הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57528

⸱

29 באוקטובר 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

במאמר זה

סיכום

הדמיה cytometry זרימה מספקת גישה אידיאלי כדי לזהות את שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של תאים ברמות הפרט והן populational. הפונקציה endocytic שיבשו למצגת אנטיגן השומנים ב החשופים מזהם את האדם תאים דנדריטים הודגם עם transcriptomic בשילוב פרופיל של ביטוי גנים, הפגנה מורפולוגי של חלבון סחר בבני אדם.

תקציר

ניתוח populational של שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של חלבונים endocytic הם מאתגרים עקב הדרישה של לכידת תמונה-ניתוח תמונה ברמה וסטטיסטיים תא בודד ברמה populational. כדי להתגבר על הקושי הזה, השתמשנו הדמיה cytometry זרימה, transcriptomic פרופיל (RNA-seq) כדי לקבוע שונה לוקליזציה subcellular של האשכול של בידול 1d חלבון (CD1d) הקשורים עם ביטוי גנים endocytic לקוי-אנוש תאים דנדריטים (Dc), אשר נחשפו המשותף lipophilic אוויר מזהם benzo pyrene [א]. Colocalization של CD1d וחלבונים סמן endocytic Lamp1 מתוך אלפי תמונות תא שנתפסו עם הדמיה cytometry זרימה נותחו באמצעות רעיונות ו- ImageJ-פיג'י תוכניות. תמונות הסלולר רבים עם שותף מוכתם חלבונים CD1d ו Lamp1 היו דמיינו לאחר gating על CD1d+Lamp1+ DCs באמצעות רעיונות. Colocalization CD1d ו Lamp1 משופרת על BaP חשיפה נוספת הדגימו באמצעות thresholded scatterplots, נבדק עם המקדמים של Mander עבור עוצמת משותפת לשפות אחרות, המותווה מבוסס על האחוז של אזורי משותף לשפות אחרות באמצעות ImageJ-פיג'י. הנתונים שלנו לספק גישה פלייבקים, bioinformatic יתרון למדוד חלבון colocalization ברמות יחיד והן populational הסלולר, תומך תוצאה מליקוי תפקודי של שינוי transcriptomic של האדם חשוף מזהמים בקרי קבוצת מחשבים.

מבוא

אנטיגן המצגת כוללת בדרך כלל חלבונים תאיים סחר, אשר לעיתים קרובות נחקר באמצעות אפיון מורפולוגי, יצירת פרופילים פנוטיפי של אנטיגן הצגת תאים1,2,3 . כדי לשלב את היתרונות של דימות ופעולות phenotyping, נתאר פלטפורמה ניתוח ההדמיה על תא בודד והן רמות האוכלוסיה להפגין colocalization שינו חלבון בתאים דנדריטים אנושי (Dc). במצגת אנטיגן פפטיד, הגדולות histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות לאגד פפטיד קצר (8-10 שאריות) ב רשתית תוך-פלזמית כדי להפעיל CD8 קונבנציונלי+ T תאים, בעוד MHC class II מולקולות לאגד ארוך יחסית של פפטיד (שאריות ~ 20) בתאים endocytic להפעלת CD4 קונבנציונלי+ T תאים1,4. לעומת זאת, תאי T ספציפי השומנים מופעלים על ידי CD1 חלבונים עם אנטיגנים השומנים נטען בעיקר בתוך תאי endocytic5,6. מצגת אנטיגן השומנים דורש את האספקה של השומנים המטבוליטים המיוצר השומנים חילוף החומרים7,8,9,10 ו הטעינה של השומנים פונקציונלי מטבוליטים CD1 חלבונים ב- תאים endocytic5,6. בהקשר זה, גורמים שונים הסלולר להתכוונן המצגת אנטיגן השומנים, במיוחד, החשיפה הסביבתית של מזהמים lipophilic, כשל חיסוני, הם קריטיים כדי להיות מוגדר. במחקר זה, השתמשנו transcriptomic ניתוח תמונת פרופיל, תאית populational הדמיה וניתוח של האדם נגזר מונוציט DCs לקביעת חלבון endocytic הסחר תורם למצגת אנטיגן השומנים בחשיפה מזהמים. בהחלט, ניתן להחיל פלטפורמה משולבת זו ללמוד חלבון subcellular סחר, colocalization בתהליכים ביולוגיים שונים.

טכנית, לוקליזציה חלבון subcellular הודגם בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתח סטטיסטית במספר מוגבל של תאים שזוהו1,2,3,11. יתר על כן, cytometry זרימה בהרחבה הוחלה על שער תא אוכלוסיות עם אותות מוכתם משותפת של מספר חלבונים הסלולר ברמה12; עם זאת, זה חסרה ויזואליזציה מפורטת של חלבון subcellular colocalization. כדי להשיג ניתוחים סטטיסטיים ומקיף של אחוז חלבון colocalization ברמות הסלולר והן באוכלוסייה, אנו משלבים את הדמיה תיעוד וניתוח גישות כדי לקבוע את התכונות של חלבון colocalization עם ביולוגית רלוונטיות. באופן ספציפי, אנו משתמשים מיכשור הדמיה כדי לזהות את colocalization של CD1d ו חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (Lamp1) חלבונים במחקר זה. ניתוח כמותי של מולקולות colocalized היה בעבר קשה לביצוע בקנה מידה populational. במחקר זה, שינינו את התוכנית ImageJ-פיג'י לבחון את אחוז חלבון colocalization עם מספר גדול של תאים שותף מוכתם ברמה התאית הן populational והן בודדים. באופן ספציפי, מדדנו אזורי משותף לשפות אחרות, העוצמה וגודל populational כדי לתמוך במסקנה כי החלבון CD1d נשמר בעיקר בתאים endocytic מאוחר של בקרי תחום אנושי חשיפה benzo מזהם lipophilic [א] pyrene (BaP)13 . זה המשולבים סלולארי והאוכלוסיה הדמיה ניתוח סיפק תוצאות מאוד לשחזור מקיף, סטטיסטית CD1d-Lamp1 colocalization הרלוונטי למצגת אנטיגן השומנים עכבות.

Transcriptome החשופים BaP בדרור האנושי נתמך בחוזקה את ההשערה כי endocytic מטבולי וסחר CD1d endocytic היו ליקויי BaP בחשיפה. כדי לבדוק השערה זו, אנחנו מוחלים מיכשור הדמיה לפרופיל תמונות מאוכלוסיית DC משותפת היו מוכתמים חלבונים מרובים כולל CD1d endocytic סמנים, סמנים DC. לבסוף, תאים שותף מוכתם נותחו סטטיסטית כדי להדגים את האחוז של עוצמת ותחומי CD1d ו Lamp1 colocalization.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולים האנושי במחקר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי באוניברסיטת סינסינטי, כל השיטות בוצעו בהתאם ההנחיות הרלוונטיות והתקנות. דגימות דם מתורמים בריאים התקבלו ממרכז דם Hoxworth במרכז הרפואי של אוניברסיטת סינסינטי.

1. Transcriptomic פרופיל החשופים מזהמים בדרור נגזר מונוציט אנושי

  1. סה כ החילוץ-RNA חשוף BaP בדרור
    1. להבדיל DCs האנושי באמצעות ציטוקינים GM-CSF ו- IL-4, ולחשוף DCs כדי BaP עבור 4 ימים13.
    2. למיין החשופים BaP DCs באמצעות cytometry זרימה בהתבסס על הסימנים ביטוי משטח (השושלת–הלע-DR+), ורובם מורכב DCs קונבנציונאלי (CD11c+CD1c+)13. בדרך כלל, למיין 10,000 DCs לתוך תרבות בינוני המכיל 10% FBS, צנטריפוגה DCs-600 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, להסיר לאלתר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל.
    3. ברגע תגובת שיקוע יוסר על ידי השאיפה, lyse בגדר תא על-ידי הוספת 0.4 מ של מאגר פירוק/איגוד הערכה בידוד RNA עבור אחסון ב- 80 ° C לפני החילוץ-RNA.
    4. להשתמש בערכה בידוד RNA עם פרוטוקול הכולל של מיצוי RNA כדי לחלץ את ה-RNA הכולל14. למדוד את תקינות RNA באמצעות Bioanalyzer15.
  2. ניתוח Transcriptomic של מיון בקרי קבוצת מחשבים (איור 1 א')
    1. להכין ספריית ה-RNA-seq באמצעות ערכת הכנה ספריית ה-RNA. בקיצור, קטע את הרנ א לבודד poly-A (~ 200 bp), להפוך לתעתק את השברים לחוף הראשון של cDNA ופעל על-ידי הסינתזה cDNA סטרנד השני המסומנת dUTP.
    2. מאתרים ומפסיקים גדיל כפול cDNA למתאם עם מבנה גזע לופ לאחר טיהור חרוז, תיקון סוף ו dA-עוקב. לסלק את שאריות אורציל סטרנד השנייה של הלולאה cDNA ומתאם עם אנזים המשתמש (ריאגנט כריתה ספציפיים אורציל) כדי לשמור על ירידה לפרטים סטרנד ולפתוח הלולאה מתאם עבור ה-PCR.
      1. לבצע 13 מחזורים של ה-PCR באמצעות תחל ואוניברסלי אינדקס ספציפיות כדי להעשיר את ספריית באינדקס. לנקות את הספריה ולהפעיל על שבב רגישות גבוהה של ה-DNA Bioanalyzer לבדוק את איכות ספריה, גודל הפצה.
    3. השתמש ערכת כימות ספריה, מערכת ה-PCR בזמן אמת בשילוב עם מידע על גודל הספרייה לחישוב ספריית הריכוז באמצעות שיטה עיקול רגיל.
    4. באופן פרופורציונלי מאגר ספריות תואם באינדקס בנפרד ולהתאים את הריכוז הסופי 15 pM. לבצע ספריית אשכול הדור, רצף הספרייה בקביעה של קריאה יחיד 1 x 50 bp כדי להפיק ~ 25 מיליון קריאות עבור דגימה.
  3. רצף
    1. לטעון את הרצף ואינדקס ריאגנטים המדפים ריאגנט SBS ו- PE, בהתאמה. מקם את ריאגנטים באמבט מים מעבדה-ציונים עבור 1 h עד כל הקרח נמס, ריאגנטים כל הבקבוק/צינור מעורבבים כראוי.
    2. מכינים את תערובת ICB על-ידי הוספת האנזים צבע ו-20 ° C המופשרים הבקבוק ומערבבים. להכין פתרון NaOH בהתאם להוראות רצף. מקם כל ריאגנטים ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
    3. במהלך האחד עשר זמן המתנה, כוח על הרצפים (sequencer). המתן הכונן DONOTEJECT מופיעים ולחבר את המחשב בכונן רשת.
    4. הפעל את תוכנת שליטה הרצפים (sequencer).
    5. להכין 2 ל' של פתרון תחזוקה שטיפת המכילה 0.5% Tween 20 ל- 0.03% ProClin 300 כיתה מעבדה בתוך המים.
    6. בארון ריאגנט SBS, להוסיף ~ 100 מ"ל של תחזוקה שטיפת פתרון אחד של שמיניית, וכן משפך מזרקי אל הבקבוקים. בארון ריאגנט PE, להוסיף ~ 12 מ ל תחזוקה שטיפת פתרון לכל אחד הצינורות חרוט 10 15 מ"ל, למחוק את הפקקים.
    7. טען השני ארונות עם הפתרון מילוי בקבוקים/צינורות כדי הרצפים (sequencer).
    8. תוכנת שליטה של הרצפים (sequencer), בחרו בכביסה תחזוקה; בצע את ההוראות שעל המסך כדי שתנקה את המערכת נוזל הרצפים (sequencer) עד להשלמת התהליך.
    9. להתחיל לרוץ חדש בכרטיסיה "רצף" מתוך התוכנה; כוונו את נתוני הפלט לכונן רשת. לבחור פרמטרים עבור קריאה יחיד 1 x 50 bp עם ספריות אינדקס אחד מרובב.
    10. באופן אופציונלי, להיכנס לתוך הרכזת רצף BaseSpace כך מצב הרצף ניתן לנטר מרחוק באמצעות מחשב או טלפון חכם.
    11. העלה גיליון לדוגמה עבור demultiplexing, לספק מידע ריאגנט לפי הדרישה תוכנה.
    12. לטעון ריאגנטים SBS ו- PE הרצפים (sequencer). ראש המערכת עם תא זרימה בשימוש (~ 15 דקות).
    13. לאחר השלמת הדור אשכול (h. ~4.5), להוציא את התא זרימה, בקלילות לרסס את התא זרימה עם מים, תנגבי אןתן שימוש בנייר העדשה. בקלילות לרסס את התא זרימה עם 95% אתנול, נגב את זה יבש. בדוק נגד אור כדי לוודא כי השטח נקי ללא פסולת או שאריות של מלח.
    14. לאחר השלמת השלב ראש הממשלה, לטעון את התא זרימה באשכולות ולהתחיל את הרצף. התוכנה מציג ניתוח רצף אוטומטי יופעל.
    15. לפקח על איכות הנתונים רצף דרך סאב כולל צפיפות אשכול, קריאות מסנן, אשכול עוברים סינון %, % ≥Q30, המורשת שלב/prophase %, יצירת האינדקסים QC, וכו שזה עוזר להבין את איכות הנתונים וכיצד לפתור בעיות.
    16. לשנות את האטם תא זרימה ולבצע שטיפה תחזוקה לאחר השלמת הרצף. הרצפים (sequencer) מוכן למיתקפה הבאה.
  4. ניתוח Bioinformatic
    1. לבצע ביואינפורמטיקה RNA-seq נתונים ניתוח13.

2. מסלול ניתוח של פרופילים Transcriptomic (איור 1B)

  1. השתמש edgeR של Bioconductor כדי להשוות בין תוצאות ג'ין ביטוי בעוצמה ספירות בין בקרי התחום החשופים BaP, שאינו חשוף מתורמים שלוש. לאחר מכן, לזהות גנים ביטוי באופן שונה בין DCs החשופים BaP, שאינו חשוף בהתבסס על השינוי המוחלט קיפול (> 2 קיפולים) גילוי שקר לדרג ערכים (פד) - מנוכי עונתיות p-(< 0.05).
  2. כדי לחזות אשכולות פונקציונלי באופן שונה הביע גנים, להשתמש בחבילת תוכנה ToppCluster חפש את הגנים שינו מול מספר מסדי נתונים כולל קג REACTOME ועד להפקת נתוני האשכולות. ToppCluster משתמשת הבדיקה ההיפר-גיאומטרית כדי לקבל העשרה תפקודית באמצעות ניתוח16העשרה רשימת גנים.
  3. בהמשך קלט את התוצאות של אלה אשכולות פונקציה Cytoscape17,18 גרסה 3.3.0, פלטפורמת תוכנה קוד פתוח באופן כללי משמש להמחשת רשתות מורכבות. לפיכך, הגנים המעורבים אשכולות שונים או מסלולים, כולל אשכולות endocytic מטבולי, מוצגים ברשת עם ביאור צבע של השינוי קיפול בממוצע של ג'ין ביטוי (איור 1B)13.

3. הדמיה Cytometry זרימה של CD1d ו Lamp1 Colocalization

  1. נוגדן תיוג החשופים BaP בדרור
    1. וחושפים 0.5 x 10 DCs האנושי6 מ"מ 5.94 BaP עבור 4 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 2 מיליליטר של Dulbecco מלאה בינוני ששינה רשנה. הקציר בקרי קבוצת מחשבים על ידי צנטריפוגה-400 g x עבור 10 דקות לחסום בקרי התחום הבדיל מאת המקננת תאים עם חוסם בנסיוב אדם, אדם אנטי Fc קולטן נוגדנים במשך 10 דקות בקרח, כולל נוגדנים נגד CD16, CD32 ו- CD64.
    2. דגירה סגול מבריק 421-נגד-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine לצבוע הלע (PE/Cy7) - נגד - 7-ד ר ו PE/Cy5-נגד-CD11c עם בקרי קבוצת מחשבים עבור 20 דקות בקרח. טבלה 1 מציגה רשימה זו של נוגדנים.
    3. לתקן DCs עם 4% paraformaldehyde ב- PBS, permeabilize אותם עם מאגר לשטוף Permeabilization. לבצע ההכתמה תאיים עם תערובת של התווית על-ידי PE מטוהרים נגד האדם CD1d (51.1), התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 647 אנטי-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
  2. הדמיה מדידה cytometry זרימה (איור 2)
    1. לנתח את הדגימות מוכתם באמצעות cytometer הדמיה של זרימה בתוך ליבת cytometry זרימה של בית החולים לילדים בסינסינטי באמצעות מטרה X 40 להניב 300 פיקסלים עבור תא עם בסביבות 10 מ מ קוטר. גודל פיקסל אחד הוא כ- 0.5 מ מ- 0.5 מ מ של האובייקט.
    2. רוכשים 10,000 תמונות סלולארית בצורה בלתי לא משוחדת על פי הוראות היצרן.

4. הדמיה ניתוחים של תמונות Cytometry זרימה

  1. Colocalization ניתוח באמצעות רעיונות תוכנה (איור 2)
    1. לבצע פיצוי יחיד שהוכתמו לעומת דגימות שאינו מוכתם על-ידי הגדרת עוצמת קרינה פלואורסצנטית שאינו מוכתם דוגמאות מתחת לסף, כולל שהוכתמו שאינם חשופים BaP DCs עם autofluorescence BaP, כמו נתונים cytometry זרימה שוטפת ניתוח.
    2. שער צבעונית תאים כדי להשיג את קבוצות משנה של ד ר+CD11c הלע+CD1d+Lamp1+ (איור 2 א) והתאים הצג תמונות הסלולר תת-קבוצות מגודרת (איור 2B).
    3. שמור תמונות תא בתבנית png המבוסס על שני קריטריונים טכניים הכללה, נוכחות חזותית של אותות מוכתם משותפת חזקה ולוקליזציה subcellular של חלבונים CD1d ו Lamp1, עבור הניתוחים colocalization באמצעות ImageJ-פיג'י (איור 2B).
  2. השתמש בתוכנת ImageJ-פיג'י לבצע ניתוח colocalization (איור 3).
    1. להכין את קובצי התמונה קלט על-ידי מיזוג תמונות שנשמרו תא 100 עבור שאינו חשוף ונחשף BaP DCs אנושי, בהתאמה (איור 3 א).
    2. לנתח CD1d (אדום), Lamp1 (ירוק) colocalization משתמש של scatterplot.
      1. הפעל תוכנית ImageJ-פיג'י. פתח את קובץ png עם 100 תמונות תא (3B איור , איור 4A): "קובץ | פתח'.
      2. לפצל את התמונה עם ערוצי אדום וירוק הממוזג שתי תמונות עם ערוץ ירוק או אדום: "תמונה | צבע | לפצל ערוצים".
      3. לצייר את scatterplot באמצעות הפקודות "נתח | Colocalization | סף colocalization". שמור את scatterplot באמצעות המפתח "PrintScreen" .
    3. חישוב מקדמי colocalization של Mander עבור כל תמונה סלולרית יחיד (n = 100) (איור 4B)
      1. בחר תמונה תא בודד על קובץ התמונה עם פצל ערוצים באמצעות "אובל" הכלי בחירה.
      2. השתמש בפקודות "נתח | Colocalization | סף colocalization". בחר "ערוץ 1" תיבת דיאלוג של אזור בעל עניין (ROI). לשמור על כל האופציות חישוב כולל "של Mander באמצעות ספי" עבור כל תמונה התא.
      3. חזור על חישוב זה עבור כל תא 100 תמונות.
      4. לשמור ולפתוח את התוצאות באמצעות גיליון אלקטרוני.
      5. להתוות את הממוצע ואת תקן שגיאות עבור "מקדמי של Mander thresholded" (n = 100, 0 מציין colocalization אין ו- 1 אומר colocalization מושלם). השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לחשב את ערך p עבור ההשוואה בין הקבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף (איור 4B).
    4. לחשב את האחוזים של עוצמת פיקסל thresholded משותפת לשפות אחרות בין CD1d ו Lamp1 לתמונות תאים מרובים (n = 100) (איור 4C).
      1. להשתמש באותו פרוטוקול ניתוח 4.2.3 ובחר בנוסף אפשרות התוצאה "עוצמת % מעל הסף colocalized".
      2. לבצע ניתוח זה יחד עם המקדמים של colocalization של Mander.
      3. בדומה לכך להתוות את הממוצע ואת תקן שגיאות עבור עוצמת % colocalized בין CD1d ו Lamp1. השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לחשב את ערך p להשוואה בין קבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף (איור 4C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Lipophilic מזהמים BaP הפיצולים אשכולות גנים endocytic ב DCs נגזר מונוציט DCs. האדם האנושי של כל תורם (n = 3) היו מודגרות עם BaP וממוינות עבור בקרי התחום קונבנציונאלי, אשר שימשו בהמשך RNA החילוץ transcriptomic וניתוח כמתואר . על הנורמליזציה של ביטוי גנים, גנים שונה בין הקבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף היו מקובצים לפי המתאם פונקציונלי של גנים ביטוי באופן שונה. אנחנו קלט את הרשימה ג'ין שינו תוכנית Toppcluster16 עבור הניתוחים של מסלולים סלולר רלוונטיים ולבצע את הבדיקה ס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אישור פונקציונלי נתיב הגנים שינו הוא מאתגר, בגלל התבטאות גנים מושפעים נרחב המערבות מספר מסלולים ואת הקושי לשלב בודדים ופעילויות הסלולר populational. אנחנו מועסקים מיכשור הדמיה במיוחד במבחן CD1d סחר בתאים endocytic. הדמיה cytometry זרימה משלבת את המדידה populational של תאים ההפגנה בודדים של colocalization subcellular של מספר חלבונים. מיקרוסקופיה קונפוקלית סיפקה בעבר ברזולוציה גבוהה במדידת חלבון colocalization, cytometry זרימה הוא מסוגל לספק phenotyping מקיף עבור אוכלוסיות תאים שונים. הדמיה cytometry זרימה משלב את היתרונות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

המחברים, רוברט Giulitto (Hoxworth דם מרכז) תודה דגימות דם אדם וקורא ד ר Niu ליאנג על נירמול של ביטוי גנים. אנו מודים גם מענק תמיכה מ נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (ES006096), המרכז גנטיקה סביבתיים (CEG) הפרויקט טייס (תרגום), המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI115358) (תרגום), אוניברסיטת פרס המועצה למחקר של אוניברסיטת סינסינטי (תרגום), האוניברסיטה של סינסינטי המכללה של רפואה הליבה שיפור המימון (אקס Z.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טרנסקריפטומיקהIlluminaHiSeq 2500 v4מערכת Illumina HiSeq
ImagingStream XMillipore100220הדמיה ציטומטריית זרימת
mirVana miRNA ערכת בידודתרמו פישרמיצוי RNA כולל
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilentTotal RNA QC ניתוח
Veriti 96 בארות מהיר ThermalCycler Thermo פישרPCR, תגובת אנזים
NEBNext Poly(A) mRNA מודול בידוד מגנטי ניו אינגלנד BiolabPolyA טיהור RNA
מערכת SMARTer Apollo אוטומטיתטיהור RNATakara
ערכת הכנה לספריית RNA NEBNext Ultra RNA ערכת הכנה לספריית Illuminaניו אינגלנד הכנתספריית
Agencourt AMPure XP חרוזים מגנטייםטיהור DNA בקמן קולטר 
2100 BioanalyzerAgilentLibrary QC, ניתוח התפלגות גודל
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilentLibrary QC, ניתוח התפלגות גודל
QuantStudio 5 מערכת PCR בזמן אמת (Thermo Fisher)כימות ספרייתThermo Fisher
NEBNext Library Quant KitEngland BiolabLibrary
cBotIlluminaספריית אשכול דור
TruSeq SR אשכול ערכת v3 - cBot – HSIlluminaספריית אשכול דור
HiSeq 1000Illuminaרצף
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 מחזורים)Illuminaרצף
Phycoerythrin/ציאנין 7 (PE/Cy7)Bio LegendL243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)Bio Legend3.9
סגול מבריק 421Bio LegendL161
PE-אנטי-עכבר IgG2bBio Legend51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)Bio LegendCD107a(H4A3)
PolyABiolab New

מקורות

  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
  3. Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
  4. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
  5. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  6. Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
  7. Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325(2009).
  8. Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
  9. Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
  10. de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
  11. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
  12. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  13. Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085(2017).
  14. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  15. Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
  16. Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
  17. Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
  18. Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
  19. Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
  20. Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594(2016).
  21. Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
  24. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  25. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
  26. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קו-לוקליזציה של חלבוני אנדוציטוזהחשיפה לבנזו[a]פירןתאי דנדריטיים אנושייםאנליזה של מקדם מנדרסריצוף RNAImageJ Fijiתוכנת IDEAS
המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.