפעים נרחב המערבות מספר מסלולים ואת הקושי לשלב בודדים ופעילויות הסלולר populational. אנחנו מועסקים מיכשור הדמיה במיוחד במבחן CD1d סחר בתאים endocytic. הדמיה cytometry זרימה משלבת את המדידה populational של תאים ההפגנה בודדים של colocalization subcellular של מספר חלבונים. מיקרוסקופיה קונפוקלית סיפקה בעבר ברזולוציה גבוהה במדידת חלבון colocalization, cytometry זרימה הוא מסוגל לספק phenotyping מקיף עבור אוכלוסיות תאים שונים. הדמיה cytometry זרימה משלב את היתרונות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים, רוברט Giulitto (Hoxworth דם מרכז) תודה דגימות דם אדם וקורא ד ר Niu ליאנג על נירמול של ביטוי גנים. אנו מודים גם מענק תמיכה מ נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (ES006096), המרכז גנטיקה סביבתיים (CEG) הפרויקט טייס (תרגום), המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI115358) (תרגום), אוניברסיטת פרס המועצה למחקר של אוניברסיטת סינסינטי (תרגום), האוניברסיטה של סינסינטי המכללה של רפואה הליבה שיפור המימון (אקס Z.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
טרנסקריפטומיקה	Illumina	HiSeq 2500 v4	מערכת Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	הדמיה ציטומטריית זרימת
mirVana miRNA ערכת בידוד	תרמו פישר		מיצוי RNA כולל
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		Total RNA QC ניתוח
Veriti 96 בארות מהיר Thermal	Cycler Thermo פישר		PCR, תגובת אנזים
NEBNext Poly(A) mRNA מודול בידוד מגנטי	ניו אינגלנד Biolab		PolyA טיהור RNA
מערכת SMARTer Apollo אוטומטית	טיהור RNA	Takara
ערכת הכנה לספריית RNA NEBNext Ultra RNA ערכת הכנה לספריית Illumina	ניו אינגלנד הכנת	ספריית
Agencourt AMPure XP חרוזים מגנטיים	טיהור DNA בקמן קולטר
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, ניתוח התפלגות גודל
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC, ניתוח התפלגות גודל
QuantStudio 5 מערכת PCR בזמן אמת (Thermo Fisher)	כימות ספריית	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit	England Biolab		Library
cBot	Illumina		ספריית אשכול דור
TruSeq SR אשכול ערכת v3 - cBot – HS	Illumina		ספריית אשכול דור
HiSeq 1000	Illumina		רצף
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 מחזורים)	Illumina		רצף
Phycoerythrin/ציאנין 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
סגול מבריק 421	Bio Legend	L161
PE-אנטי-עכבר IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)

PolyABiolab New

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles